Energy Barrier of a Monolayer Stalk Formation during Lipid Droplet Fusion

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Эукариотические клетки, как правило, состоят из множества взаимодействующих органелл. Это взаимодействие часто осуществляется путем контакта и перестройки липидных мембран, окружающих органеллы и выполняющих барьерную функцию. Одной из форм процессов перестройки мембран является их слияние, т. е. объединение материала самих мембран и объемов воды, которые они окружают. Слияние мембран необходимо для успешного протекания множества биологических процессов, таких как экзоцитоз, оплодотворение, секреция, синаптическая передача и т. д. [1, 2].

Для осуществления слияния мембранам необходимо сблизиться на небольшое расстояние порядка нескольких нанометров и совершить топологическую реконфигурацию, для чего мембраны должны быть деформированы. Согласно имеющимся представлениям, этот процесс происходит через несколько промежуточных метастабильных состояний, разделенных энергетическими барьерами [2, 3]. Высоты энергетических барьеров определяют кинетические параметры слияния, такие как среднее время ожидания слияния, и поэтому являются важнейшими физическими величинами. Ключевым метастабильным состоянием является сталк – структура, в которой контактные монослои уже слились, а дистальные – еще нет [4, 5]. Сталк является первой структурой, в которой осуществляется физический контакт сливающихся мембран; сталк наблюдался в экспериментах по рентгеновскому рассеянию на мультислоях, а также в исследованиях методами молекулярной динамики [3, 5]. В дальнейшем эволюция системы может идти по разным траекториям, на которых системе необходимо преодолеть еще один или два энергетических барьера [6–8]. Классическая теория предполагает дальнейшее расширение сталка и образование так называемой диафрагмы полуслияния – структуры с протяженным бислоем, образованным дистальными монослоями мембран, расположенным в центре между радиально разошедшимися слившимися контактными монослоями [9]. Затем в диафрагме полуслияния образуется сквозная пора, и слияние завершается. Различные оценки дают для высот барьеров величины в несколько десятков k_BT (k_BT = 4 × 10^–21 Дж) [10–12].

Как правило, в слиянии участвуют бислойные мембраны, однако в природе существует уникальный случай слияния монослойных мембран. Этот процесс реализуется при взаимодействии так называемых липидных капель, органелл, используемых для запасания нейтральных жиров. Липидные капли имеют монослойную оболочку из фосфолипидов, которая предотвращает их спонтанное слияние [13]. Считается, что процессы слияния липидных капель контролируются специализированными белковыми комплексами и определенным липидным составом поверхностного монослоя, влияющими на высоту энергетического барьера слияния. В большинстве случаев перетекание жира из одной капли в другую полностью контролируется белковыми комплексами CideA, которые, как предполагается, формируют белковые поры в монослойных оболочках липидных капель [14]. Данный механизм взаимодействия не предполагает объединения липидных оболочек и не является слиянием в смысле определения, данного выше. В слиянии могут участвовать комплексы SNARE (soluble NSF attachment protein receptor), которые, как предполагается, удерживают вместе сливающиеся оболочки липидных капель [15]. В большинстве работ, исследующих слияние липидных капель, уделяется мало внимания влиянию липидного состава на этот процесс. В некоторых работах констатируется увеличение эффективности слияния липидных капель при модулировании их состава, в частности, при увеличении концентрации фосфатидной кислоты [16]. Известно, что изменение липидного состава влияет на упругие характеристики сливающихся бислойных мембран, в частности на так называемую спонтанную кривизну – параметр, характеризующий равновесную форму свободного монослоя [17]. Повышенное содержание диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), имеющего примерно нулевую спонтанную кривизну, ингибирует слияние. Увеличение доли липидов с отрицательной спонтанной кривизной, таких, как диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), способствует слиянию [3]. Известно, что фосфатидная кислота, увеличивающая эффективность слияния липидных капель, имеет отрицательную спонтанную кривизну, как и DOPE [18]. Кроме того, известно, что в составе оболочек липидных капель доминируют липиды DOPC и DOPE [19, 20], поэтому можно ожидать, что и в случае монослойного слияния состав монослойных оболочек также будет иметь значение. Исследования слияния бислойных мембран позволяют предположить, что эффективность монослойного слияния определяется совместным действием липидной мембраны и белков, аналогично классическому случаю. При описании бислойного слияния белки рассматриваются как объекты, приводящие к локальному изменению упругих свойств мембран или уменьшающие эффективное расстояние между ними за счет механической работы [10, 21, 22]. При этом на стадии образования сталка влияние липидной компоненты на эффективность слияния является ключевым, поскольку для успешного слияния область контакта липидных оболочек должна быть свободна от белков.

