Постинтеграционная репарация ВИЧ-1 сопряжена с активацией клеточных протеинкиназ DNA-PK и ATM и фосфорилированием их мишеней

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Интеграция ДНК копии генома ВИЧ-1 в клеточный геном приводит к появлению в нем ряда повреждений, репарация которых абсолютно необходима для успешной репликации вируса. Ранее мы показали, что клеточные протеинкиназы ATM и DNA-PK, которые в норме обеспечивают репарацию двуцепочечных разрывов ДНК, важны для инициации процесса постинтеграционной репарации ВИЧ-1, несмотря на то что в результате интеграции не образуются двуцепочечные разрывы ДНК. В данной работе мы проанализировали изменение статуса фосфорилирования киназ ATM (pSer1981), DNA-PK (pSer2056) и родственной им киназы ATR (pSer428), а также их мишеней: Chk1 (pSer345), Chk2 (pThr68), H2AX (pSer139) и p53 (pSer15), в процессе постинтеграционной репарации ВИЧ-1. Мы показали, что ATM и DNA-PK, но не ATR, автофосфорилируются в ходе постинтеграционной репарации, а также фосфорилируют белки-мишени Chk2 и H2AX, что указывает на общность механизмов сигналинга при репарации двуцепочечных разрывов ДНК и постинтеграционной репарации ВИЧ-1.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. Н. Анисенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: a_anisenko@mail.ru
Россия, Москва

А. А. Нефедова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: a_anisenko@mail.ru
Россия, Москва

И. И. Киреев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: a_anisenko@mail.ru
Россия, Москва

