Characterization of carbohydrate specificity of monoclonal antibodies to fungal antigenic markers using biotinylated oligosaccharides as coating antigens

Full Text

Принятые сокращения: ИК – инвазивный кандидоз; ПАА – полиакриламид; ФСБ – фосфатно-солевой буфер; KLH – гемоцианин Megathura crenulata.

ВВЕДЕНИЕ

Инвазивные микозы представляют собой серьёзную угрозу для здоровья населения, особенно для людей с ослабленным иммунитетом [1]. Распространённость этих инфекций значительно возросла в последние десятилетия. Согласно статистическим данным, которые получены в самое последнее время, ежегодная заболеваемость инвазивными грибковыми инфекциями составляет 6,5 млн случаев в год, что приводит к 3,8 млн смертей, из которых около 2,5 млн являются прямым следствием грибковой инфекции [2]. Данные показатели превышают таковые для многих других наиболее опасных инфекционных заболеваний, включая туберкулёз и малярию. Одним из наиболее распространённых видов инвазивных грибковых инфекций является инвазивный кандидоз (ИК). Ежегодно около 1,56 млн человек заболевают ИК, при этом 995 000 человек умирают [2].

Диагностика грибковых инфекций значительно улучшилась за последние 10–15 лет, однако качество известных на сегодня тестов не позволяет получать достоверные результаты, а их доступность и фактическое использование ограничены [3]. Культуральные методы, т.е. выращивание культуры патогенного гриба, выделенного из крови или других физиологических жидкостей, является золотым стандартом в диагностике ИК, однако данные методы требуют продолжительного времени (от нескольких дней до недели), что является серьёзным недостатком с учётом неотложности клинического состояния пациентов при инвазивных микозах [4]. Методы ПЦР-диагностики пока не дают эффективного результата при обнаружении инвазивных микозов, для детекции которых более широко используются методы иммуноферментного анализа (ИФА). Их примерами являются диагностические наборы, обнаруживающие галактоманнан Aspergillus и маннан Candida, а также соответствующие антитела [3]. Для обнаружения грибкового β-(1→3)-глюкана используется тест-система на основе лизата амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus) [5], популяция которого является ограниченной и исчерпаемой. Данный тест способен давать ложноположительные результаты вследствие своей высокой чувствительности и неудобен при дробном использовании диагностического набора [6]. Представляется целесообразным заменить его на ИФА-формат.

Выбор диагностических маркеров и гомологичных антител является ключевой проблемой при разработке тест-систем ИФА. Они должны эффективно выявлять присутствие грибковых патогенов в организме даже на ранних стадиях инфекции. Одним из практически важных маркеров является полисахарид β-(1→3)-глюкан – компонент клеточной стенки многих грибов, включая Candida, Aspergillus и Pneumocystis jirovecii [7]. Тесты, детектирующие β-(1→3)-глюкан, используются для диагностики инвазивных микозов, вызываемых данными патогенными грибами [8]. Наличие этого маркера в сыворотке крови свидетельствует о наличии грибковой инфекции, однако тест не является специфичным для какого-то одного рода гриба, поэтому его результаты должны интерпретироваться в контексте с клинической картиной и другими диагностическими тестами.

Другой антигенный маркер, маннан, является компонентом клеточной стенки грибов рода Candida. Тест на маннан используется для диагностики инвазивного кандидоза [9]. Антитела, специфичные к маннану, также могут быть обнаружены в крови пациентов и указывают на иммунный ответ на инфекцию Candida [10]. Использование комбинации тестов на маннан и комплементарные антитела повышает чувствительность и специфичность диагностики ИК [11]. Однако существующие тесты характеризуются недостаточной чувствительностью, что связано с выбором выявляемого эпитопа в структуре сложного и гетерогенного маннана [12, 13].

