Specificity of Photochemical Energy Conversion in Photosystem I from the Green Microalga Chlorella ohadii

Full Text

Принятые сокращения: РЦ – реакционный центр; ССА – светособирающая антенна; ФС1 – фотосистема 1; Хл – хлорофилл; EADS – эволюционно-ассоциированные дифференциальные спектры; LHCI – светособирающий антенный комплекс I.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время интерес многих исследователей в области первичных процессов фотосинтеза привлечен к изучению фотосинтезирующих организмов, обитающих в экстремальных экологических условиях. Такие условия могут включать, в частности, низкую и высокую освещенность, температуру, влажность и спектральный состав света. Большой интерес представляет изучение структуры и функций пигмент-белковых комплексов фотосистемы 1 (ФС1) из организмов, живущих при исключительно высокой освещенности. Одним из таких организмов является зеленая водоросль Chlorella ohadii, обнаруженная в почве пустыни Негев и способная к фотосинтезу в условиях чрезвычайно высокой освещенности (~2000 мкЭ) [1]. В недавней работе израильских и немецких ученых [2] была выделена и подробно охарактеризована ФС1 из C. ohadii. С помощью криоэлектронной микроскопии с разрешением 2,7 Å были получены структуры ФС1 из клеток, выращенных при низкой (40–100 мкЭ, ФС1_LL) и при высокой (2500 мкЭ, ФС1_HL) освещенности. Было показано, что ФС1_LL состоит из 24 пигмент-белковых субъединиц, объединенных в четыре структурных компартмента: основной комплекс, включающий реакционный центр (РЦ) и внутреннюю (интегральную) светособирающую антенну (ССА); пару внешних светособирающих антенных комплексов I (LHCI), расположенных в виде двух опоясывающих колец вблизи донорного участка РЦ, и один димерный комплекс LHCI, локализованный вблизи от акцепторного участка РЦ. Наиболее заметные различия в структурах комплексов ФС1_LL и ФС1_HL касаются внешней ССА. LHCI_HL содержит значительно меньше хлорофилла (Хл) b, чем LHCI_LL: в большинстве субъединиц LHCI_HL хотя бы одна молекула Хл b заменялась Хл а. Последовательности аминокислот в LHCI ФС1_LL из C. ohadii были высоко гомологичны последовательностям LHCI из эталонной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. При этом расположение четырех субъединиц LHCI было идентично расположению в ФС1 растений, а оставшихся шести – расположению в зеленых водорослях Chl. reinhardtii и Bryopsis corticulans [3–6].

Для изучения механизма переноса энергии и первичного разделения зарядов в фотосинтетических комплексах ФС1 широко используются методы широкополосной фемтосекундной спектроскопии «возбуждение-зондирование» [7–9]. Изучение реакций разделения зарядов в ФС1 цианобактерий затруднено наличием внутренней (интегральной) ССА, которая содержит примерно 90 молекул Хл a [10, 11]. У водорослей и высших растений ССА ФС1 включает также дополнительные периферические субъединицы, поэтому стехиометрия пигментного состава в этих структурах составляет 200–250 молекул Хл a и Хл b на РЦ [12, 13]. В работах Holzwarth et al. [14–16] первичные фотохимические реакции ФС1 из водоросли Chl. reinhardtii изучались, в частности, методом широкополосной фемтосекундной спектроскопии. Авторами было предположено, что в этом комплексе фотохимические реакции могут протекать по двум механизмам в зависимости от длины волны возбуждения. Возбуждение в красный край полосы Qy на длине волны 700 нм затрагивало непосредственно пигменты РЦ, что позволило авторам оценить характерное время первичной реакции разделения зарядов, которое по их интерпретации получилось равным 3–5 пс [15, 16].

Комплексы ФС1, выделенные из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 и Thermosynechococcus elongatus, не содержат периферических светособирающих субъединиц [10, 11]. При возбуждении этих комплексов в области 670–680 нм абсорбционные изменения на временном интервале до 10 пс обусловлены процессами миграции энергии во внутренней ССА, а разделение зарядов с образованием первичной ион-радикальной пары лимитировано переносом энергии в РЦ и происходит со временем 35–40 пс [7, 17, 18]. При возбуждении этих комплексов с красного края полосы Qy в области 720–760 нм наблюдалось сверхбыстрое разделение зарядов на временном интервале ≤ 0,2 пс [19–21], что существенно быстрее оценок скорости первичных реакций, полученных для ФС1 из Chl. reinhardtii [14–16].

