THE SELECTION OF OPTIMAL pegRNAs TO ENHANCE THE EFFICIENCY OF PRIME EDITING IN AT-RICH GENOME REGIONS

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Prime editing is a highly promising strategy for treating hereditary disorders due to its superior efficiency and safety profile compared to conventional CRISPR-Cas9 systems. This study is dedicated to development of a causal therapy for cystic fibrosis by targeting the F508del variant in the CFTR gene using prime editing, as this specific deletion accounts for a substantial proportion of cystic fibrosis cases. While prime editing has shown remarkable precision in introducing targeted genetic modifications, its application in AT-rich genomic regions, such as the one containing the F508del variant, remains challenging. To overcome this limitation, we systematically evaluated 24 pegRNAs designed for two distinct prime editing systems, PEmax and PE2-NG. The correction efficiency of the F508del variant reached 2.81% in basal lung cells from homozygous F508del patients, without normalization for transfection efficiency. However, the average transfection efficiency was only 11.9%, emphasizing the critical need for advancements in delivery methodologies. These findings highlight the potential of prime editing as a therapeutic approach for cystic fibrosis, while also underscoring the necessity for further optimization of both editing constructs and delivery vectors to achieve clinically relevant correction levels.

About the authors

O. V. Volodina

Research Centre for Medical Genetics

Email: volodold@gmail.com
Moscow, Russia

A. G. Demchenko

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

A. A. Anuchina

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

O. P. Ryzhkova

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

V. A. Kovalskaya

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

E. V. Kondrateva

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

V. Y. Tabakov

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

A. V. Lavrov

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

S. A. Smirnikhina

Research Centre for Medical Genetics

Moscow, Russia

References

  1. Xiao-Jie, L., Hui-Ying, X., Zun-Ping, K., Jin-Lian, C., and Li-Juan, J. (2015) CRISPR-Cas9: a new and promising player in gene therapy, J. Med. Genet., 52, 289-296, https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2014-102968.
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., and Barbas, C. F. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering, Trends Biotechnol., 31, 397-405, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2013.04.004.
  3. Tröder, S. E., and Zevnik, B. (2022) History of genome editing: from meganucleases to CRISPR, Lab. Anim., 56, 60-68, https://doi.org/10.1177/0023677221994613.
  4. Uddin, F., Rudin, C. M., and Sen, T. (2020) CRISPR gene therapy: applications, limitations, and implications for the future, Front. Oncol., 10, 1387, https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01387.
  5. Kantor, A., McClements, M. E., and MacLaren, R. E. (2020) CRISPR-Cas9 DNA base-editing and prime-editing, Int. J. Mol. Sci., 21, 6240, https://doi.org/10.3390/ijms21176240.
  6. Lee, J., Lim, K., Kim, A., Mok, Y. G., Chung, E., Cho, S.-I., Lee, J. M., and Kim, J.-S. (2023) Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels, Nat. Commun., 14, 1786, https://doi.org/10.1038/s41467023-37507-8.
  7. Chow, R. D., Chen, J. S., Shen, J., and Chen, S. (2021) A web tool for the design of prime-editing guide RNAs, Nat. Biomed. Eng., 5, 190-194, https://doi.org/10.1038/s41551-020-00622-8.
  8. Hwang, G.-H., Jeong, Y. K., Habib, O., Hong, S.-A., Lim, K., Kim, J.-S., and Bae, S (2021) PE-Designer and PE-Analyzer: web-based design and analysis tools for CRISPR prime editing, Nucleic Acids Res., 49, W499-W504, https://doi.org/10.1093/nar/gkab319.
  9. Nelson, J. W., Randolph, P. B., Shen, S. P., Everette, K. A., Chen, P. J., Anzalone, A. V., An, M., Newby, G. A., Chen, J. C., Hsu, A., and Liu, D. R. (2022) Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency, Nat. Biotechnol., 40, 402-410, https://doi.org/10.1038/s41587-021-01039-7.
  10. Kiseleva, A., Klimushina, M., Sotnikova, E., Skirko, O., Divashuk, M., Kurilova, O., Ershova, A., Khlebus, E., Zharikova, A., Efimova, I., Pokrovskaya, M., Slominsky, P. A., Shalnova, S., Meshkov, A., and Drapkina, O. (2020) Cystic fibrosis polymorphic variants in a Russian population, Pharmgenomics Pers. Med., 13, 679-686, https://doi.org/10.2147/PGPM.S278806.
