Diversity of molecular functions of RNA-binding ubiquitin ligases from the MKRN protein family

Texto integral

Принятые сокращения: ППР – преждевременное половое развитие; MKRN – Makorin RING finger; PABP – поли(А)-связывающий белок; PABPC1 – цитоплазматический поли(А)-связывающий белок; RING – Really Interesting New Gene.

ВВЕДЕНИЕ

Убиквитинилирование – это посттрансляционная модификация, способствующая выживаемости клеток, принимающая участие в процессах дифференцировки, а также в реализации врождённого и адаптивного иммунитета [1]. Убиквитинлигазы E3 действуют на заключительном этапе убиквитинилирования, связывая субстрат убиквитинилирования и комплекс убиквитинлигазы E2 и убиквитина (Ub). Основная функция убиквитинлигаз E3 заключается в переносе убиквитина на субстрат, за которым часто следует образование полиубиквитиновой цепи, прикреплённой к субстрату. Белки семейства Makorin RING finger (MKRN) входят в состав убиквитинлигаз E3 суперсемейства RING, представители которых наиболее распространены среди убиквитинлигаз. Термин «Макорин» был введён в 2000 году как комбинация слова «makor», что означает «источник», и аббревиатуры RING [2]. Белки семейства MKRN входят в состав убиквитин-протеасомной системы (UPS) и выполняют широкий спектр задач в клетке [1]. Основными мишенями этих белков являются p53 [3, 4], p21 [4], FAS-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD) [5], гомолог фосфатазы и тензина (PTEN) [6], p65 [7], секретируемый нейрональный пентроксин 1 (NPTX1) [8], серин/треонинкиназа MAP4K3 (GLK) [9], некоторые вирусные [10–13] и бактериальные белки [14–16]. MKRN найдены не только у животных, но и у растений и грибов, у которых они играют ключевую роль в таких процессах, как рост, эмбриональный и постэмбриональный органогенез [17, 18].

В геноме человека обнаружено девять генов, относящихся к семейству MKRN [2]. Среди них есть как функциональные копии, так и псевдогены. На сегодняшний день в литературе описаны четыре функциональных гена – Mkrn1, Mkrn2, Mkrn3 и Mkrn4 [1]. Помимо них, также известно 5 предполагаемых псевдогенов – Mkrnp1, Mkrnp2, Mkrnp3, Mkrnp4, Mkrnp5 [2].

Структура MKRN включает несколько доменов цинковых пальцев типа C3H, домен, подобный PAM2, домен RING-пальца и цистидин-гистидиновый (CH) домен [2, 19, 20] (рис. 1). Цинковые пальцы типа C3H (ассоциированные с РНК-связывающей функцией) встречаются в различных рибонуклеопротеинах, участвующих в процессинге РНК, включая сплайсинг, определении локализации мРНК и трансляции [21, 22]. Домен, подобный PAM2 (PCI/PINT-ассоциированный модуль 2), служит для облегчения взаимодействия MKRN с поли(А)-связывающими белками (PABP) путём, независимым от РНК [20]. MKRN1, MKRN3 и MKRN4 обладают этим доменом [20, 23], однако для MKRN2 также наблюдается взаимодействие с PABP [24]. Цинк-связывающий домен, называемый RING (Really Interesting New Gene), отвечает за связывание убиквитинлигазы E2 с убиквитином и стимулирует его перенос [25]. Функция домена, богатого остатками цистеина и гистидина, до сих пор неизвестна [2]. Белки MKRN1, MKRN2 и MKRN4 у человека имеют 4 цинковых пальца типа C3H, в то время как у MKRN3 их 3 [1].

 

Рис. 1. Организация доменов MKRN1, MKRN2, MKRN3 и MKRN4 человека. Члены семейства белков MKRN содержат несколько доменов цинковых пальцев типа C3H (обозначены фиолетовым цветом); мотив, подобный PAM2 (обозначены розовым цветом); CH-домен (обозначен серым цветом) и C3HC4-домен RING-пальца (обозначен зелёным цветом). Цифры указывают положение аминокислот в белке. Домен PAM2 представлен согласно работе Miroci et al., 2012 [20]

 

MKRN1

Ген Mkrn1, вероятно, является предковым для всего семейства генов MKRN. Филогенетический анализ выявил ортологи MKRN1 у широкого спектра видов животных, включая позвоночных и беспозвоночных [2]. Он охарактеризован у людей, мышей, валлаби, кур, свиней, дрозофил, нематод и даже растений [11, 26]. Ген Mkrn1 имеет высокий уровень экспрессии в таких органах человека, как гипоталамус и миндалевидное тело [1], а также яички у мужчин [2]. MKRN1 у человека представлен четырьмя изоформами, кодируемыми одним геном Mkrn1, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга и вариабельного полиаденилирования. Длинная изоформа MKRN1 (MKRN1-long) имеет четыре цинковых пальца типа C3H, CH-домен и высококонсервативный C3HC4-домен RING-пальца. Транскрипты коротких изоформ MKRN1 (MKRN1-short1/MKRN1-short3) человека не содержат C-концевого цинкового пальца типа C3H и последние 6 аминокислот домена RING-пальца, которые необходимы для связывания второго иона цинка и N-концевого сегмента комплекса убиквитинлигазы E2 и убиквитина [1].

Hirotsune et al. [27] предположили, что псевдоген Mkrn1, называемый Mkrn1-p1, регулирует стабильность матричной РНК Mkrn1 в транс-положении. Также на модели трансгенных мышей ими было показано, что снижение транскрипции Mkrn1-p1 приводит к поликистозу почек и деформации костей [27]. Однако согласно другим исследованиям Mkrn1-p1 полностью метилирован на обоих аллелях и не транскрибируется, и, как следствие, он не может влиять на стабильность транскриптов Mkrn1 [28]. Более того, ни одного из фенотипов, вызванных частичным снижением экспрессии Mkrn1 у мутантных мышей, не наблюдалось у мутантов с полным нарушением работы гена Mkrn1 [28].