М. Б. Готтих

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: a_anisenko@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Lesbats, P., Engelman, A. N., and Cherepanov, P. (2016) Retroviral DNA Integration, Chem. Rev., 116, 12730-12757, https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.6b00125.
  2. Vincent, K. A., York-Higgins, D., Quiroga, M., and Brown, P. O. (1990) Host sequences flanking the HIV provirus, Nucleic Acids Res., 18, 6045-6047, https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6045.
  3. Vink, C., Groenink, M., Elgersma, Y., Fouchier, R. A., Tersmette, M., and Plasterk, R. H. (1990) Analysis of the junctions between human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA and human DNA, J. Virol., 64, 5626-5627, https://doi.org/10.1128/jvi.64.11.5626-5627.1990.
  4. Княжанская Е. С., Шадрина О. А., Анисенко А. Н., Готтих М. Б. (2016) Роль ДНК-зависимой протеинкиназы в репликации ВИЧ-1, Мол. Биол., 50, 639-654.
  5. Анисенко А. Н., Готтих М. Б. (2019) Участие клеточных систем репарации ДНК в репликации ВИЧ-1, Мол. Биол., 53, 355-366.
  6. Skalka, A. M., and Katz, R. A. (2005) Retroviral DNA integration and the DNA damage response, Cell Death Differ., 12, 971-978, https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4401573.
  7. Daniel, R., Katz, R. A., and Skalka, A. M. (1999) A role for DNA-PK in retroviral DNA integration, Science, 284, 644-647, https://doi.org/10.1126/science.284.5414.644.
  8. Daniel, R., Greger, J. G., Katz, R. A., Taganov, K. D., Wu, X., Kappes, J. C., and Skalka, A. M. (2004) Evidence that stable retroviral transduction and cell survival following DNA integration depend on components of the nonhomologous end joining repair pathway, J. Virol., 78, 8573-8581, https://doi.org/10.1128/JVI.78.16.8573-8581.2004.
  9. Smith, J. A., Wang, F. X., Zhang, H., Wu, K. J., Williams, K. J., and Daniel, R. (2008) Evidence that the Nijmegen breakage syndrome protein, an early sensor of double-strand DNA breaks (DSB), is involved in HIV-1 post-integration repair by recruiting the ataxia telangiectasia-mutated kinase in a process similar to, but distinct from, cellular DSB repair, Virol. J., 5, 11, https://doi.org/10.1186/1743-422X-5-11.
  10. Lau, A., Swinbank, K. M., Ahmed, P. S., Taylor, D. L., Jackson, S. P., Smith, G. C. M., and O’Connor, M. J. (2005) Suppression of HIV-1 infection by a small molecule inhibitor of the ATM kinase, Nat. Cell Biol., 7, 493-500, https://doi.org/10.1038/ncb1250.
  11. Knyazhanskaya, E., Anisenko, A., Shadrina, O., Kalinina, A., Zatsepin, T., Zalevsky, A., Mazurov, D., and Gottikh, M. (2019) NHEJ pathway is involved in post-integrational DNA repair due to Ku70 binding to HIV-1 integrase, Retrovirology, 16, 30, https://doi.org/10.1186/s12977-019-0492-z.
  12. Anisenko, A., Nefedova, A., Agapkina, Y., and Gottikh, M. (2023) Both ATM and DNA-PK are the main regulators of HIV-1 post-integrational DNA repair, Int. J. Mol. Sci., 24, 2797, https://doi.org/10.3390/ijms24032797.
  13. Blackford, A. N., and Jackson, S. P. (2017) ATM, ATR, and DNA-PK: the trinity at the heart of the DNA damage response, Mol. Cell, 66, 801-817, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.05.015.
  14. Anisenko, A. N., Knyazhanskaya, E. S., Zalevsky, A. O., Agapkina, J. Y., Sizov, A. I., Zatsepin, T. S., and Gottikh, M. B. (2017) Characterization of HIV-1 integrase interaction with human Ku70 protein and initial implications for drug targeting, Sci. Rep., 7, 5649, https://doi.org/10.1038/s41598-017-05659-5.
  15. Delelis, O., Carayon, K., Saïb, A., Deprez, E., and Mouscadet, J. F. (2008) Integrase and integration: biochemical activities of HIV-1 integrase, Retrovirology, 5, 114, https://doi.org/10.1186/1742-4690-5-114.
  16. Wu, X., Liu, H., Xiao, H., Conway, J. A., Hehl, E., Kalpana, G. V., Prasad, V., and Kappes, J. C. (1999) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein promotes reverse transcription through specific interactions with the nucleoprotein reverse transcription complex, J. Virol., 73, 2126-2135, https://doi.org/10.1128/JVI.73.3.2126-2135.1999.
  17. Stiff, T., O’Driscoll, M., Rief, N., Iwabuchi, K., Löbrich, M., and Jeggo, P A. (2004) ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation, Cancer Res., 64, 2390-2396, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-03-3207.
  18. Rothkamm, K., and Löbrich, M. (2003) Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5057-5062, https://doi.org/10.1073/pnas.0830918100.
  19. Menolfi, D., and Zha, S. (2020) ATM, ATR and DNA-PKcs kinases – the lessons from the mouse models: inhibition ≠ deletion, Cell Biosci., 10, 8, https://doi.org/10.1186/s13578-020-0376-x.
  20. Schlam‐Babayov, S., Bensimon, A., Harel, M., Geiger, T., Aebersold, R., Ziv, Y., and Shiloh, Y. (2021) Phosphoproteomics reveals novel modes of function and inter‐relationships among PIKKs in response to genotoxic stress, EMBO J., 40, e104400, https://doi.org/10.15252/embj.2020104400.
  21. Anisenko, A., Kan, M., Shadrina, O., Brattseva, A., and Gottikh, M. (2020) Phosphorylation targets of DNA-PK and their role in HIV-1 replication, Cells, 9, 1908, https://doi.org/10.3390/cells9081907.
  22. Bensimon, A., Schmidt, A., Ziv, Y., Elkon, R., Wang, S. Y., Chen, D. J., Aebersold, R., and Shiloh, Y. (2010) ATM-dependent and -independent dynamics of the nuclear phosphoproteome after DNA damage, Sci. Signal., 3, rs3, https://doi.org/10.1126/scisignal.2001034.