Настоящая работа является первой из серии работ, посвященных исследованию сверхбыстрой кинетики переноса энергии и разделения зарядов ФС1_LL из клеток C. ohadii, выращенных при низкой освещенности, с помощью лазерной фемтосекундной спектроскопии методом «возбуждение-зондирование». В работе проведено сравнение кинетики переходов спектральных интермедиатов ФС1_LL из C. ohadii с переходами в эталонной ФС1 из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. В дальнейшем планируется сравнение первичных процессов в ФС1_LL и ФС1_HL из клеток C. ohadii.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение комплексов ФС1 из клеток Chlorella ohadii, выращенных в условиях низкой освещенности. Комплексы ФС1 из C. ohadii были выделены, как описано в работе Caspy et al. [2]. Клетки выращивали при перемешивании и барботировании воздухом и CO₂ при 25 °C и освещении 50 мкЭ. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g, промывали буфером Tris-NaOH (30 мМ, pH 8,0), содержащим 10 мМ NaCl и 10% сахарозы, разрушали с помощью пресса Френча, затем получали мембранную фракцию и солюбилизировали, добавляя 1,5% (w/v) n-додецил-β-D-мальтозида (ДДМ). Суперкомплекс ФС1 получали путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (15–50% сахарозы, 20 мМ Tris-Tricin (pH 8,0), 300 мМ NaCl и 0,2% ДДМ) с использованием ротора SW-60 («Beckman», США) при 48 000 об/мин в течение 15 ч.

Выделение комплексов ФС1 из клеток цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803. Клетки выращивали в среде BG-11 и осаждали при 10 000 g в течение 15 мин. Разрушение клеток осуществляли с помощью Френч-пресса с последующим осаждением неразрушенных частиц при 3 000 g в течение 10 мин. Далее, супернатант (мембранные фрагменты) был инкубирован в присутствии 1% (w/v) ДДМ в течение 2 ч при 4 °С при концентрации хлорофилла 0,5 мг/мл. После центрифугирования при 14 000 g в течение 20 мин супернатант был нанесен на линейный градиент сахарозы (5–20% (w/v)) и далее был центрифугирован в течение 3 ч при 140 000 g на роторе VTi50 («Beckman») (закупленном с помощью Программы развития МГУ) в соответствии с процедурой, описанной ранее [22].

Сверхбыстрые абсорбционные изменения ΔA(λ_i, t_m) регистрировались методом широкополосной фемтосекундной лазерной спектроскопии «возбуждение-зондирование» в оптическом диапазоне 400 ≤ λ ≤ 850 нм на временных задержках t от 100 фс до 500 пс. Экспериментальная установка и методика измерений были описаны ранее [19]. Возбуждение ФС1 осуществлялось фемтосекундными лазерными импульсами с максимумом на длинах волн 660 нм (длительность – 40 фс, энергия – 0,8 нДж) и 715 нм (длительность – 37 фс, энергия – 4 нДж). Зондирование обеспечивалось широкополосными импульсами суперконтинуума при угле поляризации 54,7 градусов относительно поляризации возбуждающего импульса. Разностные спектры поглощения в диапазоне 400–850 нм снимали с помощью ПЗС-камеры Newton («Andor», США), соединенной с полихроматором Acton SP-300 («Thermo Fisher Scientific», США). Эксперименты проводились при температуре 6 °С в проточной оптической ячейке с длиной оптического пути 0,5 мм; диаметр области возбуждения – 0,2 мм; оптическая плотность образца составляла 10 единиц при оптическом пути 1 см. Скорость циркуляции в проточной ячейке (9 мл/мин) была достаточно высокой, чтобы избежать многократного возбуждения одного и того же объема пробы. Спектры корректировались дисперсией групповой задержки, как описано ранее [23, 24]. Учет когерентного артефакта и деконволюции аппаратной функции в области t = 0 проводился по методике, предложенной в работах Dobryakov et al. [23, 25] и Cherepanov et al. [26]. Экспериментальные данные для дифференциального спектра Хл a в тетрагидрофуране взяты из работы Cherepanov et al. [27].