В данной работе разрабатывается теоретическая модель безбелкового слияния монослойных оболочек. В качестве основы используются теоретические модели бислойного и бислой-монослойного слияния [22, 23]. Для расчета деформаций применяется теория упругости липидных мембран, адаптированная для случая монослоев. Это позволяет рассчитать энергетический барьер на образование монослойного сталка. В работе исследуется зависимость высоты данного барьера от ключевых упругих характеристик монослоев и от их липидного состава. Полученные данные сопоставляются с результатами для бислойного и монослой-бислойного слияния. Определение высоты энергетического барьера позволяет также оценить возможность протекания безбелкового слияния для липидных капель с разным составом оболочки.

ПОСТАНОВКА И РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

Мы рассматриваем образование монослойного сталка в процессе слияния идентичных липидных капель путем локального сближения двух монослоев. Считаем, что размеры липидных капель много больше характерных размеров области слияния. Это позволяет представлять начальное состояние системы как два плоских монослоя, разделенных водной средой и расположенных на равновесном расстоянии H₀ друг от друга (рис. 1а). Равновесное расстояние по порядку величины составляет несколько нанометров и может уменьшаться до 1 нм при стягивающем воздействии белков слияния [10]. Глобальное уменьшение расстояния между монослоями не выгодно из-за действия сил гидратационного отталкивания, поэтому мы рассматриваем локальное выпячивание монослоев друг к другу при фиксированном расстоянии H₀ на удалении от этого выпячивания (рис. 1б). Считаем, что выпячивания расположены на расстоянии d симметрично друг относительно друга; это позволяет рассматривать только один монослой. Энергия системы в этом случае равна сумме удвоенной упругой энергии монослоя и энергии межмонослойного взаимодействия. Образование монослойного сталка соответствует случаю d = 0 (рис. 1в).

Рис. 1. Схематичное изображение процесса монослойного слияния. а – Начальное состояние: два плоских монослоя находятся на расстоянии H₀ друг от друга. б – Образование локальных симметричных выпуклостей на расстоянии d. в – Образование монослойного сталка, т. е. плотного контакта мембран друг с другом.

Рассмотрим сначала упругую энергию монослоя. Она определяется деформациями монослоя и латеральным натяжением . Для описания деформаций мы используем энергетический функционал Хамма–Козлова [24]. Состояние деформированного участка липидного монослоя определяется векторным полем единичных векторов n, называемых директорами, характеризующими среднюю ориентацию липидных молекул. Поле директоров задается на так называемой нейтральной поверхности, проходящей внутри монослоя параллельно его границе с водой в области сочленения полярных головок с гидрофобными цепями липидов. На этой поверхности деформации поперечного изгиба и латерального растяжения/сжатия энергетически независимы [24]. Форма нейтральной поверхности характеризуется векторным полем ее единичных нормалей N. Деформации будем считать малыми и будем вычислять энергию в квадратичном приближении. Деформация поперечного изгиба характеризуется дивергенцией директора вдоль нейтральной поверхности, div(n). Деформация наклона характеризуется вектором наклона, который для малых деформаций имеет вид t = n – N [24]. Энергия деформации W участка монослоя площади A при наличии ненулевого натяжения σ может быть записана в виде [17]:

$W=\underset{A_0}{\int }\left\{\begin{array}{c}\frac{B}{2}{\left(div\mathit{n}+J_s\right)}^2-\\ -\frac{B}{2}{J_s}^2+\frac{K_t}{2}{\mathit{t}}^2+\tilde{\sigma }\end{array}\right\}dS-\sigma A_0,$ (1)

где B и K_t – упругие модули изгиба и наклона соответственно, J^s – спонтанная кривизна монослоя, dS – элемент площади поверхности, A₀ – площадь монослоя в недеформированном состоянии. Для описания деформаций монослоя мы вводим систему координат {O, z, r} с осью z, направленной перпендикулярно монослою посередине его выпуклости, и осью r, направленной перпендикулярно оси z так, что она касается нейтральной поверхности монослоя на бесконечности. В предположении малости деформаций состояние монослоя описывается проекциями директора и вектора наклона на ось r a(r) и t(r) соответственно, а также расстоянием H(r) от нейтральной поверхности до плоскости z = 0. Дивергенция директора при этом заменяется на выражение da/dr + a/r. Также мы учитываем, что вектор наклона t ≈ n – N [24]; это позволяет связать проекцию вектора наклона с формой нейтральной поверхности H(r) согласно формуле $t\left(r\right)=a\left(r\right)-dH\left(r\right)/dr$. В результате поверхностная энергия монослоя может быть записана в виде [25]:

$w=2\pi r\left(\begin{array}{c}\frac{B}{2}{\left(\frac{da}{dr}+\frac{a}{r}+J_s\right)}^2-\frac{B}{2}{J_s}^2+\\ +\frac{K_t}{2}{\left(a-\frac{dH}{dr}\right)}^2+\frac{\tilde{\sigma }}{2}{\left(\frac{dH}{dr}\right)}^2\end{array}\right).$ (2)

Варьируя функционал $\int wdr$, мы получаем уравнения Эйлера–Лагранжа, описывающие функции a(r) и H(r). Решение данных уравнений позволяет найти в явном виде функции a(r) и H(r), зависящие от неопределенных коэффициентов. Эти коэффициенты определяются из граничных условий, задающих геометрию системы и имеющих следующий вид:

$\begin{array}{c}H\left(0\right)=\frac{H_0-d}{2},\\ H{|}_{r\to \infty }=\mathrm{0,}\end{array}$ (3)

где d – расстояние между вершинами монослойных выпуклостей. Граничные условия (3) означают, что решения уравнений должны быть ограничены как в нуле, так и на бесконечности. Для удовлетворения этим условиям мы вводим дополнительный параметр – радиус R – и делим рассматриваемую систему на две области: от 0 до R и от R до бесконечности (рис. 2а).

Рис. 2. Модели промежуточных стадий монослойного слияния. а – Локальные выпуклости радиуса R, находящиеся на расстоянии d друг от друга. б – Монослои с гидрофобными дефектами. Расстояние между мембранами при r → ∞ равно H₀ и не меняется в процессе слияния.

В первой области вводим функции a_i(r) и H_i(r), ограниченные в нуле, во второй области – функции a_e(r) и H_e(r), ограниченные на бесконечности. Каждый из этих наборов функций удовлетворяет уравнениям Эйлера–Лагранжа, но имеет меньше неопределенных коэффициентов в своем составе. В явном виде эти функции имеют следующий вид:

$\begin{array}{c}{a}_i\left(r\right)=c_1{I}_1\left(r_{\sigma }\right),\\ H_i\left(r\right)=c_1{I}_0\left(r_{\sigma }\right)\frac{l}{\sqrt{\sigma \left(\sigma +1\right)}}+c_2,\\ a_e\left(r\right)=c_3{K}_1\left(r_{\sigma }\right),\\ H_e\left(r\right)=c_3{K}_0\left(r_{\sigma }\right)\frac{l}{\sqrt{\sigma \left(\sigma +1\right)}}+c_4.\end{array}$ (4)

Здесь $\sigma =\frac{\tilde{\sigma }}{K_t}$ – безразмерное латеральное натяжение, l = B/K_t,, $r_{\sigma }=\frac{r}{l}\sqrt{\frac{\sigma }{\sigma +1}}$, I_j(r) и K_j(r) – модифицированные функции Бесселя j-го порядка первого и второго типа соответственно, с _i, i = 1…4 – неопределенные коэффициенты. Определенные формулой (4) функции непрерывно сшиваются на границе двух областей:

$\begin{array}{c}{a}_i\left(R\right)=a_e\left(R\right),\\ H_i\left(R\right)=H_e\left(R\right).\end{array}$ (5)

Совокупность граничных условий (3) и (5) позволяет определить все неопределенные коэффициенты c_i. После этого мы интегрируем поверхностную плотность энергии (2) в двух областях и в итоге получаем полную упругую энергию монослоя W_el¹ как функцию R и H₀ – d. В явном виде данная энергия имеет вид:

$\begin{array}{c}{W_{el}}^1=\frac{\pi K_t}{4}\frac{R}{l}{\left(H_0-d\right)}^2\times \\ \times {\sigma }^{\frac{3}{2}}\sqrt{\sigma +1}\cdot I_1\left(R_{\sigma }\right)\cdot K_1\left(R_{\sigma }\right)\times \\ \times \frac{I_1\left(R_{\sigma }\right)\cdot K_0\left(R_{\sigma }\right)+I_0\left(R_{\sigma }\right)\cdot K_1\left(R_{\sigma }\right)}{{\left(\left(I_0\left(R_{\sigma }\right)-1\right)\cdot K_1\left(R_{\sigma }\right)+I_1\left(R_{\sigma }\right)\cdot K_0\left(R_{\sigma }\right)\right)}^2}.\end{array}$ (6)