MKRN1 является убиквитинлигазой E3, и на данный момент было обнаружено несколько его мишеней. Одна из них – это обратная транскриптаза теломеразы человека (hTERT), являющаяся каталитической субъединицей рибонуклеопротеина, который препятствует деградации и укорочению концов теломер. Теломеры являются важнейшими частями эукариотических хромосом и предотвращают их прогрессирующую деградацию. Было показано, что MKRN1 убиквитинилирует hTERT и тем самым влияет на активность теломеразы и длину теломер [29]. При этом интересно, что связывание сфингозин-1-фосфата hTERT предотвращает его деградацию, опосредованную MKRN1 [30] (рис. 2, в).

 

Рис. 2. Разнообразие биологических функций MKRN1. а – MKRN1 участвует в противовирусной защите, но способствует подавлению иммунного ответа при микобактериальной инфекции; TLR – toll-подобные рецепторы; TRAF6 – фактор 6, ассоциированный с рецептором TNF; SHP-1 – фосфатаза-1, содержащая домен, гомологичный Src 2; Mtb – Mycobacterium tuberculosis; б – MKRN1 оказывает различные эффекты на онкогенез; EMT – эпителиально-мезенхимальный переход; в – MKRN1 регулирует уровни белка TERT; г – мишени опосредованного MKRN1 убиквитинилирования и связанные с ним заболевания; д – MKRN1 действует как транскрипционный репрессор; е – MKRN1 участвует в контроле качества трансляции посредством остановки рибосом

 

Известно, что MKRN1 связывается с несколькими вирусными белками (рис. 2, a), включая белок капсида (Cap) цирковируса свиней типа 2 (PCV2). PCV2 вызывает синдром мультисистемного истощения у свиней после отъёма от груди (PWMS), симптомами которого являются истощение, лихорадка, лимфаденопатия и сокращение количества лимфоцитов лимфоидных тканей [10], что приводит к болезням свиней и, следовательно, оказывает серьёзное влияние на свиноводство во всем мире [31]. При индивидуальной экспрессии MKRN1 накапливается в спекл-подобных структурах внутри нуклеоплазмы, тогда как при совместной экспрессии с белком Cap оба белка рыхло распределены в нуклеоплазме и колокализуются. Более того, экспрессия Cap снижается в присутствии MKRN1 [10]. Было обнаружено, что MKRN1 убиквитинилирует остатки лизина в Cap PCV2 и способствует его деградации [11]. Интересно, что нокаут по гену Mkrn1 или мутации ключевых аминокислот в кодируемом белке способствуют успешному размножению вируса в клетках хозяина; следовательно, MKRN1 функционирует как фактор защиты, который ингибирует репликацию PCV2 [11]. MKRN1 также может связываться с капсидным белком вируса Западного Нила (WNVCp). WNV – это вирус семейства Flaviviridae, переносимый членистоногими [32], вызывающий неврологические заболевания, такие как менингит и энцефалит [12]. MKRN1 проводит убиквитинилирование и способствует деградации WNVCp протеасомно-зависимым образом [12].

Интересно, что некоторые вирусные белки могут вызывать самоубиквитинилирование MKRN1 [13]. Так, например, предшественник белка pVII аденовирусов человека (HAdV) связывается с MKRN1 и усиливает его самоубиквитинилирование, тогда как процессированный зрелый белок VII лишён этой функции [13]. MKRN1 подвергается протеасомной деградации на поздней стадии инфекции HAdV-C5 в различных линиях клеток человека. Это может являться примером возможной вирусной стратегии противодействия защите клеток-хозяев от вирусов, опосредованной MKRN1 [13].

Было показано, что ген Mkrn1 активируется во время микобактериальной инфекции в клетках эндометрия [14]. Кроме того, рекомбинантный MKRN1, экспрессируемый в E. coli, убиквитинилирует M. tuberculosis in vitro. Это говорит о новой роли MKRN1 в клеточной защите от микобактерий [15], однако точный молекулярный механизм наблюдаемого процесса остаётся неясным. Также было показано, что MKRN1 взаимодействует с белком M. tuberculosis из семейства PPE (PPE68) и способствует присоединению цепей убиквитина, связанных через лизин-63 (K63) с остатком K166 PPE68, что подавляет врождённый иммунный ответ (рис. 2, a). Нарушение взаимодействия между MKRN1-убиквитинлигазной системой хозяина и микобактериальным белком PPE может быть потенциальной терапевтической мишенью для лечения туберкулёза [16].