Разработка эффективных тест-систем ИФА для обнаружения β-(1→3)-глюкана и маннана требует наличия соответствующих высокоаффинных антител, распознающих строго определённую олигосахаридную последовательность. Целью данной работы является характеристика углеводной специфичности двух моноклональных антител, СM532 и FG70, к грибковым антигенным маркерам с использованием серии олигосахаридов, полученных синтетическим путём. Особенностью проведённой работы является использование в качестве иммуногенов синтетических олигосахаридов определённого строения, которые, в отличие от гетерогенных грибковых полисахаридов, могут быть воспроизводимо получены и структурно охарактеризованы. Кроме того, показано, что достаточно широко распространённое использование в качестве покрывающих антигенов гликоконъюгатов на основе полиакриламида (ПАА) [14] может приводить к получению неточных и завышенных результатов по специфичности антител. Применение в качестве покрывающих антигенов биотинилированных олигосахаридов, которые могут быть нанесены количественно на слайды чипов и иммунологические планшеты [15], позволяет получать более точные данные об углеводной специфичности исследуемых антител.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Все реакции проводили в растворителях, очищенных по стандартным методикам. Гель-хроматографию активированных эфиров олигосахаридных лигандов проводили на колонке (0,9 × 30 см) с гелем TSK HW-40(S) («Tosoh Bioscience», Япония) в 0,5 М AcOH; скорость потока – 0,3 мл/мин; элюат анализировали с помощью проточного рефрактометра Knauer К-2401 («Knauer GmbH», Германия). Диализ проводили в диализных кассетах Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassettes (10K MWCO, 3 мл), согласно инструкции производителя («Thermo Fisher Scientific», США).

Спектры ЯМР регистрировали при 25 °С на приборе Bruker Avance 600 («Bruker Corporation», США) в тяжёлой воде (D₂O); в качестве внутреннего стандарта использовался ацетон (δ_H 2,225; δ_C 31,45). Масс-спектры высокого разрешения были зарегистрированы на приборе Bruker micrOTOF II («Bruker Corporation») методом электрораспылительной ионизации (ESI).

Синтез иммуногенов. Получение активированных лигандов 1-AE и 2-АЕ. К растворам олигосахаридных лигандов 1 и 2 (1,03 мг; 1,16 мкмоль – для 1; 1,38 мг; 1,14 мкмоль – для 2) в диметилформамиде (ДМФА; 100 мкл), содержащем Et₃N (0,1 мкл), добавляли раствор бис(4-нитрофенил)(оксибис(этан-2,1-диил))бис(карбоната) (5,07 мг; 11,5 мкмоль; 10 экв.) в ДМФА (200 мкл). Полученную реакционную смесь гомогенизировали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин, затем упаривали досуха на роторном испарителе. Остаток растворяли в EtOAc (5,0 мл) и экстрагировали активированные эфиры 1-АЕ и 2-AE 0,1 M AcOH (3 раза по 2,0 мл), объединённую водную фазу упаривали на роторном испарителе. Остаток растворяли в 0,5 мл 0,5 М AcOH и наносили на колонку с гелем TSK HW-40(S) (0,9 × 30 см; элюент – 0,5 М AcOH). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривали досуха, затем остаток растворяли в воде (0,5 мл) и лиофилизировали. Производные 1-AE (1,00 мг; 73%) и 2-АЕ (1,20 мг; 70%) получали в виде белых аморфных порошков. В спектре 1H ЯМР полученных продуктов 1-AE и 2-АЕ присутствовали сигналы углеводной части, практически не отличающиеся от соответствующих данных спектров исходных (3-аминопропил) гликозидов 1 и 2, а также идентичные для обоих продуктов характеристичные сигналы агликона. Спектр 1H ЯМР (600 МГц, D₂O, δ, м.д., J/Гц; характеристичные сигналы агликона): 4,11 (м, 2 H, СHaH^bOC=O); 4,37 (м, 2 H, СH^aHbOC=O); 7,37 (д, 2 H, pNPh, J = 9,0); 8,24 (д, 2 H, pNPh, J = 9,0). 1-AE – найдено: m/z 1205,3705 [M + Na]+ C₄₅H₇₀N₂O₃₄; вычислено: M + Na = 1205,3702. 2-АЕ – найдено: m/z 1529,4752 [M + Na]+ C₅₇H₉₀N₂O₄₄; вычислено: M + Na = = 1529,4759.