Здесь $R_{\sigma }=\frac{R}{l}\sqrt{\frac{\sigma }{\sigma +1}}.$.Заметим, что энергия W_el¹ не зависит от спонтанной кривизны J_s и от равновесной толщины монослоя. Также мы рассматриваем гидратационное отталкивание между мембранами, возникающее из-за взаимодействия примембранных слоев воды при субнанометровых расстояниях между монослоями. Поверхностная энергия гидратационного отталкивания w_h вычисляется на основе эмпирического соотношения

$w_h=P_0{\xi }_h\exp \left(-\frac{z\left(r\right)}{{\xi }_h}\right),$ (7)

где z(r) – расстояние между мембранами как функция координаты r, ξ_h – характерная длина порядка 0.3 нм, P₀ – давление при нулевом расстоянии, варьирующее в пределах 100–1000 k_BT/нм³ [8, 10]. В связи с экспоненциальным убыванием силы отталкивания при увеличении расстояния между мембранами обычно интегрирование ведется по областям мембран, соответствующим увеличению расстояния между ними на величину ξ_h. В рассматриваемом нами случае эта область определяется радиусом R_h, который находится из условия H_i(0) – H_i(R_h) = ξ_h/2. Проведенные нами вычисления показывают, что этот радиус мало отличается от радиуса R при достаточно больших значениях H₀. Это позволяет нам еще больше упростить вычисления и проводить интегрирование по плоскостям, касающимся нейтральных поверхностей в точке r = 0 и отстоящим друг от друга на расстояние d. Таким образом, мы получаем приближенное значение энергии гидратационного отталкивания W_h:

$W_h=\pi R^2{P}_0{\xi }_h\left(\exp \left(-\frac{d}{{\xi }_h}\right)-\exp \left(-\frac{H_0}{{\xi }_h}\right)\right).$ (8)

Полная энергия системы W_tot¹ равна сумме удвоенной упругой энергии и энергии гидратационного отталкивания: W_tot¹ = 2W_el¹ + W_h. При небольших расстояниях d становится энергетически выгодно образование локальных гидрофобных дефектов на вершинах взаимодействующих выпуклостей (рис. 2б). Энергия взаимодействия гидрофобных дефектов определяется следующим соотношением:

$W_p=2\pi R^2{\sigma }_p\left(1-\exp \left(-\frac{d}{{\xi }_p}\right)\right),$ (9)

где σ_p – натяжение на границе вода/масло, ξ_p – характерная длина гидрофобного взаимодействия. Поскольку выпуклости заменяются дефектами, меняется геометрия системы, что приводит к изменению граничных условий. При наличии дефектов монослои остаются деформированными только в области r > R, при этом граничные условия имеют вид:

$\begin{array}{c}{H}_e\left(R\right)=\frac{H_0-d}{2},\\ H_e{|}_{r\to \infty }=0.\end{array}$ (10)

Решение уравнений (10) относительно коэффициентов c₃ и c₄ позволяет найти изменившуюся энергию деформаций W_el²:

$\begin{array}{c}{W_{el}}^2=\frac{\pi K_t}{4}\frac{R}{l}\left(H_0-d\right)\times \\ \times \left(\left(H_0-d\right)\sigma +4J_s{l}^2\right){\sigma }^{\frac{3}{2}}\sqrt{\sigma +1}\frac{K_1\left(R_{\sigma }\right)}{K_0\left(R_{\sigma }\right)}.\end{array}$ (11)

Образование дефектов также приводит к разрыву непрерывности директора; теперь директор не определен в области r < R. Это приводит к появлению ненулевого вклада в энергию от Гауссовой кривизны. Энергия Гаусса монослоя равна W_Gauss = –πK_G.a_e(R)², где K_G – модуль Гауссовой кривизны, K_G < 0, a_e(R) – значение граничного директора в точке r = R [21]. Граничный директор задается коэффициентами c₃ и c₄ согласно уравнениям (4). В рассматриваемом случае эти коэффициенты находятся из граничных условий (10); в соответствии с этим, энергия Гаусса для одного монослоя оказывается равна

$W_{Gauss}=-\frac{\pi K_G\sigma \left(\sigma +1\right){\left(H_0-d\right)}^2}{l^2}\frac{K_1{\left(R_{\sigma }\right)}^2}{K_0{\left(R_{\sigma }\right)}^2}.$ (12)

Полная энергия системы из двух монослоев с взаимодействующими гидрофобными дефектами будет равна W_tot² = 2W_el² +2W_Gauss + W_h. Как видно из формулы (9), гидрофобное взаимодействие уменьшается при малых значениях d, что приводит к эффективному притяжению монослоев.