  11. Scotet, V., L’Hostis, C., and Férec, C. (2020) The changing epidemiology of cystic fibrosis: incidence, survival and impact of the CFTR gene discovery, Genes (Basel), 11, 589, https://doi.org/10.3390/genes11060589.
  12. Bobadilla, J. L., Macek, M., Fine, J. P., and Farrell, P. M. (2002) Cystic fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations - correlation with incidence data and application to screening, Hum. Mutat., 19, 575-606, https://doi.org/10.1002/humu.10041.
  13. Регистр больных муковисцидозом в России, URL: https://mukoviscidoz.org/mukovistsidoz-v-rossii.html.
  14. De Boeck, K. (2020) Cystic fibrosis in the year 2020: a disease with a new face, Acta Paediatr., 109, 893-899, https://doi.org/10.1111/apa.15155.
  15. McKone, E. F., Ariti, C., Jackson, A., Zolin, A., Carr, S. B., Orenti, A., van Rens, J. G., Lemonnier, L., Macek, M., Keogh, R. H., Naehrlich, L., and European Cystic Fibrosis Society Patient Registry (2021) Survival estimates in European cystic fibrosis patients and the impact of socioeconomic factors: a retrospective registry cohort study, Eur. Respir. J., 58, 2002288, https://doi.org/10.1183/13993003.02288-2020.
  16. Амелина Е. Л., Черняк А. В., Черняев А. Л. (2001) Муковисцидоз: определение продолжительности жизни, Пульмонология, 61-64.
  17. Spoletini, G., Gillgrass, L., Pollard, K., Shaw, N., Williams, E., Etherington, C., Clifton, I. J., and Peckham, D. G. (2022) Dose adjustments of Elexacaftor/Tezacaftor/Ivacaftor in response to mental health side effects in adults with cystic fibrosis, J. Cyst. Fibros., 21, 1061-1065, https://doi.org/10.1016/j.jcf.2022.05.001.
  18. Papadakis, L., Stander, T., Mombourquette, J., Richards, C. J., Yonker, L. M., Lawton, B., Hardcastle, M., Zweifach, J., Sicilian, L., Bringhurst, L., and Neuringer, I. P. (2025) Heterogeneity in reported side effects following initiation of elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor: experiences at a quaternary CF care center, Pediatr. Pulmonol., 60, e27382, https://doi.org/10.1002/ppul.27382.
  19. Safety and Possible Side Effects|TRIKAFTA® (elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor and ivacaftor), URL: https://www.trikafta.com/safety-side-effects.
  20. Kondrateva, E., Adilgereeva, E., Amelina, E., Tabakov, V., Demchenko, A., Ustinov, K., Yasinovsky, M., Voronina, E., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2020) Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation, Stem Cell Res., 48, 101933, https://doi.org/10.1016/j.scr.2020.101933.
  21. Kondrateva, E., Demchenko, A., Slesarenko, Y., Yasinovsky, M., Amelina, E., Tabakov, V., Voronina, E., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2021) Derivation of iPSC line (RCMGi002-A) from dermal fibroblasts of a cystic fibrosis female patient with homozygous F508del mutation, Stem Cell Res., 53, 102251, https://doi.org/10.1016/j.scr.2021.102251.
  22. Demchenko, A., Belova, L., Balyasin, M., Kochergin-Nikitsky, K., Kondrateva, E., Voronina, E., Pozhitnova, V., Tabakov, V., Salikhova, D., Bukharova, T., Goldshtein, D., Kondratyeva, E., Kyian, T., Amelina, E., Zubkova, O., Popova, O., Ozharovskaia, T., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2024) Airway basal cells from human-induced pluripotent stem cells: a new frontier in cystic fibrosis research, Front. Cell. Dev. Biol., 12, 1336392, https://doi.org/10.3389/fcell.2024.1336392.
  23. Chen, P. J., Hussmann, J. A., Yan, J., Knipping, F., Ravisankar, P., Chen, P.-F., Chen, C., Nelson, J. W., Newby, G. A., Sahin, M., Osborn, M. J., Weissman, J. S., Adamson, B., and Liu, D. R. (2021) Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes, Cell, 184, 5635-5652.e29, https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.018.
  24. Kweon, J., Yoon, J.-K., Jang, A.-H., Shin, H. R., See, J.-E., Jang, G., Kim, J.-I., and Kim, Y. (2021) Engineered prime editors with PAM flexibility, Mol. Ther., 29, 2001-2007, https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.02.022.
  25. Clement, K., Rees, H., Canver, M. C., Gehrke, J. M., Farouni, R., Hsu, J. Y., Cole, M. A., Liu, D. R., Joung, J. K., Bauer, D. E., and Pinello, L. (2019) CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis, Nat. Biotechnol., 37, 224-226, https://doi.org/10.1038/s41587-019-0032-3.
  26. Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., Chen, P. J., Wilson, C., Newby, G. A., Raguram, A., and Liu, D. R. (2019) Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, 576, 149-157, https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4.
  27. Kim, D. Y., Moon, S. B., Ko, J.-H., Kim, Y.-S., and Kim, D. (2020) Unbiased investigation of specificities of prime editing systems in human cells, Nucleic Acids Res., 48, 10576-10589, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa764.
  28. Fajrial, A. K., He, Q. Q., Wirusanti, N. I., Slansky, J. E., and Ding, X. (2020) A review of emerging physical transfection methods for CRISPR/Cas9-mediated gene editing, Theranostics, 10, 5532-5549, https://doi.org/10.7150/thno.43465.
  29. Johnson, L. G., Olsen, J. C., Sarkadi, B., Moore, K. L., Swanstrom, R., and Boucher, R. C. (1992) Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis, Nat. Genet., 2, 21-25, https://doi.org/10.1038/ng0992-21.
  30. Ribeiro, S., Mairhofer, J., Madeira, C., Diogo, M. M., Lobato da Silva, C., Monteiro, G., Grabherr, R., and Cabral, J. M. (2012) Plasmid DNA size does affect nonviral gene delivery efficiency in stem cells, Cell Reprogram., 14, 130-137, https://doi.org/10.1089/cell.2011.0093.
  31. Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M., and Danielsen, M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417.
  32. Bulcaen, M., Kortleven, P., Liu, R. B., Maule, G., Dreano, E., Kelly, M., Ensinck, M. M., Thierie, S., Smits, M., Ciciani, M., Hatton, A., Chevalier, B., Ramalho, A. S., Casadevall I Solvas, X., Debyser, Z., Vermeulen, F., Gijsbers, R., Sermet-Gaudelus, I., Cereseto, A., and Carlon, M. S. (2024) Prime editing functionally corrects cystic fibrosiscausing CFTR mutations in human organoids and airway epithelial cells, Cell Rep. Med., 5, 101544, https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101544.
  33. Li, C., Liu, Z., Anderson, J., Liu, Z., Tang, L., Li, Y., Peng, N., Chen, J., Liu, X., Fu, L., Townes, T. M., Rowe, S. M., Bedwell, D. M., Guimbellot, J., and Zhao, R. (2023) Prime editing-mediated correction of the CFTR W1282X mutation in iPSCs and derived airway epithelial cells, PLoS One, 18, e0295009, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0295009.
  34. Sousa, A. A., Hemez, C., Lei, L., Traore, S., Kulhankova, K., Newby, G. A., Doman, J. L., Oye, K., Pandey, S., Karp, P. H., McCray, P. B., and Liu, D. R. (2025) Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells, Nat. Biomed. Eng., 9, 7-21, https://doi.org/10.1038/s41551-024-01233-3.
  35. Averina, O. A., Permyakov, O. A., Grigorieva, O. O., Starshin, A. S., Mazur, A. M., Prokhortchouk, E. B., Dontsova, O. A., and Sergiev, P. V. (2021) Comparative analysis of genome editors efficiency on a model of mice zygotes microinjection, Int. J. Mol. Sci., 22, 10221, https://doi.org/10.3390/ijms221910221.
  36. Bassai, L., Shigunov, P., and Soares, L. (2021) Correction of the mutation cause of cystic fibrosis (F508DEL) in pulmonary epithelius line cells BY CRISPR/CAS9, Cytotherapy, 23, 8, https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2021.02.028.
  37. Smirnikhina, S. A., Kondrateva, E. V., Adilgereeva, E. P., Anuchina, A. A., Zaynitdinova, M. I., Slesarenko, Y. S., Ershova, A. S., Ustinov, K. D., Yasinovsky, M. I., Amelina, E. L., Voronina, E. S., Yakushina, V. D., Tabakov, V. Y., and Lavrov, A. V. (2020) P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients, PLoS One, 15, e0242094, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242094.
  38. Graham, C., and Hart, S. (2021) CRISPR/Cas9 gene editing therapies for cystic fibrosis, Expert Opin. Biol. Ther., 21, 767-780, https://doi.org/10.1080/14712598.2021.1869208.
  39. Pfeiffer, F., Gröber, C., Blank, M., Händler, K., Beyer, M., Schultze, J. L., and Mayer, G. (2018) Systematic evaluation of error rates and causes in short samples in next-generation sequencing, Sci. Rep., 8, 10950, https://doi.org/10.1038/s41598-018-29325-6.
  40. Ma, X., Shao, Y., Tian, L., Flasch, D. A., Mulder, H. L., Edmonson, M. N., Liu, Y., Chen, X., Newman, S., Nakitandwe, J., Li, Y., Li, B., Shen, S., Wang, Z., Shurtleff, S., Robison, L. L., Levy, S., Easton, J., and Zhang, J. (2019) Analysis of error profiles in deep next-generation sequencing data, Genome Biol., 20, 50, https://doi.org/10.1186/s13059-019-1659-6.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».