Получение конъюгатов с KLH (гемоцианин Megathura crenulate). Раствор KLH («Sigma-Aldrich», США; H8283; 4,4 мг/мл; 500 мкл) вносили в предварительно гидратированную диализную кассету, которую помещали в 200 мл фосфатного буфера (50 мM, pH 8,55), который меняли через 2, 4, и 16 ч. Раствор KLH извлекали из кассеты и делили на две части по 250 мкл (4,0 мг/мл), к которым добавляли водные растворы активированных лигандов 1-AE (1,0 мг в 40 мкл H₂O) или 2-AE (1,2 мг в 50 мкл H₂O). Полученные реакционные смеси гомогенизировали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре в течение двух суток, при этом весь активированный эфир расходовался (ТСХ-контроль). Затем реакционные смеси диализовали против фосфатно-солевого буфера (ФСБ), который меняли через 2, 4, и 16 ч. Целевые конъюгаты извлекали из кассет с использованием ФСБ («Sigma-Aldrich») для промывки. Получали по 600 мкл конъюгатов 1-KLH и 2-KLH c концентрацией по белку 1,22 мг/мл (ε279 = 1,4 мл·мг−1·см−1; ε347 = 0,4 мл·мг−1·см−1) в виде слегка опалесцирующих жидкостей с голубым оттенком, которые использовали в качестве иммуногенов для получения моноклональных антител.

Моноклональные антитела. Моноклональные антитела СM532 (IgG2a) и FG70 (IgG2b) были получены с использованием гибридомной технологии, как было описано ранее [16, 17]. Конъюгаты 1-KLH и 2-KLH использовали в качестве иммуногенов, а соответствующие биотинилированные конъюгаты – в качестве покрывающих антигенов ИФА для отбора клеточных линий продуцентов. Изотипы антител, продуцируемых обоими клонами, были определены с помощью набора для изотипирования («Sigma-Aldrich»). Очистку антител проводили методом аффинной хроматографии на колонке с белком А-сефароза. Для очистки антител использовали среды, собранные при культивировании гибридом. Антитела элюировали с помощью 50 мМ лимонной кислоты с последующим добавлением фосфата натрия. Финальный состав цитратно-фосфатного буфера: 22 мM фосфатного буфера и 12 мМ лимонной кислоты (pH 7,5); 0,05% (v/v) Tween 20; 0,1% ProClin 300.

Конъюгаты олигосахаридных лигандов с биотином и полиакриламидом. Биотинилированные олигосахариды 1m–14m, родственные фрагментам маннана [18–24], и 1g–13g, родственные фрагментам глюкана [25–27], были синтезированы с использованием ранее разработанных синтетических методов [28]. Для этого к раствору аминопропил гликозида в ДМФА добавляли Et₃N и раствор активированного эфира биотина, после прохождения реакции конъюгат очищали методом гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-40(S) (элюент – 0,1 M AcOH). Конъюгаты олигосахаридов 9m–12m c ПАА были получены по описанной нами ранее методике [29] с 20%-ным мольным содержанием олигосахаридного лиганда. Кратко, к раствору аминопропил гликозида в ДМФА добавляли Et₃N и раствор п-нитрофенил полиакрилата в ДМФА при 37 °C. Через 2 ч к смеси добавляли н-BuNH₂, а ещё через 2 ч добавляли избыток этаноламина и оставляли на ночь. Реакционную смесь упаривали, конъюгат очищали методом гель-проникающей хроматографии на геле LH-20 («Sigma-Aldrich») в системе MeCN/H₂O (1/1).