Алгоритм расчета. Описанные выше предположения позволяют найти энергетическую траекторию образования монослойного сталка в процессе слияния двух монослоев. Под энергетической траекторией понимается некоторая траектория вдоль энергетической гиперповерхности в координатах {R, d}, переводящая систему из начального состояния в состояние сталка. Мы фиксируем расстояние H₀ между монослоями и рассматриваем зависимость энергии системы от наименьшего расстояния d между мембранами. В данном случае параметр d является координатой реакции. Монослой может находиться в двух состояниях – монослой с выпуклостью или монослой с гидрофобным дефектом. При каждом фиксированном значении расстояния d находим зависимость энергии W_tot¹ выпуклостей от R. Эта энергия имеет минимум, соответствующий R_min ~0.5–1 нм (см. рис. 3а). Минимальная энергия W_min¹ составляет несколько десятков k_BT и быстро растет с уменьшением d. Мы находим минимальное значение энергии W_min¹ и соответствующее ему значение радиуса выпуклости R_min¹.

Рис. 3. Зависимость полной энергии выпуклостей W_tot¹ (панель а) и энергии дефектов W_tot² (панель б) от радиуса R при фиксированных значениях расстояния d между монослоями. Красные кривые соответствуют d = 1 нм, синие кривые соответствуют d = 0.8 нм, зеленые – d = 0.6 нм. Остальные параметры системы имеют следующие значения: H₀ = 3 нм, P₀ = 800 k_BT/нм³, ξ_h = 0.2 нм, ξ_p = 1 нм, J_s = –0.1 нм^-1, K_G = –5 k_BT, K_t = 10 k_BT/нм², l = 1 нм, σ_p = 12.5 k_BT /нм², σ = 0.05 k_BT /нм².

Аналогичным образом рассматриваем зависимость энергии монослоев с дефектами W_tot² от R при этом же фиксированном значении d (рис. 3б). Эта энергия также имеет минимум, соответствующий другому значению радиуса R_min²; минимальное значение энергии обозначаем как W_min². Таким образом, имеем зависимости энергий W_min¹ и W_min² от d. Эти две зависимости пересекаются при определенном значении d_opt. При d > d_opt энергия системы определяется зависимостью W_min¹, а при d < d_opt – зависимостью W_min². В результате получаем энергетическую траекторию системы в зависимости от координаты реакции d; пример такой траектории показан на рис. 4. Высота барьера определяется как разность максимальной энергии на траектории и энергии начального состояния. В точке траектории, соответствующей d = 0, образуется монослойный сталк. При этом мы пренебрегаем изменением энергии, связанным со скачкообразным изменением радиуса системы. При малых значениях d энергия системы с гидрофобным дефектом достаточно слабо зависит от R (см. рис. 3, панель б). Поэтому искомое изменение энергии можно оценить в несколько единиц k_BT.

Рис. 4. Энергетическая траектория монослойного слияния в координатах (H₀ – d, W). Начало слияния находится слева и соответствует отсутствию выпуклостей, конец траектории находится справа и соответствует образованию монослойного сталка (d = 0). Красным показана равновесная энергия выпуклостей W_tot¹; синим показана равновесная энергия монослоев с гидрофобными дефектами W_tot². Параметры системы те же, что и на рис. 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы находим зависимость высоты энергетического барьера E_Barr от состава сливающихся монослойных оболочек. Описанный выше алгоритм позволяет определить энергетический барьер монослойного слияния, если известны упругие параметры монослоев, параметры гидратационного отталкивания и равновесное расстояние H₀ между монослоями. Изменение состава моделируется как добавление DOPE в мембрану, состоящую из DOPC. Параметры P₀ и ξ_h экспериментально определены для ограниченного набора составов мембраны, а именно – для мембран с соотношением DOPC : DOPE=1:0, 3:1 и 1:1 [26]. Следует отметить, что данные параметры получены при анализе расстояний между плоскими мембранами вплоть до величины 0.9 нм. В нашей работе формирование контакта между мембранами происходит при d = 0.5–1 нм, т. е. при несколько меньших расстояниях. В этом смысле применение данных значений параметров является экстраполяцией. В нашем анализе мы рассматриваем именно эти составы. Зависимость спонтанной кривизны от состава определяется в соответствии с формулой