MKRN1 играет роль во многих клеточных процессах. Апоптоз, или запрограммированная гибель клеток, позволяет организму строго контролировать количество клеток и размер тканей, а также защищать себя от неконтролируемо делящихся клеток, угрожающих гомеостазу [33]. MKRN1 регулирует убиквитинилирование и протеасомную деградацию адаптерного белка FADD [5]. На клеточных линиях было показано, что нокдаун MKRN1 приводит к стабилизации FADD и стимуляции образования комплексов рецепторов смерти для апоптоза [5]. Также было отмечено, что уровни мРНК MKRN1 были значительно выше в тканях рака молочной железы и шейки матки, чем в соответствующих нормальных тканях [5]. Кроме того, было показано, что MKRN1 убиквитинилирует и индуцирует деградацию основного супрессора опухолей – PTEN – через AKT-зависимый сигнальный каскад, активируемый EGF. PTEN противодействует сигналингу PI3K/AKT, который стимулируется фактором роста, путём преобразования фосфатидилинозитол (3,4,5)-трифосфата (PIP3) в фосфатидилинозитол (4,5)-трифосфат (PIP2) [6]. Также было обнаружено, что MKRN1 приводит к увеличению скорости роста опухоли желудка посредством убиквитинилирования и последующей протеасомно-зависимой деградации супрессора опухоли p14ARF [34]. Кроме того, MKRN1 напрямую взаимодействует с белком аденоматозного полипоза толстой кишки (APC), который является онкосупрессором, отрицательно регулирующим сигнальный путь Wnt, и убиквитинилирует его. MKRN1 способствует протеасомной деградации APC и положительно регулирует биологические процессы, опосредованные каскадом реакций пути Wnt/β-катенина [35]. MKRN1 участвует в канцерогенезе определённого типа плоскоклеточного рака пищевода (ПРП), который является одним из самых злокачественных типов опухолей [36], и был идентифицирован как новый антиген SEREX (серологическая идентификация антигенов путём клонирования экспрессии рекомбинантной кДНК) ПРП [36]. В почечной светлоклеточной карциноме MKRN1 и MKRN2 служат супрессорами опухолей, регулируя экспрессию p53 [37]. MKRN1 индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход в клетках колоректального рака посредством убиквитинилирования и деградации ядерно-взаимодействующего Smad-белка 1 (SNIP1), который активирует каскад реакций сигнального пути, опосредованного трансформирующим фактором роста-β (TGF-β), и, таким образом, ускоряет метастазирование колоректального рака [38]. В совокупности эти данные показывают роль MKRN1 в качестве возможной терапевтической мишени при лечении рака (рис. 2, б).

На клеточных линиях было обнаружено, что экспрессия MKRN1 снижается в тканях миокарда крыс, как и в клетках H9C2 и AC16, во время прерывистой гипоксии (ПГ) [39]. Кроме того, MKRN1 способствовал убиквитинилированию белка p21 и его протеосомно-зависимой деградации, что приводит к снижению продукции активных форм кислорода и, таким образом, предотвращает апоптоз миокарда, вызванный ПГ (рис. 2, г) [39].

При фосфорилировании белка, взаимодействующего с фактором связывания теломерного повтора 2 (TERF2IP), по остатку S205 (событие, следующие за активацией p90RSK), экспрессия MKRN1 ингибируется, что способствует активации и старению эндотелиальных клеток и, таким образом, развитию атеросклероза (рис. 2, в) [40].

MKRN1 играет роль в развитии нескольких метаболических заболеваний. В качестве убиквитинлигазы E3 он убиквитинилирует ядерный рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором γ (PPARγ), и направляет его на протеасомно-зависимую деградацию (рис. 2, г). Наиболее высокая экспрессия PPARγ наблюдается в жировой ткани, где он является ключевым организатором транскрипционного каскада, лежащего в основе дифференцировки адипоцитов [41]. PPARγ также играет ключевую роль в активации липидного метаболизма жировой ткани [41]. Таким образом, изменённая дифференциация и метаболизм адипоцитов зависят от активности PPARγ и могут приводить к патофизиологическим состояниям, таким как резистентность к инсулину, сердечно-сосудистые заболевания и диабет [41].

Кроме того, MKRN1 может способствовать нарушению нейроразвития, поскольку он формирует систему контроля качества эндоплазматического ретикулума незрелых гликозилированных ядерных белков Eag1, которые составляют нейрон-специфический потенциал-зависимый K+-канал и играют важную роль в развитии мозга (рис. 2, г) [42]. Интересно, что MKRN1 отвечает только за раннюю стадию созревания Eag1 в эндоплазматическом ретикулуме и может обеспечить эффективное удаление неправильно свёрнутых мутантных каналов Eag1, приводящих к заболеваниям [42].

Другой мишенью MKRN1 является AMP-активируемая протеинкиназа (AMPK), которая играет ключевую роль в контроле энергетического метаболизма в ответ на физиологический и пищевой статус (рис. 2, г) [43]. Отсутствие MKRN1 приводит к активации AMPK, увеличению потребления глюкозы и снижению накопления липидов [43]. В отличие от мышей дикого типа, нокауты по Mkrn1 менее подвержены ожирению, диабету и неалкогольной жировой болезни печени при содержании на высокожировой диете (ВЖД) [44]. Удивительно, но у мышей с нокаутом Mkrn1 в печени, белой и бурой жировых тканях наблюдалось увеличение уровня активированной фосфорилированной формы AMPK [44]. В совокупности MKRN1 может являться возможной терапевтической мишенью для лечения метаболических синдромов, таких как ожирение, диабет II типа и жировые заболевания печени [44].

Помимо роли убиквитинлигазы E3, MKRN1 участвует в регуляции транскрипции (рис. 2, д) [7]. В функциональном скрининге дрожжей и при трансфекции клеток млекопитающих MKRN1 был идентифицирован как транскрипционный репрессор фактора транскрипции c-Jun [7], который вместе с белком c-Fos образует комплекс активаторного белка-1 (AP-1) и участвует в ряде биологических процессов, включая пролиферацию, апоптоз, выживание клеток, образование опухолей и морфогенез тканей [45]. Репрессорная активность MKRN1 не ограничивается c-Jun и влияет на различные активаторы, зависимые от РНК-полимеразы II, такие как p53, p65 и человеческий андрогеновый рецептор (hAR) [7]. Интересно, что эта активность MKRN1 опосредована процессом транскрипции и не зависит от убиквитинилирования белка [7].

MKRN1 является новым регулятором трансляции, который работает посредством взаимодействия с PABP [20]. В нейрональных дендритах переднего мозга крысы MKRN1 колокализуется с PABP, связанным с дендритными мРНК [20]. Впоследствии была выявлена более точная роль MKRN1 как нового фактора в контроле качества, связанном с рибосомой (KKP) [46]. MKRN1 напрямую связывается с цитоплазматическим поли(А)-связывающим белком PABPC1, тем самым отмечая начало поли(А)-хвостов. Если происходит преждевременное полиаденилирование или считывание стоп-кодона, MKRN1 останавливает транслирующую рибосому и инициирует ККР путём убиквитинилирования рибосомального белка S10 (RPS10), PABPC1 и других регуляторов трансляции (рис. 2, е) [46].