  23. Finzel, A., Grybowski, A., Strasen, J., Cristiano, E., and Loewer, A. (2016) Hyperactivation of ATM upon DNA-PKcs inhibition modulates p53 dynamics and cell fate in response to DNA damage, Mol. Biol. Cell, 27, 2360-2367, https://doi.org/10.1091/mbc.e16-01-0032.
  24. Schlam-Babayov, S., Ziv, Y., and Shiloh, Y. (2021) It takes three to the DNA damage response tango, Mol. Cell. Oncol., 8, 1881395, https://doi.org/10.1080/23723556.2021.1881395.
  25. Lu, H., Zhang, Q., Laverty, D. J., Puncheon, A. C., Augustine, M. M., Williams, G. J., Nagel, Z. D., Chen, B. P. C., and Davis, A. J. (2023) ATM phosphorylates the FATC domain of DNA-PKcs at threonine 4102 to promote non-homologous end joining, Nucleic Acids Res., 51, 6770-6783, https://doi.org/10.1093/nar/gkad505.
  26. Mladenov, E., Fan, X., Paul-Konietzko, K., Soni, A., and Iliakis, G. (2019) DNA-PKcs and ATM epistatically suppress DNA end resection and hyperactivation of ATR-dependent G2-checkpoint in S-phase irradiated cells, Sci. Rep., 9, 14597, https://doi.org/10.1038/s41598-019-51071-6.
  27. Liu, S., Opiyo, S. O., Manthey, K., Glanzer, J. G., Ashley, A. K., Amerin, C., Troksa, K., Shrivastav, M., Nickoloff, J. A., and Oakley, G. G. (2012) Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress, Nucleic Acids Res., 40, 10780-10794, https://doi.org/10.1093/nar/gks849.
  28. Zhou, Y., Lee, J. H., Jiang, W., Crowe, J. L., Zha, S., and Paull, T. T. (2017) Regulation of the DNA damage response by DNA-PKcs inhibitory phosphorylation of ATM, Mol. Cell, 65, 91-104, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.11.004.
  29. Kurosawa, A. (2021) Autophosphorylation and self-activation of DNA-dependent protein kinase, Genes, 12, 1091, https://doi.org/10.3390/genes12071091.
  30. Hsu, F. M., Zhang, S., and Chen, B. P. C. (2012) Role of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit in cancer development and treatment, Transl. Cancer Res., 1, 22-34, https://doi.org/10.3978/j.issn.2218-676X.2012.04.01.
  31. Lafont, F., Fleury, F., and Benhelli-Mokrani, H. (2020) DNA-PKcs Ser2056 auto-phosphorylation is affected by an O-GlcNAcylation/phosphorylation interplay, Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 1864, 129705, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2020.129705.
  32. Chen, B. P. C., Chan, D. W., Kobayashi, J., Burma, S., Asaithamby, A., Morotomi-Yano, K., Botvinick, E., Qin, J., and Chen, D. J. (2005) Cell cycle dependence of DNA-dependent protein kinase phosphorylation in response to DNA double strand breaks, J. Biol. Chem., 280, 14709-14715, https://doi.org/10.1074/jbc.M408827200.
  33. Bakkenist, C. J., and Kastan, M. B. (2003) DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation, Nature, 421, 499-506, https://doi.org/10.1038/nature01368.
  34. So, S., Davis, A. J., and Chen, D. J. (2009) Autophosphorylation at serine 1981 stabilizes ATM at DNA damage sites, J. Cell Biol., 187, 977-990, https://doi.org/10.1083/jcb.200906064.
  35. Yuan, Z., Guo, W., Yang, J., Li, L., Wang, M., Lei, Y., Wan, Y., Zhao, X., Luo, N., Cheng, P., Liu, X., Nie, C., Peng, Y., Tong, A., and Wei, Y. (2015) PNAS-4, an early DNA damage response gene, induces S phase arrest and apoptosis by activating checkpoint kinases in lung cancer cells, J. Biol. Chem., 290, 14927, https://doi.org/10.1074/jbc.M115.658419.
  36. Li, J., and Stern, D. F. (2005) Regulation of CHK2 by DNA-dependent protein kinase, J. Biol. Chem., 280, 12041-12050, https://doi.org/10.1074/jbc.M412445200.
  37. Boehme, K. A., Kulikov, R., and Blattner, C. (2008) p53 stabilization in response to DNA damage requires Akt/PKB and DNA-PK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 7785-7790, https://doi.org/10.1073/pnas.0703423105.
  38. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., and Prives, C. (1997) DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2, Cell, 91, 325-334, https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80416-X.
  39. Loughery, J., Cox, M., Smith, L. M., and Meek, D. W. (2014) Critical role for p53-serine 15 phosphorylation in stimulating transactivation at p53-responsive promoters, Nucleic Acids Res., 42, 7666-7680, https://doi.org/10.1093/nar/gku501.
  40. Podhorecka, M., Skladanowski, A., and Bozko, P. (2010) H2AX phosphorylation: its role in DNA damage response and cancer therapy, J. Nucleic Acids, 2010, 920161, https://doi.org/10.4061/2010/920161.
  41. Liu, S., Shiotani, B., Lahiri, M., Maréchal, A., Tse, A., Leung, C. C. Y., Glover, J. N. M., Yang, X. H., and Zou, L. (2011) ATR autophosphorylation as a molecular switch for checkpoint activation, Mol. Cell, 43, 192-202, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2011.06.019.
  42. Kulkarni, A., and Das, K. C. (2008) Differential roles of ATR and ATM in p53, Chk1, and histone H2AX phosphorylation in response to hyperoxia: ATR-dependent ATM activation, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 294, 998-1006, https://doi.org/10.1152/ajplung.00004.2008.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ уровня фосфорилирования белков DNA-PKcs, ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 и H2AX в клетках, трансдуцированных HIV_wt, HIV_mut или нетрансдуцированном контроле (Cntr), через 12 ч после добавления лентивирусных векторов. На графике представлены уровни фосфорилированной формы белка в клетках, трансдуцированных HIV_wt или HIV_mut, относительно нетрансдуцированного образца (среднее ± SD по трем независимым повторам). Статистическая значимость изменений в уровне фосфорилированного белка оценивалась с помощью двухфакторной ANOVA c поправкой на множественные сравнения по Тьюки; ns – статистические отличия отсутствуют, **** p-value < 0,0001