$J_s=c_{DOPE}{j}_{DOPE}+\left(1-c_{DOPE}\right)j_{DOPC},$ (13)

где c_DOPE – поверхностная доля DOPE в составе мембраны; j_DOPC и j_DOPE – спонтанные кривизны DOPC и DOPE соответственно. Также мы учитываем зависимость модуля изгиба B_eff от состава [27]:

$B_{eff}=\frac{B}{1+\frac{Ba{j}_{DOPE}{c}_{DOPE}\left(1-c_{DOPE}\right)}{k_{B}T}},$ (14)

где a – средняя площадь липидной молекулы, которую мы в дальнейшем принимаем равной примерно 0.7 нм², B – модуль изгиба DOPC, равный 10 k_BT [28]. Зависимости величин от липидного состава сведены в табл. 1.

Таблица 1. Значения параметров, зависящих от липидного состава

Примечание. Параметры P₀ и ξ_h взяты из работы [26]; модуль изгиба и спонтанная кривизна определяются в соответствии с формулами (13) и (14). При расчетах спонтанная кривизна DOPC принимается равной j_DOPC = –0.09 нм^-1; спонтанная кривизна DOPE j_DOPE = –0.4 нм^-1 [29].

Модуль наклона K_t считаем не зависящим от липидного состава и равным K_t = 10 k_BT/нм² [30]; поверхностное натяжение мембраны задаем равным σ = 0.05 k_BT/нм². Также от состава не зависит длина гидрофобного взаимодействия ξp ≈ 1 нм [21]. Модуль Гауссовой кривизны K_G определен в нескольких работах и варьирует от –3.3 k_BT до –10 k_BT [31–33]. Мы используем две величины: –5 k_BT и –8 k_BT и приводим результаты для этих значений. Также мы варьируем начальное расстояние между монослоями H₀ и приводим зависимость высоты барьера от H₀ для различных составов. Результаты расчетов показаны на рис. 5.

Рис. 5. Зависимость высоты барьера на образование монослойного сталка E_Barr (k_BT) от H₀ для монослоев разного состава и при разном значении модуля Гауссовой кривизны K_G. Красным показаны зависимости для монослоев из чистого DOPC, синим – для монослоев состава DOPC : DOPE = 3:1, зеленым – для монослоев состава DOPC : DOPE = 1:1. Сплошными линиями показаны зависимости для случая K_G = –8 k_BT, пунктирными линиями – для случая K_G = –5 k_BT. Значения упругих модулей и спонтанной кривизны для монослоев разного состава указаны в табл. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами результаты позволяют оценить высоту E_Barr энергетического барьера на образование монослойного сталка и провести сравнение со случаем классического бислойного слияния. Одним из важных вопросов теории слияния является получение зависимости высоты такого барьера от состава сливающихся мембран. Известно, что увеличение доли DOPE в составе мембран приводит к облегчению слияния и увеличению стабильности сталка [34]. Имеющиеся экспериментальные данные по слиянию липидных капель также говорят о том, что увеличение доли DOPE или фосфатидной кислоты в составе их оболочки приводит к увеличению эффективности слияния [16]. Наши результаты согласуются с этими предположениями. Как видно из рис. 5, увеличение доли DOPE на 50% приводит к уменьшению высоты барьера примерно на 5k_BT, которое становится тем больше, чем больше расстояние между монослоями H₀. При этом увеличение H₀ с 2 до 4 нм приводит к росту высоты барьера в несколько раз, с 10 до 30–40 k_BT, в зависимости от остальных параметров системы. Таким образом, наши расчеты показывают, что изменение состава монослоев влияет на эффективность образования сталка значительно слабее, чем изменение начального расстояния между ними. Этот результат качественно соответствует полученным ранее результатам для бислойного и бислой-монослойного слияния [23]. Он также согласуется с результатами работы [12], согласно которым барьер для бислойного слияния уменьшается примерно на 3 k_BT при увеличении доли фосфатидилэтаноламина в составе мембран на 50%. В этой же работе показано, что барьер на слияние чрезвычайно сильно зависит от расстояния между мембранами и увеличивается в 2 раза при двукратном увеличении расстояния. При этом следует отметить, что уменьшение барьера даже на несколько единиц k_BT ощутимо влияет на экспериментально регистрируемое время ожидания слияния. Так, например, в работе [35] демонстрируется, что уменьшение времени ожидания слияния в 35 раз соответствует уменьшению барьера на 3.5 k_BT. Полученные зависимости позволяют объяснить эффективность белок-опосредованного слияния липидных капель как результат контроля межмонослойного расстояния: эктодомены белков слияния, таких как SNARE, удерживают монослои на фиксированном небольшом расстоянии, что резко понижает барьер на слияние и делает слияние реализуемым за физически адекватное время. Варьирование липидного состава позволяет более тонко влиять на высоту барьера, дополняя влияние белков и ускоряя или замедляя слияние в несколько раз.