В заключение отметим, что MKRN1 выполняет три основные роли в клеточном метаболизме. Во-первых, как убиквитинлигаза E3 MKRN1 модулирует активность теломеразы и длину теломер путём убиквитинилирования hTERT; действует как фактор защиты хозяина путём убиквитинилирования белка Cap PCV2, WNVCp; белка PPE68 M. tuberculosis; регулирует канцерогенез путём убиквитинилирования FADD, PTEN, p14ARF, APC; участвует в развитии нескольких метаболических заболеваний путём убиквитинилирования p90RSK, PPARγ, AMPK; регулирует развитие мозга, формируя систему контроля качества эндоплазматического ретикулума. Во-вторых, MKRN1 функционирует как транскрипционный регулятор c-Jun, p53, p65, hAR. Наконец, нельзя недооценивать роль MKRN1 как инициатора ККР через взаимодействие с PABPC1. Было показано, что MKRN1 проявляет как убиквитинлигазную, так и РНК-связывающую активность. Он выполняет множество функций, включая прямое убиквитинилирование определённых белков, а также регуляцию транскрипции и трансляции, подразумевающих обе активности MKRN1. Для того чтобы выполнить функцию транскрипционного репрессора, MKRN1 убиквитинилирует транскрипционные факторы и ингибирует их, действуя через процесс транскрипционной интерференции [7]. В процессе контроля качества трансляции MKRN1 связывает поли(А)-участок РНК выше по ходу транскрипции и убиквитинилирует рибосомальный белок RPS10, PABPC1 и другие трансляционные регуляторы [46]. Интересно, что РНК-связывающая активность MKRN1 сама по себе, по-видимому, не оказывает существенного влияния на клетку. Однако точная роль РНК-связывающей функции MKRN1 остаётся неясной и требует дальнейшего изучения.

MKRN2

Ген Mkrn2 образовался в результате дупликации гена Mkrn1 450 миллионов лет назад во время ранней эволюции позвоночных [47]. Последовательность и структура MKRN2 имеют много общего с таковыми у MKRN1 и включают все характерные элементы, за некоторыми исключениями у древних млекопитающих, таких как утконос и опоссум [48]. Высокая консервативность Mkrn2 на протяжении эволюции указывает на наличие важной клеточной функции [47].

О регуляции этого гена известно мало, однако некоторые некодирующие РНК (нкРНК) предположительно вовлечены в прямую и косвенную регуляцию Mkrn2. В клетках колоректальной карциномы уровень экспрессии MKRN2 регулируется посредством отрицательной обратной связи с помощью miR-620, которая ингибирует трансляцию MKRN2, и LINC00294, которая ингибирует miR-620 (рис. 3, а) [49]. Авторы некоторых исследований [49] предполагают, что MKRN2 опосредует регуляторную функцию LINC00294.

 

Рис. 3. Многообразие биологических функций MKRN2. а – Уровень экспрессии MKRN2 регулируется через отрицательную петлю с участием miR-620 и LINC00294; б – MKRN2 и PDLIM2 совместно ингибируют воспалительный ответ, подавляя трансактивацию ядерного фактора κB (NF-κB); в – различные действия MKRN2 на онкогенез; г – MKRN2 функционально антагонизирует GLE1 во время ядерного экспорта мРНК, возможно, за счёт предотвращения транслокации GLE1 в ядро

 

Было показано, что MKRN2 отрицательно регулирует воспалительный ответ через подавление p65-опосредованной трансактивации NF-κB [50]. Совместно с PDLIM2 он полиубиквитинилирует ядерный p65 и способствует его протеасомной деградации (рис. 3, б). Стоит отметить, что MKRN2 контролирует p65 только на белковом уровне, поскольку количество мРНК p65 в клетках с нокдауном MKRN2 было сопоставимо с таковым в контрольных клетках [50]. Однако в других молекулярных процессах MKRN2 может влиять на уровень некоторых мРНК. Например, MKRN2 ингибирует нейрогенез, повышая уровень мРНК и белка киназы 3β гликогенсинтазы (GSK-3β) [51].

Роль MKRN2 в пролиферации клеток была подробно изучена, однако эффект от уровня экспрессии MKRN2 оказался противоречивым и зависел от типа рака. Например, низкий уровень экспрессии MKRN2 говорит о плохом прогнозе при раке желудка [52], колоректальной карциноме [49] и немелкоклеточном раке лёгкого [53]. В то же время снижение экспрессии MKRN2 подавляет рост атипичных клеток при меланоме [3] и лейкемии [54]. Объяснение этому феномену можно найти в деталях механизма действия MKRN2, поскольку в каждом типе рака были обнаружены разные мишени MKRN2-зависимого убиквитинилирования.

При исследовании немелкоклеточного рака лёгкого было показано, что MKRN2 осуществляет отрицательную регуляцию сигнального пути PI3K/Akt (рис. 3, в) [53]. При раке желудка MKRN2 также играет роль опухолевого супрессора: он способствует убиквитин-зависимой деградации мышечной изоформы пируваткиназы (PKM2) и ослабляет её влияние на внеклеточную сигнал-регулируемую киназу (ERK) [52]. В то же время в клетках меланомы MKRN2 убиквитинилирует опухолевый супрессор p53 (рис. 3, в) [3], подобно MKRN1 [4]. Хотя уровни экспрессии белка MKRN2 отрицательно коррелируют с экспрессией p53 и p21, MKRN2 не оказывает прямого влияния на стабильность белка p21 [3].