Математический анализ абсорбционной динамики включал разложение спектрально-временных матриц ΔA(λ_l,t_m) на линейную комбинацию n дискретных экспоненциальных функций:

$Q\left[\tau \right]\left(\lambda ,t\right)=\sum _{k=1}^n{D}_k\left(\lambda \right)\cdot \exp \left(-t/{\tau }_k\right)+D_{n+1}\left(\lambda \right)$ (1)

в предположении, что характерные времена {τ_k} не зависят от длины волны наблюдения λ и, следовательно, могут рассматриваться как «глобальные» параметры, определяемые нелинейной минимизацией суммы квадратов отклонений теоретической модели от экспериментальных данных. Зависящие от длины волны предэкспоненциальные амплитуды D_k(λ), рассчитываемые стандартным методом линейной регрессии для каждой экспоненциальной функции k, определяют спектры, связанные с распадом (Decay-Associated Spectra, DAS), одновременно рассчитывается финальный спектр D_n+1(λ). После определения характерных времен {τ_k} в соответствии с методикой, предложенной Stokkum et al. [28], рассчитывались дифференциальные спектры последовательных кинетических интермедиатов – эволюционно-ассоциированные дифференциальные спектры (evolution-associated difference spectra, EADS), представляющие собой разностные спектры интермедиатов, возникающих в последовательной кинетической модели:

$A_1\left(\lambda \right)\stackrel{{\tau }_1}{\to }{A}_2\left(\lambda \right)\stackrel{{\tau }_2}{\to }{A}_3\left(\lambda \right)\stackrel{{\tau }_3}{\to }\dots \stackrel{{\tau }_n}{\to }{A}_{n+1}\left(\lambda \right)$. (2)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рис. 1 спектр поглощения комплексов ФС1 из микроводосли C. ohadii сравнивается со спектром ФС1 из цианобактерии Synechocystis 6803. Пигментный комплекс ФС1 цианобактерии включает только внутреннюю (интегральную) ССА, ее пигменты окружают кофакторы электрон-транспортной цепи. Мономер ФС1 из Synechocystis 6803 содержит 96 молекул Хл a и 20 молекул β-каротина, а также 3 молекулы кантаксантина и эхиненона [29]. Комплекс ФС1 из C. ohadii, помимо интегральной антенны, включает 10 периферических подвижных светособирающих субъединиц, в целом, на один РЦ этой ФС1 приходится 208 молекул Хл a, 47 молекул Хл b, 32 молекулы β-каротина, а также 30 молекул других каротиноидов (21 – лютеин, 4 – виолаксантин, 2 – астаксантин, 2 – β-криптоксантин, 1 – эхиненон), поглощающих в области 470–520 нм [2]. Поглощение ФС1 из C. ohadii в области полосы Qy обусловлено преимущественно Хл a. В спектре полосы Qy можно выделить фракции с максимумом около 671 нм (40%), 685 нм (54%) и 704 нм (6%), в то время как Хл b вносит лишь небольшой вклад в полосу поглощения Qy в области 650–660 нм (рис. 1). Примечательно, что модельный спектр Хл a, рассчитанный для ФС1 из C. ohadii в области полосы Qy (штрих-пунктир), хорошо воспроизводит спектр поглощения ФС1 из Synechocystis 6803 (сплошная красная линия). Отличие двух спектров состоит в том, что длинноволновый край полосы Qy спектра ФС1 из C. ohadii сдвинут на ~5 нм в красную сторону относительно спектра ФС1 из Synechocystis 6803. Однако при этом асимптотический спад спектра ФС1 из C. ohadii в области 710–760 нм, построенный в полулогарифмических координатах, совпадает с поглощением ФС1 из Synechocystis 6803 (вставка на рис. 1).

 

Рис. 1. Сравнение спектров поглощения ФС1 из водоросли C. ohadii (1) и цианобактерии Synechocystis 6803 (2). Спектр ФС1 из C. ohadii аппроксимирован суммой спектров Хл a (3), Хл b (4) и бета-каротина (5) по методике из работы Cherepanov et al. [26]. Относительные вклады Хл a и Хл b в модельный спектр (6) составляют 90% и 10% соответственно. В области 600–750 нм представлены три фракции Хл a с максимумами в полосе Qy на 671 нм (3а – 40%), 685 нм (3б – 54%) и 705 нм (3в – 6%). На вставке показан красный край спектров в логарифмическом масштабе

 

Фотоиндуцированные изменения поглощения ФС1 из C. ohadii, вызванные возбуждением с синего и красного краев полосы Qy на длинах волн 660 и 715 нм, представлены на рис. 2, а и б соответственно.

 

Рис. 2. Спектральные изменения ФС1 из C. ohadii вблизи полосы Qy, инициированные возбуждением с максимумом на 660 нм (а) и 715 нм (б). Шкала амплитуд показана справа от цветовых карт

 

Возбуждение на 660 нм затрагивало преимущественно фракции Хл a антенны с максимумом около 670 нм (синяя кривая на рис. 1), а последующий перенос возбуждения в область основной полосы 685 нм происходил на временной шкале 0,1–1 пс (сдвиг полосы выцветания Qy представлен на рис. 2, а синим цветом). Установление равновесия с длинноволновыми формами Хл антенны, поглощающими в области 700 нм, происходило на временном интервале 3–10 пс, что видно по уширению области выцветания в этом временном диапазоне. Наконец, перенос энергии в РЦ и разделение зарядов с образованием ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ происходило на временной шкале 40–100 пс. Спектральным маркером катиона P₇₀₀+ является появление двух полос выцветания с локальными минимумам около 686 и 700 нм, тогда как образование аниона филлохинона A₁− не вызывает заметных изменений поглощения в области полосы Qy [30].

Возбуждение ФС1 из C. ohadii с красного края полосы Qy с центром на длине волны 715 нм затрагивало преимущественно длинноволновую фракцию Хл a антенны с максимумом около 705 нм (красная кривая на рис. 1). В этих условиях установление равновесия в светособирающих комплексах происходило на временной шкале 1–3 пс, что видно по сдвигу полосы выцветания на рис. 2, б в область коротких длин волн. Образование ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ в этих условиях возбуждения происходило заметно быстрее – во временном диапазоне 20–50 пс.

Количественный анализ спектральной динамики был проведен методом глобального разложения на экспоненциальные компоненты (1) с помощью последовательной кинетической модели (2). Последовательная модель позволяет качественно описать установление равновесия между различными фракциями Хл в антенне и лимитированное переносом энергии разделение зарядов в РЦ. На рис. 3 приведены спектры EADS комплексов из C. ohadii и Synechocystis 6803, полученные при возбуждении ФС1 в синий край полосы Qy на длинах волн 660 и 680 нм соответственно.

 

Рис. 3. Дифференциальные спектры последовательных кинетических интермедиатов (EADS) ФС1 из C. ohadii (а, б) и Synechocystis 6803 (в, г) в области Соре (а, в) и вблизи полосы Qy (б, г). Возбуждение на длинах волн 660 нм (C. ohadii) и 680 нм (Synechocystis 6803). Характерные времена переходов τ_i и соответствующие им спектры A_i(λ) получены с помощью нелинейной многоэкспоненциальной деконволюции

 

Аналогичные спектры, полученные при возбуждении ФС1 с красного края полосы Qy на длине волны 715–720 нм приведены на рис. 4.

 

Рис. 4. Спектры EADS ФС1 из C. ohadii (а, б) и Synechocystis 6803 (в, г) в области Соре (а, в) и вблизи полосы Qy (б, г). Возбуждение на длинах волн 715 нм (C. ohadii) и 720 нм (Synechocystis 6803). Характерные времена переходов τ_i и соответствующие им спектры A_i(λ) получены с помощью нелинейной многоэкспоненциальной деконволюции

 

Для интерпретации наблюдаемых спектральных интермедиатов важную информацию предоставляет разностный спектр возбужденного состояния S₁ мономера Хл a в растворе тетрагидрофурана (рис. 5), помогающий выделить в спектрах EADS маркеры возбужденного состояния молекул Хл. К числу особенностей разностного спектра S₁ можно отнести следующие:

 

Рис. 5. Дифференциальный спектр возбужденного состояния мономера Хл a в растворе тетрагидрофурана

 

(i) полоса выцветания Qy с минимумом на 668 нм, обусловленная исчезновением основного состояния и появлением стимулированного излучения, имеет полуширину 20 нм (горизонтальная отметка на рис. 5) и амплитуду, примерно равную амплитуде выцветания полосы Соре в области 435–450 нм;

(ii) в области 730 нм наблюдается дополнительная отрицательная полоса стимулированного излучения (отмечена направленной вверх стрелкой), обусловленная сопряжением перехода S₁→S₀ с возбуждением вибронных колебаний макроцикла Хл;

(iii) в области 770 нм наблюдается положительная полоса поглощения возбужденного состояния (отмечена направленной вниз стрелкой), обусловленная переходом S₁→S_n на более высокий электронный уровень возбужденного Хл;

(iv) в области 460–500 нм спектр поглощения возбужденного состояния Хл представляет собой широкую полосу, не имеющую выраженной структуры; используя указанные маркеры, можно проводить интерпретацию наблюдаемых спектров EADS.

Как следует из рис. 3, а и б, при возбуждении ФС1 из C. ohadii на длине волны 660 нм переходные спектры на временных задержках до 25 пс (представлены темно-красной, красной и оранжевой линиями) соответствуют спектру возбужденного Хл a: его характерными маркерами являются выцветание вибронной полосы в области 740–750 нм и появление широкой положительной полосы в области 780–840 нм (вертикальные стрелки на рис. 3, б). Эволюция спектров в этом интервале отражает миграцию энергии к длинноволновым формам Хл антенны. Наиболее значимые абсорбционные изменения, обусловленные образованием ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻, могут быть описаны двумя экспоненциальными переходами с характерными временами 25 и 120 пс. По всей видимости, различные компартменты ССА передают энергию в РЦ с различной скоростью, поэтому результирующая кинетика не является моноэкспоненциальной. Уменьшение общей амплитуды выцветания в области полосы Соре (440 нм) и полосы Qy (690 нм) коррелирует с исчезновением маркеров возбужденного состояния (полосы стимулированного излучения на 740–750 нм и положительной полосы поглощения на 780–840 нм), а также характеризуется появлением маркера поглощения катиона P₇₀₀⁺ на 450 нм (вертикальная стрелка на рис. 3, а). Наиболее вероятная интерпретация последней особенности – электрохромный сдвиг полос Соре молекул Хл РЦ под действием электрического поля ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻.

На рис. 3, в и г приведены аналогичные спектры EADS для ФС1 из Synechocystis 6803 после возбуждении на длине волны 680 нм. На временных задержках до 2 пс переходные спектры, в целом, соответствуют спектру возбужденного Хл и близки к аналогичным спектрам ФС1 из C. ohadii. Переходный спектр A₃(λ), образующийся с характерным временем τ₂ = 2,8 пс (зеленая линия), характеризуется следующими особенностями: появляется длинноволновая полоса выцветания с минимумом на 705 нм; амплитуда основной полосы выцветания на 688 нм уменьшается вдвое; примерно вдвое уменьшается амплитуда выцветания вибронной сателлитной полосы на 750 нм; полоса поглощения возбужденного состояния в области 780–840 нм не меняется; полоса выцветания в области Соре (440–445 нм) практически не меняется, в то время как поглощение возбужденного состояния в области 460–500 нм уменьшается. В совокупности эти изменения могут быть объяснены возникновением в РЦ переходных состояний, в которых возбужденные экситон-сопряженные молекулы Хл РЦ (P₇₀₀A₀)* смешаны с состояниями разделенных зарядов P₇₀₀⁺A₀⁻ [20, 31]. Перенос электрона на хинонный акцептор и образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ в ФС1 из Synechocystis 6803 происходит с характерным временем 31 пс.

На рис. 4, а и б приведены спектры EADS для ФС1 из C. ohadii после возбуждения с красного края полосы Qy в области 715 нм. На временных задержках до 7 пс спектральные изменения могут быть приписаны установлению равновесия с участием коротковолновых форм Хл антенны. Переходный спектр A₃(λ), образующийся с характерным временем τ₂ = 7 пс (зеленая линия), имеет признаки образования ион-радикальных состояний: уменьшаются амплитуды полосы выцветания на 690 нм и сателлитной полосы на 750 нм, а также полосы в области Соре 440 нм. Кроме того, увеличивается поглощение в области 455 нм, что является признаком появления катиона P₇₀₀+. Процесс разделения зарядов в этом варианте возбуждения ФС1 завершается переходом с характерным временем τ₃ = 73 пс.

На рис. 4, в и г приведены спектры EADS для ФС1 из Synechocystis 6803 после возбуждения с красного края полосы Qy в области 720 нм. В этих условиях возбуждения начальный переходный спектр A₁(λ) на временных задержках до 0,38 пс (темно-красная линия) близок по форме к спектру A₃(λ), образующемуся со временем τ₂ = 2,8 пс после возбуждения ФС1 из Synechocystis 6803 на 680 нм (рис. 3, в и г; зеленая линия). Переходный спектр A₁(λ) в области полосы Qy характеризуется двумя минимумами (при 690 и 704 нм) с амплитудой вдвое меньшей амплитуды начальной полосы выцветания при возбуждении на 680 нм (рис. 3, г; темно-красная линия). При этом выцветание вибронной полосы на 750 нм и поглощение возбужденного состояния в области 780–840 нм незначительно. Спектр выцветания полосы Соре и поглощения возбужденного состояния в области 460–500 нм хорошо соответствует переходному спектру A₃(λ), образующемуся с характерным временем τ₂ = 2,8 пс при возбуждении на 680 нм (рис. 3, в и г; зеленая линия). Таким образом, данные результаты подтверждают сделанный ранее вывод о непосредственном возбуждении реакционного центра ФС1 и образовании в нем смешанных состояний с разделенными зарядами P₇₀₀⁺A₀⁻ при возбуждении в области 720 нм [19, 20]. Образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ в ФС1 из Synechocystis 6803 в этих условиях происходит с характерным временем 25 пс.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе спектральные изменения ФС1 из микроводоросли C. ohadii, индуцированные возбуждением с синего и красного края полосы поглощения Qy, сравниваются с аналогичными изменениями ФС1 из цианобактерии Synechocystis 6803. При возбуждении ФС1 из C. ohadii на длине волны 660 нм спектральная динамика во временном интервале до 25 пс отражает перераспределение энергии в светособирающих субъединицах комплекса; образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀+A₁− в этих условиях лимитируется переносом энергии в РЦ из двух пулов антенных комплексов с характерными временами 25 и 120 пс соответственно. В аналогичных условиях перенос энергии в РЦ ФС1 из Synechocystis 6803 происходит существенно быстрее: в ~30% комплексов энергия попадает в РЦ со временем 3 пс, что вызывает образование первичных ион-радикальных пар; в остальной части комплексов возбуждение РЦ и формирование состояния P₇₀₀+A₁− происходит со временем 31 пс. Сходные фотохимические реакции в ФС1 из Synechocystis 6803 наблюдались ранее [7, 17, 18].

При альтернативном варианте возбуждения ФС1 из C. ohadii в красный край полосы Qy на длине волны 715 нм в 50% комплексов наблюдается разделение зарядов с характерным временем 7 пс, в остальных 50% − разделение зарядов и образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀+A₁− контролируется переносом энергии с характерным временем около 70 пс. В аналогичных условиях в ФС1 из Synechocystis 6803 в половине комплексов наблюдается сверхбыстрое (кинетически неразрешимое) разделение зарядов, последующая стабилизация и образование ион-радикальной пары P₇₀₀+A₁− происходит со временем 25 пс [19].

Наблюдаемые различия в скорости образования ион-радикальных пар между комплексами ФС1 из двух организмов, по-видимому, связаны с различиями в их структуре. Центральная часть комплекса имеет единый план строения у всех кислород-выделяющих организмов, однако комплексы ФС1 хлоропластного типа, характерные для зеленых водорослей и высших растений, окружены внешней антенной из 8–10 пигмент-белковых комплексов LHCI. Поэтому в ФС1 из цианобактерии Synechocystis 6803 на один реакционный центр приходится 90 молекул Хл а ССА, а в зеленой водоросли C. ohadii – 202 молекулы Хл а и 47 молекул Хл b. В связи с этим возникает вопрос, типично ли такое медленное разделение зарядов для всех комплексов ФС1 хлоропластного типа.

Первичные фотохимические процессы были ранее исследованы в работах Holzwarth et al. [14–16] в ФС1 из зеленой водоросли Chl. reinhardtii. Для корректного сопоставления спектральной динамики ФС1 из C. ohadii с картами плотности континуального распределения характерных времен, опубликованными ранее [14–16], аналогичные карты распределения характерных времен были рассчитаны методом обратного преобразования Лапласа [32] с помощью программы CONTIN [33]. На рис. 6 приведены результаты континуального разложения фотодинамики в области полосы Qy, представленной на рис. 2.

 

Рис. 6. Карты континуального распределения времен жизни переходной кинетики поглощения ФС1 из C. ohadii, построенные обратным преобразованием Лапласа с помощью программы CONTIN [33] по данным, представленным на рис. 2. Возбуждение на 660 нм (а) и 715 нм (б). Области уменьшения и увеличения поглощения отмечены синим и красным цветом в соответствии со шкалой, размещенной справа от карты

 

Главными особенностями распределения положительных и отрицательных областей на карте плотности характерных времен для динамики ФС1 из Chl. reinhardtii при возбуждении на 670 нм является перенос возбуждения в длинноволновую сторону во временных диапазонах 0,1, 0,6 и 5 пс, а также увеличение поглощения в области полосы выцветания 685 нм со временем 25 пс (см. рис. 3, A в работе Müller et al. [14]). Близкие кинетические компоненты наблюдаются и в динамике ФС1 из C. ohadii при возбуждении на 660 нм: перенос возбуждения в длинноволновую сторону происходит с характерными временами 0,1, 0,8 и 5 пс, а увеличение поглощения в области полосы 690 нм происходит с характерным временем 30 пс (рис. 6, а). Однако, в отличие от Chl. reinhardtii, в динамике ФС1 из C. ohadii наблюдается также фракция комплексов, в которых перенос энергии в реакционный центр и сопряженное с этим увеличение поглощения полосы 690 нм происходит со временем ~150 пс. Основные переходы на картах континуального разложения в четырех временных диапазонах: 0,8 пс, 5 пс, 30 пс и 150 пс (рис. 6, а) хорошо совпадают с результатами дискретного разложения (рис. 3, а и б).

При возбуждении ФС1 из Chl. reinhardtii на длине волны 700 нм наблюдались кинетические компоненты переноса энергии в коротковолновую сторону с характерными временами 0,2 и 1 пс, а также увеличение поглощения в области полосы выцветания 685 нм, обусловленное образованием ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ (см. рис. 3, B в работе Müller et al. [14] и аналогичные карты распределения в работах Holzwarth et al. [15, 16]). Кроме того, небольшую по амплитуде компоненту с характерным временем 7 пс авторы интерпретировали как первичную реакцию разделения зарядов [14–16].

В фотодинамике ФС1 из C. ohadii при возбуждении на 715 нм перенос возбуждения в коротковолновую сторону происходит со временем 1–2 пс (рис. 4, б и 6, б), что несколько медленнее по сравнению с ФС1 из Chl. reinhardtii. Это отличие может быть связано с более длинноволновым характером возбуждения в данной работе. На карте плотности во временном диапазоне 7–11 пс наблюдается увеличение поглощения в области полосы выцветания 690 нм (рис. 6, б), которое коррелирует с увеличением поглощения в области 750 нм, увеличением поглощения в области Соре (430–450 нм) и уменьшением поглощения в области 460–500 нм на спектрах EADS (рис. 4, а и б). Все вместе позволяет отнести наблюдаемые изменения к реакции разделения зарядов, что согласуется с интерпретацией компоненты 7 пс, предложенной ранее [14–16]. Однако в фотодинамике ФС1 из C. ohadii при возбуждении на 715 нм не наблюдается компонент в диапазоне 25–30 пс, но присутствует более медленная компонента со временем 70 пс (рис. 6, б), которая отсутствует как в карте распределения ФС1 из Chl. reinhardtii (рис. 3, B в работе Müller et al. [14]), так и в динамике поглощения ФС1 из Synechocystis 6803 (рис. 4, г). Однако спектр EADS компоненты 7 пс на рис. 4, б не содержит локального минимума в области 705 нм, характерного для первичной ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₀⁻ (см. рис. 4, г и работы Shelaev et al. [19] и Cherepanov et al. [20]), поэтому механизм разделения зарядов с характерным временем 7 пс в ФС1 из C. ohadii требует дальнейшего изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе спектральные изменения ФС1 из микроводоросли C. ohadii, индуцированные возбуждением с синего и красного края полосы поглощения Qy, сравниваются с аналогичными изменениями ФС1 из цианобактерии Synechocystis 6803. При возбуждении ФС1 из C. ohadii на длине волны 660 нм спектральная динамика во временном интервале до 25 пс отражает перераспределение энергии в светособирающих субъединицах комплекса; образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀+A₁− в этих условиях лимитируется переносом энергии в РЦ из двух пулов антенных комплексов с характерными временами 25 и 120 пс соответственно. В аналогичных условиях перенос энергии в РЦ ФС1 из Synechocystis 6803 происходит существенно быстрее: в ~30% комплексов энергия попадает в РЦ со временем 3 пс, что вызывает образование первичных ион-радикальных пар; в остальной части комплексов возбуждение РЦ и формирование состояния P₇₀₀⁺A₁⁻ происходит со временем 31 пс.

При альтернативном варианте возбуждения ФС1 из C. ohadii в красный край полосы Qy на длине волны 715 нм в 50% комплексов наблюдается разделение зарядов с характерным временем 7 пс, в остальных 50% комплексов разделение зарядов и образование стабильной ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ контролируется переносом энергии с характерным временем около 70 пс. Сходная фотодинамика ФС1 из Synechocystis 6803 при возбуждении на длине волны 720 нм описана ранее [19].

Сравнение кинетики переноса энергии возбуждения и переноса зарядов в ФС1 из микроводорослей C. ohadii и Chl. reinhardtii демонстрирует их заметное сходство. Однако в кинетике переноса энергии в ФС1 из C. ohadii имеются более медленные компоненты, вероятно, обусловленные различием в структуре этих комплексов. В целом, полученные данные свидетельствуют, что реакции разделения зарядов в ФС1 всех анализируемых организмов при возбуждении ССА лимитированы переносом возбуждения в РЦ, при этом скорость переноса энергии и образование ион-радикальной пары P₇₀₀⁺A₁⁻ замедляется в ряду Synechocystis 6803 → Chl. reinhardtii → C. ohadii. При непосредственном возбуждении ФС1 цианобактерии Synechocystis 6803 в красный край полосы Qy наблюдаются сверхбыстрые процессы разделения зарядов в экситонно-сопряженной системе кофакторов РЦ. Сравнение ФС1 из цианобактерий и зеленых водорослей показывает, что размер антенны существенно ограничивает скорость образования ион-радикальной пары. Несмотря на сходный общий размер и близкую структуру ФС1 из C. ohadii и Chl. reinhardtii, ССА из C. ohadii включает длинноволновую фракцию Хл a, перенос энергии возбуждения от которой в РЦ происходит во временном диапазоне 150 пс.

Вклад авторов. Д.А. Черепанов – анализ результатов спектральных измерений, написание текста; М.С. Фадеева – выращивание культуры клеток C. ohadii, выделение из них комплексов ФС1; А.А. Петрова – характеризация препаратов ФС1; Ф.Е. Гостев, И.В. Шелаев – проведение фемтосекундных измерений; В.А. Надточенко – концепция работы; А.Ю. Семенов – написание и редактирование текста, руководство работой.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-74-10085).

Благодарности. В работе использовано оборудование (фемтосекундная установка) Центра коллективного пользования ФИЦ ХФ РАН «Анализ химических, биологических систем и природных материалов: масс-спектральная микроскопия и фемтосекундная лазерная микроскопия-спектроскопия» (рег. номер: 506694).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

D. A. Cherepanov

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: tscherepanov@gmail.com
Russian Federation, Moscow; Moscow

A. A. Petrova

Lomonosov Moscow State University

Email: tscherepanov@gmail.com
Russian Federation, Moscow

M. S. Fadeeva

Tel Aviv University

Email: tscherepanov@gmail.com
Israel, Tel Aviv

F. E. Gostev

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Email: tscherepanov@gmail.com
Russian Federation, Moscow

I. V. Shelaev

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Email: tscherepanov@gmail.com
Russian Federation, Moscow

V. A. Nadtochenko

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: tscherepanov@gmail.com
Russian Federation, Moscow; Moscow

A. Yu. Semenov

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: semenov@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files