Наши результаты показывают, что Гауссова кривизна также оказывает значительное влияние на высоту барьера; количественно это влияние определяется величиной модуля Гауссовой кривизны KG. Экспериментально оценить эту величину достаточно сложно; наиболее достоверные результаты были получены путем молекулярно-динамических расчетов [33]. Согласно этим данным, отношение K_G/B колеблется от –0.86 до –1.05 в зависимости от параметров симуляции, таких как площадь на головку липида. Данные [32] говорят о значении –0.83 для того же соотношения. В то же время в некоторых работах используется значение –0.5 и даже – 0.3 [31]. Кроме того, в работе [36] показано, что для мембраны из DOPE модуль K_G составляет –8.3 k_BT, а для мембраны из DOPC –7.6 k_BT. В силу большой неопределенности в литературных данных мы взяли два характерных значения для модуля KG, чтобы показать степень влияния на высоту барьера; при этом зависимость K_G от состава не рассматривалась. Из приведенных на рис. 5 данных следует, что изменение модуля Гауссовой кривизны K_G с –8 до –5 k_BT приводит к падению высоты барьера в 1.5 раза. Это говорит о большой чувствительности энергии интермедиатов слияния к величине K_G, что является следствием топологической перестройки в процессе слияния [32].

Результаты нашей работы позволяют оценить влияние суммарного числа монослоев в составе сливающихся мембран на энергетический профиль системы. Ранее нами было показано, что стабильность сталка повышается при уменьшении этого числа с четырех до трех [23]. Проведенные в этой работе вычисления методом молекулярной динамики показывают, что в случае мембран из чистого DOPC бислойный сталк является нестабильной структурой, в то время как монослойно-бислойный сталк является метастабильной структурой. В случае монослойно-бислойного слияния барьер на обратный переход из состояния сталка в состояние невзаимодействующих мембран составляет несколько единиц k_BT. В настоящей работе демонстрируется, что дальнейшее уменьшение числа монослоев приводит к возрастанию величины обратного барьера. Вне зависимости от состава мембраны, в области d < d_opt энергия понижается на несколько десятков единиц k_BT, как показано на рис. 4. Высота прямого барьера также понижается на 15 kBT относительно бислойного слияния и при H₀ ≈ 2–3 нм варьирует в интервале 10–25 k_BT. Дальнейшая эволюция системы после образования монослойного сталка должна быть связана с его расширением. В отличие от бислойного слияния, расширение монослойного сталка приводит сразу к образованию поры слияния. В работе [25] нами были проведены расчеты, описывающие расширение сталка в случае монослойно-бислоного слияния. Нами была произведена оценка высоты барьера на расширение сталка в зависимости от доли DOPE в составе мембран; максимальное значение этого барьера E_MB составляет 10 k_BT в случае мембран без DOPE. Простые соображения позволяют связать с уже рассмотренной моделью случай расширения монослойного сталка и получить оценку для его барьера. В случае бислойно-монослойного слияния бислойная мембрана практически не деформировалась, и образование сталка было связано только с деформацией монослоя [25]. Согласно формулам (6) и (11), энергия деформаций монослоя квадратично зависит от высоты его подъема относительно начального положения. Можно оценить энергию на расширение монослойно-бислойного сталка как E_MB ≈ F(R)∙H₀F(R) – функция радиуса сталка. В случае монослойного слияния в силу симметрии системы мы будем иметь два монослоя, каждый из которых поднят на высоту H₀/2, поэтому для энергии на расширение монослойного сталка EM можно будет записать

$E_M\approx 2F\left(R\right)\cdot {\left(\frac{H_0}{2}\right)}^2=F\left(R\right)\frac{{H_0}^2}{2}=\frac{1}{2}{E}_{MB}$,

т.е. энергия будет уменьшаться в 2 раза. Таким образом, для расширения монослойного сталка будет необходима энергия менее 5 k_BT, т. е. можно считать, что расширение сталка происходит практически безбарьерно. В этом состоит принципиальное отличие слияния монослоев от слияния бислойных мембран; в последнем случае процесс сложнее и требует преодоления нескольких энергетических барьеров. Различным стадиям слияния способствуют липиды с разными характеристиками. Так, для облегчения расширения бислойного сталка до диаграммы полуслияния предпочтительны липиды с отрицательной спонтанной кривизной, а для облегчения образования поры слияния – липиды с положительной спонтанной кривизной [2]. В силу этого для повышения эффективности бислойного слияния в живых системах бывает необходимо использовать белки слияния. В то же время монослойное слияние в силу пониженности энергетического барьера и одностадийности может регулироваться только липидным составом без непосредственного участия белков.