У мышей, нокаутных по Mkrn2, наблюдается мужское бесплодие [55], которое характеризуется уменьшением размеров семенников, аномалиями головки сперматозоидов и отсутствием сперматогенеза [56]. Детальное исследование показало, что нокаут Mkrn2 приводит к значительному снижению уровней экспрессии STAT1, SIX4 и TNС. В то время как MKRN2 и STAT1 взаимодействуют напрямую, уровни экспрессии SIX4 и TNC регулируются MKRN2 через транскрипционный фактор EBF2 [55]. В другом исследовании было показано, что дефекты в Мkrn2 приводят к снижению экспрессии Odf2 (белок наружных плотных волокон 2) в зародышевых клетках, что вызывает нарушение сборки жгутика хвоста сперматозоида [56]. Кроме того, считается, что MKRN2 участвует в регуляции развития половых клеток через p53-зависимый путь апоптоза [56]. Таким образом, MKRN2 может вносить вклад в баланс между выживанием и апоптозом зародышевых клеток.

С помощью животных моделей было показано, что MKRN2 может играть важную роль в развитии сетчатки и является функциональным антагонистом GLE1 во время ядерного экспорта мРНК (рис. 3, д). MKRN2 регулирует экспорт мРНК на уровне РНК, связываясь с CU-богатыми областями в 3′UTR, и на уровне белка, взаимодействуя с факторами экспорта (GLE/NUPL2, ZC3H11A, RAE1 и другими) [24]. Интересно, что не было выявлено ни одного субстрата убиквитинилирования MKRN2, связанного с ядерным экспортом.

MKRN2 также ассоциирован с рядом заболеваний. Мутации в MKRN2 и некоторых других генах могут способствовать развитию дегенеративного стеноза поясничного отдела позвоночника [57]. Авторы некоторых исследований предполагают, что MKRN2 участвует в регуляции коклюш-зависимой гистаминовой сенсибилизации [58]. Однако не только сам белок может способствовать развитию заболеваний: есть данные о том, что экзосомальная РНК lnc-MKRN2-42:1 может быть вовлечена в инициацию и развитие болезни Паркинсона [59].

Таким образом, РНК-связывающая убиквитинлигаза MKRN2 вовлечена в ряд важнейших биологических процессов, включая регуляцию воспалительного ответа и пролиферации клеток. Кроме того, дисфункция MKRN2 связана с патогенезом таких заболеваний, как мужское бесплодие и болезнь Паркинсона. Разнообразие мишеней убиквитинилирования на молекулярном уровне приводит к различным эффектам MKRN2 даже в рамках одного биологического процесса. Например, его роль в пролиферации зависит от конкретного типа рака. Помимо функций убиквитинлигазы, MKRN2 также осуществляет связывание с РНК, благодаря чему он участвует в регуляции ядерного экспорта мРНК. Интересно, что до сих пор для этого фермента не было выявлено взаимосвязи между РНК-связывающей и убиквитинлигазной активностью. В связи с этим целесообразно изучение потенциального взаимодействия между MKRN2 и PABPC1, которое может иметь значительное сходство с таковым для MKRN3, поскольку MKRN2 не вызывает генерализованных эффектов на клетки, как, например, MKRN1.

MKRN3

MKRN3 – это безинтронный ретроген, встречающийся исключительно у плацентарных млекопитающих и экспрессирующийся с отцовской хромосомы [48]. Он появился в результате обратной транскрипции мРНК MKRN1, катализируемой обратной транскриптазой ретротранспозонов [48]. В геноме человека MKRN3 расположен на хромосоме 15q11-13 в области, ассоциированной с синдромом Прадера–Вилли (СПВ) [19, 60], хотя до сих пор неясно, участвует ли MKRN3 в развитии этого заболевания [61].

У млекопитающих экспрессия данного гена зависит от ткани и периода онтогенеза. Наиболее высокий уровень мРНК Mkrn3 наблюдается в гипоталамусе в раннем постнатальном периоде жизни и постепенно снижается после полового созревания [62, 63]. У грызунов экспрессия Mkrn3 локализована в дугообразном ядре, которое контролирует наступление половой зрелости [64]. В гонадах экспрессия Mkrn3 зависит от пола. У самцов мышей мРНК Mkrn3 появляется в семенниках до начала полового созревания и сохраняется на относительно высоком уровне в зрелом возрасте преимущественно в интерстициальном отделе и в семявыносящих канальцах [65]. В яичниках самок мышей мРНК Mkrn3 также появляется до начала полового созревания, однако в период созревания её уровень значительно снижается и затем остаётся низким [65].

Интересно, что MKRN3 также связан с некоторыми аномалиями, влияющими на пол. Например, крупномасштабные делеции в импринтированном локусе 15q11-13, затрагивающие некодирующие и 5 белок-кодирующих генов (включая MKRN3), вызывают СПВ у человека [66]. Это заболевание характеризуется слабостью скелетной мускулатуры, умственной отсталостью и гормональными аномалиями [66]. Однако считается, что из всех симптомов СПВ MKRN3 вызывает только гипогонадизм [67, 68] и центральное преждевременное половое развитие (ППР) [69]. ППР характеризуется развитием вторичных половых признаков в возрасте до 9 лет у мужчин и 8 лет у женщин. ППР обусловлено более ранней активацией гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и повышением уровня гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) [70], который является основным регулятором репродуктивной оси [71].