Скачать (135KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Вестерн-блот-анализ фосфорилированных форм p53 (pSer15) и H2AX (pSer139). Cntr – нетрансдуцированные вектором клетки; HIV_wt, HIV_mut, HIV_E152A, HIV_F185A – клетки, трансдуцированные векторами на основе ВИЧ-1 с природным вариантом интегразы или соответствующей мутантной формой; образцы HIV_wt + Nu7441 и HIV_wt + Ku-55933 после трансдукции клеток вектором HIV_wt дополнительно обрабатывали ингибитором DNA-PKcs – Nu7441 (2 мкМ), или ингибитором ATM – Ku-55933 (5 мкМ)

Скачать (93KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Кинетика накопления γH2AX и pSer15-p53 в клетках HEK293T, трансдуцированных векторами HIV_wt, HIV_mut или HIV_E152A через 10, 12, 14 и 18,5 ч после трансдукции. а – Вестерн-блот-анализ; б – количественный анализ результатов вестерн-блоттинга. За 1 принят уровень γH2AX и pSer15-p53 в клетках, трансдуцированных HIV_wt через 18,5 ч после добавления вектора. Образец, обозначенный как Cntr, не трансдуцирован вектором

Скачать (177KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Накопление локусов γH2AX в клетках HEK293T, трансдуцированных векторами на основе генома ВИЧ-1. а–е – Конфокальные изображения локусов γH2AX в клетках HEK293T без обработки (а), обработанных 50 мкМ этопозидом в течение 1 ч перед фиксацией (б), трансдуцированных векторами HIV_wt (в), HIV_mut (г), HIV_E152A (д), HIV_F185A (е) при множественности инфекции (MOI), равной 10. Фиксация клеток проводилась через 12 ч после трансдукции. ж – Среднее число локусов γH2AX, приходящихся на одну клетку (проанализировано суммарно 5000 клеток в трех технических повторах для каждого типа воздействия); статистическая значимость отличий оценена с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой Тьюки на множественные сравнения; ns – отличия отсутствуют, *** p-значение < 0,001, **** p-значение < 0,0001; з – средняя интенсивность флуоресценции локусов γH2AX; статистическая значимость отличий оценена с помощью t-теста, ** p-значение < 0,01

Скачать (450KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Фосфорилирование белков из систем клеточного ответа на двуцепочечные разрывы ДНК при постинтеграционной репарации ВИЧ-1. Интеграза ВИЧ-1, расположенная в местах встраивания генома ВИЧ-1 и, соответственно, маркирующая повреждения ДНК, привлекает гетеродимерный комплекс Ku70–Ku80. Данный комплекс является строго необходимым для привлечения DNA-PK и ATM и последующей активации этих киназ в местах повреждений ДНК, вызванных интеграцией ВИЧ-1. DNA-PK и ATM автофосфорилируются по pSer2056 и pSer1981. Активированные в ходе ПИР киназы фосфорилируют мишени H2AX и Chk2, но не p53. ATR в ПИР не участвует и не активируется

Скачать (100KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».