Иммуноферментный анализ с использованием полиакриламидных покрывающих антигенов. Раствор конъюгатов олигосахаридов 1m–14m с ПАА (100 мкл; 2 мкг/мл в ФСБ) наносили в лунки полистирольного планшета («Thermo Fisher Scientific») и оставляли при 4 °С на сутки. После нанесения лунки промывали ФСБ (100 мкл) 1 раз и блокировали 1%-ным раствором БСА в ФСБ при 37 °С в течение 1 ч. После вытряхивания блокирующего раствора и сушки планшет был готов для эксперимента. Образцы исследуемых моноклональных антител (100 мкл) в заданной концентрации наносили в лунки планшета и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, затем промывали промывочным буфером 3 раза. Для разведения антител и промывки планшетов использовали ФСБ (pH 7,4), содержащий 0,1% БСА и 0,1% (v/v) Tween 20. Далее, лунки обработали конъюгатом поликлональных антител к IgG мыши с пероксидазой («ИМТЕК», Россия) и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин, затем промывали промывочным буфером 5 раз. Проявление планшетов производили добавлением 100 мкл однокомпонентного хромогенного субстрата TMB («Хема», Россия) в течение 10 мин. Реакцию останавливали, добавляя 50 мкл 1 M H₂SO₄. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм на планшетном ридере Multiskan GO («Thermo Fisher Scientific»). Все измерения проводили независимо в трёх повторениях.

Иммуноферментный анализ с использованием биотинилированных покрывающих антигенов. Иммуноферментный анализ проводили на авидиновых планшетах («Хема»; P300A) при использовании ФСБ, содержащего 0,05% (v/v) Tween 20 и 0,1% БСА, в качестве отмывающего раствора и раствора для разведения биотинилированных олигосахаридов, моноклональных антител и проявляющих антител, меченных пероксидазой. Биотинилированные олигосахариды 1m–14m и 1g–13g адсорбировали на дно лунок (20 пмоль олигосахарида в 100 мкл разводящего раствора на одну лунку) в течение 2 ч при 37 °С при встряхивании, затем промывали планшет 3 раза и наносили образцы исследуемых моноклональных антител в заданной концентрации (100 мкл). Планшет инкубировали 45 мин при 37 °С при встряхивании, после чего промывали планшет 5 раз. Адсорбированные антитела проявляли с использованием поликлональных антител к IgG мыши, меченных пероксидазой, и однокомпонентного хромогенного субстрата TMB. Поглощение продуктов ферментативной реакции измеряли на приборе Multiskan GO при длине волны 450 нм.

Статистический анализ. Все измерения для олигосахарид-специфического ИФА повторяли трижды и представляли в виде среднего. Разброс полученных значений представлен на графиках в виде среднеквадратичного отклонения. Относительное стандартное отклонение значения поглощения при повторах не превышало 10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полисахарид маннан, являющийся характерным антигенным маркером для рода Candida, имеет сложную разветвлённую структуру, напоминающую гребень. Основная цепь данного полисахарида построена из α-(1→6)-связанных остатков маннозы, к которым во втором положении присоединены олигоманнозные цепи, которые, в свою очередь, могут также содержать ответвления. Боковые олигоманнозиды для разных серотипов Candida имеют различную структуру и длину. Они могут быть построены либо только из α-(1→2)-, α-(1→3)-связанных остатков маннозы, либо дополнены на невосстанавливающем конце фрагментами из β-(1→2)-связанных остатков маннозы. Боковые цепи маннана являются антигенными факторами, позволяющими серотипировать различные виды Candida, и составляют основу для их диагностики. Ранее было установлено, что именно боковые цепи, содержащие β-(1→2)-связанные остатки маннозы, вносят наибольший вклад при индуцировании выработки антител в отношении маннанов Candida albicans [29–31]. Поэтому в качестве лиганда для получения иммуногенного конъюгата в данной работе был выбран пентаманнозид 1, содержащий блок из двух β-(1→2)-связанных маннозных остатков на невосстанавливающем конце α-(1→2)-триманнозидной последовательности (схема 1).