Делеция всего гена или мутации, приводящие к потере функций белка, в MKRN3 вызывают ППР, без других симптомов СПВ [69]. В целом, на сегодняшний день у пациентов с ППР выявлено 59 мутаций в гене MKRN3, приводящих к потере функций белка, среди которых 6 нонсенс-мутаций, 16 сдвигов рамки считывания и 37 миссенс-мутаций. Было показано, что различия в фенотипе пациентов зависят от типа мутации. У пациентов, имеющих сдвиг рамки считывания, преждевременный стоп-кодон и мутации в промоторной области MKRN3, наблюдаются более высокий базальный уровень лютеинизирующего гормона и более значительное увеличение костного возраста по сравнению с пациентами с миссенс-мутациями [72]. Большинство описанных мутаций затрагивают домен RING finger C3HC4 (убиквитинлигазная активность), мотивы цинковых пальцев C3H (РНК-связывающая активность) и специфичный для семейства домен CH, однако тридцать из них находятся вне указанных структурных элементов [73]. Напротив, сверхэкспрессия Mkrn3 вызывала задержку начала полового созревания у самок мышей, в то время как у самцов мышей изменений в сроках полового созревания не наблюдалось [74].

Время начала полового созревания определяется тремя основными факторами: метаболическими, экологическими и нейроэндокринными. Одним из сигналов к началу полового созревания является достижение критического соотношения жировой и мышечной массы. Адипомиокины, такие как иризин, участвующие в модуляции метаболических процессов, могут опосредовать передачу сигналов в нейронную сеть гипоталамуса [75]. Экспрессия гена FNDC5, кодирующего предшественник иризина, была обнаружена в гипоталамусе и гонадах [76], что указывает на его роль в регуляции репродуктивной системы на разных уровнях. На нейронном уровне было показано, что введение иризина вызывает начало полового созревания, сопровождающееся снижением уровня MKRN3 и повышением уровня нейрокинина B (NKB, Tac2/3) и кисспептина (Kiss, Kiss1) [75], которые являются двумя ключевыми положительными регуляторами синтеза и секреции GnRH (рис. 4, а) [77, 78].

 

Рис. 4. Многообразие биологических функций MKRN3. а – MKRN3 участвует в гипоталамической регуляции полового созревания, POA – преоптическая область, ARC – аркуатное ядро, ME – срединное возвышение; б – MKRN3 убиквитинилирует белки для протеасомной деградации; в – возможные функции комплекса MKRN3–IGF2BP1

 

Считается, что MKRN3 участвует в регуляции уровней GnRH, NKB и Kiss. Сверхэкспрессия Mkrn3 приводит к снижению уровней белка кисспептина и нейрокинина В в гипоталамусах мышей [74], а нокаут Mkrn3 вызывает повышение уровней NKB [79] и GnRH1 [80]. Интересно, что миссенс-мутации, нарушающие функционирование домена RING finger, также приводят к повышению уровня GnRH1 [81]. Наблюдаемые различия являются результатом замедленной деградации мутантного варианта по сравнению с белком дикого типа, что связано с нарушением автоубиквитинилирования MKRN3 [81, 82].

Кроме того, было показано, что MKRN3 регулирует уровни РНК 404 генов нейронов дугообразного ядра, которые играют важную роль в развитии нейронов и синаптической пластичности, контролируя организацию внеклеточного матрикса, направление аксонов и формирование синапсов [79]. Более того, 13 из этих генов ассоциированы с возрастом менархе [79], что подтверждает гипотезу о том, что MKRN3 может быть одним из центральных регуляторов сроков полового созревания. Между тем, влияние MKRN3 на уровень мРНК GnRH1, Kiss1 и Tac3 представляется противоречивым. Сверхэкспрессия MKRN3 приводит к повышению концентрации соответствующих мРНК [74], что, однако, может быть компенсаторным эффектом повышенной убиквитинлигазной активности. В то же время было показано, что нокаут Mkrn3 не влияет на уровни экспрессии Kiss1, Tac3 и Gnrh1 у самок мышей различных возрастов на протяжении постнатального развития [79]. Однако у гетерозиготных мышей с нокаутом Mkrn3 в отцовском аллеле наблюдалось значительное повышение уровня мРНК GnRH1 для обоих полов [80].

Было выдвинуто предположение о том, что MKRN3 регулирует уровни мРНК KISS1 и TAC3, ингибируя активность промоторов соответствующих генов путём прямого связывания с ними [64]. Этот эффект был продемонстрирован на клеточной линии HEK293T [64], однако доказательства способности MKRN3 проникать в ядра отсутствуют. Более вероятным представляется, что MKRN3 регулирует промоторы с помощью промежуточных белков, таких как белок, содержащий метил-CpG-связывающий домен (MBD3), который является мишенью убиквитинилирования MKRN3. MBD3 в комплексе с тета-метилцитозин диоксигеназой 2 (TET2) активирует промотор GnRH1 [80]. Было показано, что осуществляемое MKRN3 убиквитинилирование MBD3 нарушает его связывание с TET2 [80]. Это приводит к общему снижению содержания 5hmC в геномах млекопитающих и, в частности, к снижению активности промотора GnRH1 (рис. 4, а).

Кроме того, известно, что MKRN3 может влиять на уровень трансляции мРНК GnRH1 путём ингибирования формирования комплекса инициации трансляции [83]. MKRN3 непосредственно связывает и убиквитинилирует поли(А)-связывающие белки (PABPC1 и PABPC4) [83, 84], которые регулируют полиаденилирование и нонсенс-опосредованный распад (NMD), контролируют инициацию трансляции мРНК и осуществляют контроль качества мРНК [85–87]. Убиквитинилирование, осуществляемое MKRN3, препятствует связыванию PABPC1/4 с поли(А)-хвостом мРНК и, таким образом, приводит к укорочению поли(А)-хвоста мРНК GnRH1 и снижению её стабильности (рис. 4, а) [83]. Кроме того, было показано, что PABP образуют авторепрессивный гетеромерный рибонуклеопротеиновый комплекс с другим белком-партнёром MKRN3 – белком 1, связывающим мРНК IGF2 (IGF2BP1) [79, 88]. Таким образом, MKRN3 может способствовать ингибированию трансляции мРНК PABP, образуя комплекс с IGF2BP1 и PABP. IGF2BP1 также участвует в аксональном транспорте мРНК [89], следовательно, взаимодействие MKRN3 с IGF2BP1 может регулировать данный процесс (рис. 4, в).