В рамках проведенных расчетов были сделаны некоторые упрощающие предположения. Мы считаем, что гидратационное отталкивание ограничивается областью выпуклости, т. е. r < R. Такое предположение оправдано, если в этой области высота мембраны H(r) меняется на большую величину, чем ξ_h/2. Поскольку значение ξ_h мало и составляет несколько ангстрем, это условие выполняется для большей части рассматриваемых систем, однако перестает работать при небольших межмонослойных расстояниях H₀ < 1.5–2 нм. Таким образом, используемая модель становится неприменимой в области малых значений H₀. Гидратационным отталкиванием при рассмотрении гидрофобных дефектов мы полностью пренебрегаем, поскольку предполагаем, что их наличие приводит к локальному разупорядочиванию слоев воды при r > R. Это предположение нуждается в дополнительной проверке и может приводить к занижению энергии гидрофобных дефектов, особенно в области больших расстояний H₀. Таким образом, сформулированная модель наиболее корректно описывает поведение системы в узком диапазоне значений H₀ примерно от 2 до 3 нм. Кроме того, предполагается, что переход из состояния выпуклости в состояние гидрофобного дефекта совершается безбарьерно. В то же время, несмотря на равенство энергий этих состояний, они могут отличаться величиной равновесного радиуса, т. е. ${R_{min}}^1\ne {R_{min}}^2$. В дальнейшем мы планируем учесть этот недостаток и разработать непрерывную траекторию слияния монослойных оболочек.

Автор выражает глубокую признательность П.И. Кузьмину за доброжелательные и конструктивные замечания при выполнении расчетов и подготовке рукописи.

Конфликт интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 22–23–00551).

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

R. J. Molotkovsky

Author for correspondence.
Email: rodion.molotkovsky@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Schematic representation of the monolayer fusion process. a - Initial state: two flat monolayers are at a distance H0 from each other. b - Formation of local symmetric bulges at a distance d. c - Formation of monolayer stalk, i.e. dense contact of membranes with each other.

Download (595KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Models of intermediate stages of monolayer fusion. a - Local bulges of radius R located at a distance d from each other. b - Monolayers with hydrophobic defects. The distance between membranes at r → ∞ is equal to H0 and does not change during fusion.

Download (224KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Dependence of the total bulge energy Wtot1 (panel a) and defect energy Wtot2 (panel b) on the radius R at fixed values of the distance d between monolayers. The red curves correspond to d = 1 nm, the blue curves correspond to d = 0.8 nm, and the green curves correspond to d = 0.6 nm. The other parameters of the system have the following values: H0 = 3 nm, P0 = 800 kBT/nm3, ξh = 0.2 nm, ξp = 1 nm, Js = -0.1 nm-1, KG = -5 kBT, Kt = 10 kBT/nm2, l = 1 nm, σp = 12.5 kBT /nm2, σ = 0.05 kBT /nm2.

Download (248KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Energy trajectory of monolayer fusion in (H0 - d, W) coordinates. The beginning of the fusion is on the left and corresponds to the absence of bulges; the end of the trajectory is on the right and corresponds to the formation of a monolayer stalk (d = 0). The equilibrium energy of bulges Wtot1 is shown in red; the equilibrium energy of monolayers with hydrophobic defects Wtot2 is shown in blue. The system parameters are the same as in Fig. 3.

Download (130KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Dependence of the barrier height on the formation of monolayer EBarr stalk (kBT) on H0 for monolayers of different compositions and at different values of the Gaussian curvature modulus KG. Dependences for monolayers made of pure DOPC are shown in red, blue - for monolayers of composition DOPC : DOPE = 3:1, green - for monolayers of composition DOPC : DOPE = 1:1. Solid lines show the dependences for the case KG = -8 kBT, dashed lines - for the case KG = -5 kBT. The values of elastic moduli and spontaneous curvature for monolayers of different compositions are given in Table 1.

Download (205KB)

Indexing metadata