 

Схема 1. Синтез конъюгатов 1-KLH (а) и 2-KLH (б), использованных в качестве иммуногенов при получении моноклональных антител

 

β-D-Глюканы, являющиеся маркерами целого ряда грибковых инфекций (см. выше), имеют, как правило, β-(1→3)-связанную основную цепь, несущую боковые ответвления при С-6 некоторых остатков глюкозы. Для выработки антител был использован линейный гептасахаридный фрагмент β-(1→3)-глюкана (схема 1), так как именно эта основная цепь в первую очередь взаимодействует с клетками иммунной системы [32].

Конъюгаты лигандов 1 и 2 были получены по разработанной ранее методике (схема 1) [33]. Для этого из олигосахаридов 1 и 2, содержащих аминопропильный агликон, были получены производные с дополнительным линкером на основе диэтиленгликоля, содержащим на конце пара-нитрофениловый эфир (соединения 1-АЕ и 2-АЕ соответственно). Активированные таким образом лиганды 1-АЕ и 2-АЕ были введены в реакцию с белком-носителем с дальнейшей очисткой с помощью диализа. Таким образом, были получены конъюгаты 1-KLH и 2-КLH, содержащие фрагменты целевых грибковых антигенов – маннана и глюкана.

Конъюгаты 1-KLH и 2-КLH были использованы в качестве иммуногенов для получения моноклональных антител при помощи гибридомной технологии, как было описано ранее [16, 17]. Биотинилированные производные маннана (1) и глюкана (2) были использованы в качестве покрывающих антигенов для отбора соответствующих клеточных линий продуцентов методом ИФА. В результате были получены моноклональные антитела СM532 и FG70, специфичность которых была исследована с использованием серий олигосахаридных лигандов.

Для изучения эпитопной специфичности моноклональных антител в качестве покрывающих антигенов для ИФА были использованы два типа производных: поливалентные конъюгаты с ПАА и моновалентные конъюгаты с биотином (схема 2). Конъюгаты с ПАА были получены по реакции олигосахаридов, содержащих аминопропильный агликон, с пара-нитрофениловым активированным эфиром полиакриламидного носителя с последующим добавлением двух низкомолекулярных аминов для блокирования карбоксильных групп, не вступивших во взаимодействие с олигосахаридным лигандом (схема 2, а). Для получения конъюгатов с биотином был использован биотинилирующий агент, содержащий гибкий гидрофильный линкер на основе гексаэтиленгликоля (схема 2, б) [28].

 

Схема 2. Синтез покрывающих антигенов для ИФА: конъюгатов с ПАА (а) и биотином (б)

 

Первоначально для изучения эпитопной специфичности моноклонального антитела СM532 были использованы ПАА-конъюгаты олигосахарида 11m, входящего в состав иммуногена, а также структурно родственных лигандов 9m, 10m и 12m (рис 1, а). Результаты ИФА с использованием данного типа покрывающего антигена показали примерно одинаковое распознавание всех исследованных олигосахаридов (рис 1, в). Отсутствие различий между лигандами с существенными структурными различиями (9m, 10m, 11m и 12m), вероятно, является следствием использования полиакриламидной основы для покрывающих антигенов. В этом случае невозможно контролировать плотность присоединения лигандов к поверхности полимера, а следовательно, нельзя добиться воспроизводимых результатов и сравнивать количественно показатели связывания для различных конъюгатов. Кроме того, адгезия полиакриламида к поверхности лунки планшета также не поддаётся контролю, затрудняя интерпретацию полученных результатов. Использование же биотинилированных конъюгатов в сочетании со стандартизованными планшетами, покрытыми стрептавидином, позволяет обеспечивать равномерное и воспроизводимое покрытие поверхности лунок. Также наличие гибкого длинного спейсера между биотином и лигандом обеспечивает хорошую презентацию антигена, отделяя его от поверхности стрептавидина (рис. 1, б). Таким образом, данные, полученные в ИФА-экспериментах с биотинилированными покрывающими антигенами, хорошо воспроизводятся и могут служить количественной мерой связывания.

 

Рис. 1. Результаты скрининга углеводной специфичности антитела СM532 c использованием углеводных лигандов 1m–14m (а), родственных маннану Candida albicans. Схематичное изображение иммобилизации конъюгатов с ПАА и биотином на поверхности планшета (б). Результаты ИФА, полученные с использованием конъюгатов с полиакриламидом (в) и биотином (г); ПАА – полиакриламид

 

В связи с вышесказанным для дальнейшего изучения эпитопной специфичности отобранных моноклональных антител были использованы библиотеки биотиновых углеводных лигандов [15]. Так, для моноклонального антитела СM532 в качестве покрывающих антигенов для ИФА были исследованы биотинилированные олигосахариды 1m–14m (рис. 1, а). В этом ряду содержались как α-(1→2)-/α-(1→3)-связанные маннозиды (1m–8m), так и соединения, содержащие β-(1→2)-маннозидные фрагменты (9m–13m). Также был рассмотрен лиганд, содержащий разветвление при С-6 (8m) и пента-α-(1→6)-маннозид (14m), родственный фрагменту главной цепи маннана C. albicans. Как видно из результатов скрининга (рис. 1, г), ни один из лигандов, содержащих исключительно α-гликозидные связи (1m–8m), не обладает сродством к моноклональному антителу СM532. Это можно объяснить иммунодоминантной ролью β-(1→2)-связанного фрагмента, входящего в состав гаптена 1. Рассматриваемое антитело связывается с олигоманнозидами, содержащими одну, две или три β-(1→2)-гликозидные связи (соединения 9m, 10m, 11m и 12m соответственно), но не связывается с лигандами, содержащими более длинную последовательность из четырёх β-(1→2)-связанных остатков маннозы (13m). Вероятно, в этом случае решающую роль играют конформационные особенности гексасахаридного лиганда 13m, не позволяющие ему эффективно взаимодействовать с центром связывания антитела СM532. Как следует из высоких значений поглощения (рис. 1, г) для всех рассмотренных концентраций, наибольшим сродством к антителу СM532 обладает пентасахарид 11m, а тетрасахарид 10m лишь незначительно ему уступает. Хуже распознаются лиганды 9m и 12m. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что минимальный эпитоп, специфично распознаваемый моноклональным антителом СM532, представляет собой трисахаридную последовательность β-Man-(1→2)-α-Man-(1→2)-α-Man.

Аналогичным образом был проведён скрининг углеводных лигандов для изучения эпитопной специфичности моноклонального антитела FG70, полученного в ответ на иммунизацию конъюгатом гепта-β-(1→3)-глюкозида (2-KLH). В качестве покрывающих антигенов для ИФА были использованы биотинилированные производные линейных β-(1→3)-глюкозидов, содержащих от одного до тринадцати звеньев глюкозы (1g–7g), а также β-(1→3)-глюкозидов, содержащих разветвления в виде одного остатка β-(1→6)-связанной глюкозы в различных участках цепи (8g–11g), и октасахарид 12g, в котором боковая цепь образована четырьмя остатками глюкозы. В качестве отрицательного контроля был выбран пента-β-(1→6)-глюкозид.

В результате проведённого скринига (рис. 2) было установлено, что моно- и дисахаридные фрагменты (1g и 2g) не распознаются антителом FG70 совсем; далее, по мере роста цепи от три- до пентасахарида (3g–5g) эффективность связывания возрастает, однако дальнейшее удлинение цепи (7 остатков – 6g, 13 остатков – 7g) не приводит к улучшению взаимодействия и выходит на плато.

 

Рис. 2. Результаты скрининга углеводной специфичности антитела FG70 c использованием углеводных лигандов 1g–13g (а), родственных общему грибковому маркеру β-(1→3)-D-глюкану. б – Результаты ИФА, полученные с использованием биотинилированных конъюгатов

 

При сравнении значений поглощения для лигандов 5g, 9g и 10g (рис. 2, б), содержащих одинаковый фрагмент пента-β-(1→3)-глюкозида, можно заключить, что дополнительное 3,6-разветвление практически не влияет на аффинность. Также на уровне пентасахарида 5g распознаётся нонасахарид 11g с одним 3,6-разветвлением в середине цепи. Олигосахаридные лиганды, в структуре которых отсутствует β-(1→3)-пентаглюкозидный фрагмент, либо не распознаются (соединение 8g и 13g), либо распознаются значительно слабее (соединение 12g). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что эпитоп, специфично распознаваемый моноклональным антителом FG70, расположен в пентасахаридной последовательности β-Glc-(1→3)-β-Glc-(1→3)-β-Glc-(1→3)-β-Glc-(1→3)-β-Glc.

Ранее авторами работы были исследованы моноклональные антитела 3G11 и 5H5, которые были отобраны после иммунизации мышей нона-β-(1→3)-глюкозидом [16]. Однако сравнительный анализ предельных значений концентраций антител, детектируемых в тестах ИФА, даёт основания полагать, что антитело FG70 обладает более высокой аффинностью к целевым глюканам, чем ранее описанные антитела 3G11 и 5H5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате данной работы были получены и охарактеризованы два моноклональных антитела, обладающие высокой специфичностью по отношению к фрагментам двух грибковых полисахаридов. Это позволяет рассматривать антитела СM532 и FG70 в качестве перспективных для разработки диагностикумов, предназначенных для выявления соответствующих грибковых инфекций. Используемое сейчас в коммерческих диагностических наборах моноклональное антитело EBCA-1 также распознаёт трисахаридный фрагмент β-Man-(1→2)-α-Man-(1→2)-α-Man [13], что указывает на перспективность полученного в данной работе антитела СM532.

Используемые в настоящее время наборы для диагностики грибковых глюканов содержат ферменты, выделяемые из живых организмов (мечехвостов), поэтому их использование имеет существенные ограничения. Применение ИФА-наборов на основе синтетических углеводных антигенов и гомологичных моноклональных антител позволит упростить производство, а также получать более достоверные и воспроизводимые диагностические результаты [34]. Охарактеризованные в данной работе антитела FG70 и СM532 обладают необходимыми для этого характеристиками.

Вклад авторов. В.Б. Крылов, Н.Э. Нифантьев – концепция и руководство работой; А.В. Полянская, А.Н. Кузнецов, А.Д. Титова, В.И. Юдин, Ю.Е. Цветков, О.Н. Юдина, Д.В. Яшунский – проведение экспериментов; М.Л. Генинг, Н.Э. Нифантьев – обсуждение результатов исследования; М.Л. Генинг, В.Б. Крылов – написание текста; А.Н. Кузнецов, Н.Э. Нифантьев – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-03-2024-401/3 от 30.05.2024).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам учреждения, в котором проводились исследования, и утвержденным правовым актам РФ и международных организаций.

About the authors

M. L. Gening

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

A. V. Polyanskaya

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

A. N. Kuznetsov

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

A. D. Titova

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

V. I. Yudin

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

D. V. Yashunskiy

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nen@ioc.ac.ru

Laboratory of Glycoconjugate Chemistry

Russian Federation, 119991 Moscow

Y. E. Tsvetkov

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nen@ioc.ac.ru

Laboratory of Glycoconjugate Chemistry

Russian Federation, 119991 Moscow

O. N. Yudina

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nen@ioc.ac.ru

Laboratory of Glycoconjugate Chemistry

Russian Federation, 119991 Moscow

V. B. Krylov

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: v_krylov@ioc.ac.ru

Laboratory of Synthetic Glycovaccines

Russian Federation, 119991 Moscow

N. E. Nifantiev

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: nen@ioc.ac.ru

Laboratory of Glycoconjugate Chemistry

Russian Federation, 119991 Moscow

References

Supplementary files