Также было выдвинуто предположение о том, что MKRN3 может быть вовлечён в развитие ППР на уровне специализации нейронов. Хотя MKRN3 не требуется для дифференцировки GnRH1-экспрессирующих нейронов [84], его функционирование может быть необходимо для формирования нейронной ниши. Действительно, секретируемый пептид NPTX1, который играет роль в формировании и ремоделировании синапсов [90], оказался мишенью полиубиквитинилирования MKRN3 (рис. 4, б) [8]. Хотя уровень NPTX1 в сыворотке крови у больных ППР с дефицитом MKRN3 не изменён [91], эти белки демонстрируют обратную концентрационную зависимость в гипоталамусах самок мышей в препубертатный период [8]. Таким образом, гипоталамическое нарушение деградации NPTX1 может быть вовлечено в прогрессирование ППР.

Однако биологическая функция MKRN3 не ограничивается регуляцией полового созревания. Достоверно определённые белки-партнёры MKRN3 вовлечены в такие процессы, как регуляция секреции инсулина, межклеточная адгезия, р53-регулируемый клеточный метаболизм, транскрипционная репрессия, а также транспорт и локализация РНК [79, 84]. Кроме того, считается, что MKRN3 может играть роль опухолевого супрессора, поскольку потеря его убиквитинлигазной активности способствует развитию глиобластомы [92] и немелкоклеточной карциномы лёгких [23]. Предполагаемый механизм онкосупрессии подразумевает участие в деградации различных онкогенов и предотвращение определённых взаимодействий посредством непротеолитического убиквитинилирования (рис. 4, б).

Экспериментальные данные указывают на важную роль MKRN3 в контроле сроков полового созревания и поддержке правильной дифференцировки нейронов. Следовательно, экспрессия этого гена должна строго регулироваться в организме.

Было показано, что статус метилирования CpG-области в промоторе Mkrn3 меняется в процессе полового созревания у мышей, и она значительно меньше метилирована до начала полового созревания [93], что соответствует наблюдаемым различиям в уровнях экспрессии. Кроме того, предполагается, что транскрипционный фактор DREAM является положительным регулятором экспрессии MKRN3 (рис. 4, а), поскольку делеция 4 нуклеотидов в его сайте связывания перед последовательностью MKRN3 приводит к снижению активности промотора и развитию ППР [94].

Также было обнаружено, что микроРНК miR-30b является отрицательным регулятором MKRN3 (рис. 4, а). miR-30b связывается с консервативной областью 3′UTR и способствует снижению содержания MKRN3 в гипоталамусе [95]. По-видимому, фермент Dicer, синтезирующий микроРНК, играет существенную роль в функционировании miR-30b. Врождённая абляция Dicer в Kiss1-экспрессирующих нейронах мышей способствует значительному увеличению экспрессии Mkrn3 [96]. В то же время на фенотипическом уровне у этих мутантных мышей наблюдается гипогонадотропный гипогонадизм у обоих полов и неполное половое созревание у самок.

Таким образом, MKRN3 является важнейшим молекулярным регулятором, который влияет на экспрессию генов на уровне РНК и белка, но при этом обладает высокой избирательностью действия. С одной стороны, MKRN3 влияет на транскрипцию своих мишеней через модуляцию метилирования CpG комплексом MBD3–TET2. С другой стороны, он регулирует стабильность мРНК и трансляцию за счёт нарушения связывания PABPC1/4 с поли(А)-содержащей мРНК. Однако, несмотря на участие в столь глобальных процессах и широкое разнообразие мишеней убиквитинилирования, MKRN3 проявляет высокую степень специфичности в своём молекулярном действии. В частности, он в основном вовлечён в регуляцию направления аксонов, организации синапсов, развития и дифференцировки нейронов. Современное понимание этого феномена основано на следующем наблюдении: экспрессия MKRN3 строго регулируется микроРНК и метилированием его промотора. Однако это не объясняет, как обеспечивается внутриклеточная специфичность активности фермента. Наиболее вероятное объяснение механизма регуляции заключается в том, что она опосредована специфическим распознаванием последовательности мРНК, трансляция которой регулируется. При таком сценарии MKRN3 должен обладать способностью взаимодействовать с РНК напрямую, хотя это ещё предстоит подтвердить.

MKRN4

Mkrn4, как и Mkrn2, появился в ходе масштабной дупликации генома, специфичной для позвоночных. Оба этих гена расположены в древних дуплицированных областях в геномах тетрапод и рыб. Интересно, что Mkrn4 отсутствует у мышей и крыс, что позволяет предположить его потерю в линии, ведущей к мышиным грызунам [48].

Было показано, что у высших позвоночных, таких как птицы и млекопитающие, Mkrn4 экспрессируется на высоком уровне в нескольких органах, таких как семенники, мышцы и лёгкие. В то же время представители лучепёрых рыб демонстрируют гонадоспецифичные паттерны экспрессии Mkrn4 [48]. Что ещё более интересно, у лучепёрых рыб материнская копия Mkrn4 экспрессируется до активации зиготического генома [48].

Структура MKRN4 включает RING-домен и три цинковых пальца C3H, характерные для семейства. В отличие от MKRN1–3, природа и количество цинковых пальцев в MKRN4 гораздо более вариабельны, причём различия зависят от конкретной линии [48]. Ещё одной особенностью последовательности MKRN4 является отсутствие мотива, богатого цистеином и гистидином (CH) [48].

Единственной известной мишенью убиквитинилирования MKRN4, которая необходима для активации Т-клеток, является С-концевой CNH-домен GLK. Было показано, что индуцированная MKRN4 деградация GLK предохраняет Т-клетки от гиперактивации, которая приводит к развитию системной красной волчанки [9].

РНК-Связывающая активность MKRN. В настоящее время всё чаще обнаруживают ферменты, которые связывают РНК-ассоциированные механизмы с убиквитин-опосредованной деградацией белков. Эти ферменты играют ключевую роль в различных биологических процессах, включая активацию сплайсосомы [97], ответ на повреждение ДНК, инициацию трансляции и регуляцию транскрипции [98]. В частности, было показано, что MKRN влияют на два последних процесса. Однако данных об их РНК-связывающей функции недостаточно.

На сегодняшний день доказано, что три из четырёх ферментов этого семейства являются компонентами рибонуклеопротеиновых комплексов. Было показано, что MKRN1 и MKRN3 связываются с PABPC1, задействуя PAM2-подобный мотив [20, 21, 83]. Наличие PAM2-подобного мотива у MKRN4 указывает на то, что он также может быть частью аналогичного рибонуклеопротеинового комплекса, хотя это ещё предстоит изучить. Примечательно, что несмотря на очевидное сходство последовательностей и организации доменов белков, в составе этих комплексов они проявляют различные свойства. MKRN1 функционирует как глобальный сенсор трансляционных ошибок и запускает ККР [46], а MKRN3 убиквитинилирует PABPC1, тем самым дестабилизируя мРНК [83]. В отличие от остальных членов семейства, MKRN2 не имеет PAM2-подобного мотива и в основном связан с GLE1-содержащим комплексом ядерного экспорта мРНК [24].

Только для двух ферментов (MKRN1 и MKRN2) было продемонстрировано прямое взаимодействие с РНК. Примечательно, что оба фермента предпочитают связываться в области 3′UTR [24, 46]. Кроме того, были охарактеризованы мотивы связывания обоих ферментов, и выяснилось, что для связывания MKRN1 требуется участок поли(А) длиной не менее восьми нуклеотидов [46], тогда как MKRN2 проявляет сродство к регионам, богатым CU [24]. Однако функции других компонентов рибонуклеопротеинового комплекса в определении специфичности узнавания РНК MKRN остаются неясными. Например, РНК-связывающая активность MKRN1 значительно усиливается PABPC1. Более того, мотив узнавания, определённый для MKRN1, в точности соответствует таковому у RRM (РНК-распознающий мотив) домена PABP [99]. Это указывает на то, что несмотря на способность MKRN связывать РНК, специфичность их узнавания может определяться преимущественно другими белками, входящими в состав рибонуклеопротеиновых комплексов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение следует отметить, что все члены семейства белков MKRN обладают доменом RING finger и катализируют реакцию E3-убиквитинлигазы. MKRN2–4 появились в результате дупликаций генома и активности ретротранспозонов, поэтому MKRN демонстрируют высокую эволюционную консервативность. MKRN являются примером высокоорганизованных молекулярных машин, выполняющих множество функций в клетке. Более того, мишенями MKRN являются не только эукариотические, но и прокариотические и вирусные белки, и эти убиквитинлигазы широко распространены в различных царствах живых организмов, что делает их важными участниками клеточного метаболизма. Наиболее широкая биологическая функция описана для MKRN1: он модулирует длину теломер, опосредует деградацию ряда вирусных белков, участвует в апоптозе и клеточном метаболизме. MKRN2 известен тем, что отрицательно регулирует воспалительный ответ и контролирует пролиферацию клеток, однако его эффекты могут быть противоречивыми. MKRN3 известен своей тканеспецифичной экспрессией, зависящей от периода онтогенеза, и отрицательной регуляцией полового созревания. MKRN4 способствует нормальному функционированию и активации Т-клеток. Кроме того, собранные данные выявили существенную роль всех MKRN в развитии различных заболеваний, что делает их потенциальными мишенями для создания новых терапевтических подходов.

Также интересно рассмотреть РНК-связывающую функцию, описанную для MKRN. Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что MKRN1, MKRN2 и MKRN3 являются компонентами рибонуклеопротеиновых комплексов. Однако механизм, с помощью которого они распознают РНК, остаётся малоизученным. Кроме того, предстоит выяснить, обладают ли MKRN мотивами узнавания в принципе, или же специфичность их связывания определяется другими белками рибонуклеопротеиновых комплексов. Таким образом, имеющиеся данные и накопившиеся вопросы делают семейство белков MKRN интересным объектом для дальнейших исследований.

Вклад авторов. Е.Г. и М.Е. – написание и редактирование текста; В.С. – подготовка рисунков; О.Д. и А.Т. – обсуждение материала; П.С. – руководство работой, финансирование. Все авторы ознакомились с текстом работы и согласились опубликовать текущую версию манускрипта.

Финансирование. Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 24-14-00048).

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания проведённых авторами исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Sobre autores

E. Guseva

Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology; Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; Lomonosov Moscow State University

Autor responsável pela correspondência
Email: eguseva98@mail.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, 143025 Skolkovo; 119992 Moscow; 119991 Moscow

M. Emelianova

Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology; Lomonosov Moscow State University

Email: eguseva98@mail.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, 143025 Skolkovo; 119991 Moscow

V. Sidorova

Lomonosov Moscow State University

Email: eguseva98@mail.ru

Faculty of Bioengineering and Bioinformatics

Rússia, 119234 Moscow

A. Tyulpakov

Bochkov Research Centre of Medical Genetics

Email: eguseva98@mail.ru
Rússia, 115522 Moscow

O. Dontsova

Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology; Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; Lomonosov Moscow State University; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: eguseva98@mail.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, 143025 Skolkovo; 119992 Moscow; 119991 Moscow; 117997 Moscow

P. Sergiev

Center of Life Sciences, Skolkovo Institute of Science and Technology; Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; Lomonosov Moscow State University

Email: petya@genebee.msu.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, 143025 Skolkovo; 119992 Moscow; 119991 Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares