Изучение влияния структуры элиминируемого лиганда на скорость восстановления комплексов кобальта(III)

Полный текст

В условиях гипоксии в тканях так называемых твердых опухолей повышается концентрация биогенных восстановителей, таких как восстановленный никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) или глутатион и аскорбат [1]. Низкая концентрация кислорода и повышенный уровень восстановителей делают эти опухоли устойчивыми по отношению к химио- и радиотерапии [2]. Однако дифференциация пораженных раком и здоровых тканей по уровню кислорода позволила разработать стратегию редокс-активируемых препаратов на основе комплексов кобальта(III), действующих избирательно на опухолевые клетки [3].

Ион кобальта(III) способен координировать и инактивировать цитотоксичные лиганды с образованием инертных комплексов, которые могут циркулировать в организме человека по кровеносным сосудам без повреждения здоровых тканей. Однако, попадая в клетки опухолей с повышенным содержанием восстановителей и низким уровнем кислорода, комплексы кобальта(III) восстанавливаются до соответствующих комплексов кобальта(II) с диссоциацией, в результате которой происходит высвобождение лекарственного препарата, выполнявшего роль органического лиганда. Селективность действия данного препарата в тканях с низким уровнем кислорода обеспечивается быстрым обратным окислением иона кобальта(II) до иона кобальта(III) в здоровых тканях с нормальной концентрацией кислорода [4]. К настоящему моменту получен ряд комплексов кобальта(III) c некоторыми лекарственными препаратами и их предшественниками из класса алкилирующих противораковых препаратов, являющихся аналогами азотистого иприта [5, 6], ингибитором матричной металлопротеиназы широкого спектра действия маримастатом [7], ингибиторами рецептора эпидермального фактора роста [8], эскулетином (производным кумарина, потенциально обладающим противораковой активностью) [9] и фенилаланином (являющимся модельным соединением противоракового препарата мелфалана) [10].

Для перехода разработанной стратегии редокс-активации в стадию клинических испытаний необходимо преодолеть множество ограничений. Одна из основных проблем заключается в том, что многие результаты, полученные in vitro, не удалось воспроизвести in vivo. Это делает необходимым дальнейшую оптимизацию свойств комплексов кобальта для использования в качестве молекулярной платформы в целях редокс-активируемой доставки лекарственных препаратов. Кроме того, большинство исследований в этой области посвящено выбору лигандов для дизайна редокс-активных комплексов кобальта. Однако влияние структуры самих высвобождаемых компонентов на процесс их высвобождения не изучалось, хотя это может оказаться важным фактором при выборе оптимальной платформы для доставки. К тому же высвобождаемые молекулы могут сами являться восстановителями по отношению к комплексам кобальта и ускорять процесс восстановления.

Ранее нами был предложен подход, позволяющий отслеживать процессы редокс-активации лекарственных препаратов в комплексах кобальта(III) in situ с помощью спектроскопии ЯМР. Это позволило нам изучить восстановление аскорбиновой кислотой гетеролептических комплексов кобальта(III), содержащих в качестве лигандов 2,2′-бипиридин или 1,10-фенантролин и 2-оксо-2Н-хромен-6,7-диолат дианион [11], и обнаружить, что комплекс с фенантролином восстанавливается значительно быстрее.

В настоящей работе с использованием предложенного подхода мы исследовали зависимость скорости редокс-активируемого высвобождения модельных лекарственных препаратов комплексами кобальта от молекулярной структуры высвобождаемых препаратов. В качестве объектов исследования выбраны редокс-активные комплексы кобальта(III) [Co(Bipy)₂(coumarin-diolate)]ClO₄ (I) и [Co(Bipy)₂(catecholate)]ClO₄ (II) [9, 12], содержащие в качестве лигандов бипиридин и дианион 2-оксо-2Н-хромен-6,7-диолат или катехолат (схема 1). Выбор комплекса I обусловлен его перспективными биологическими свойствами. Так, ранее была продемонстрирована цитотоксичность комплекса I по отношению к клеткам рака кишечника в условиях гипоксии [9]. Комплекс II выбран для удобства сравнения. Пирокатехин, дианион которого входит в состав II, содержит структурный фрагмент, аналогичный фрагменту, входящему в состав 6,7-дигидроксикумарина. К тому же пирокатехиновый фрагмент входит в состав многих биологически активных препаратов – антиоксидантов, адреналина и др.

 

Схема 1.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез I и II проводили по литературным методикам [9, 12]. В качестве предшественников использовали комплекс кобальта(III) [Co(Bipy)₂Cl₂]Cl, полученный при окислении соответствующего комплекса кобальта(II) газообразным хлором [13]. Хлор получали при взаимодействии перманганата калия с концентрированной соляной кислотой и осушали пропусканием через концентрированную серную кислоту [14]. 2,2′-Бипиридин (99%, Sigma-Aldrich), хлорид кобальта(II) (98%, безводный, Sigma-Aldrich), 6,7-дигидроксикумарин (98%, Sigma-Aldrich), пирокатехин (99%, Sigma-Aldrich), перхлорат лития (98%, Alfa Aesar), триэтиламин (99%, Sigma-Aldrich) использовали без предварительной очистки.

Общая процедура синтеза комплексов [Co(Bipy)₂(coumarin-diolate)]ClO₄ (I) и [Co(Bipy)₂(catecholate)]ClO₄ (II). К раствору [Co(Bipy)₂Cl₂]Cl (0.5 ммоль, 221.1 мг) в 15 мл метанола добавляли раствор триэтиламина (1 ммоль, 101.2 мг, 139 мкл) и соответствующего дигидроксисоединения (6,7-дигидроксикумарина (0.5 ммоль, 89 мг) или пирокатехина (0.5 ммоль, 55 мг)) в 10 мл метанола. Полученную смесь кипятили в течение 3 ч, затем охлаждали до комнатной температуры, добавляли раствор перхлората лития (1.25 ммоль, 133 мг) в 5 мл метанола и перемешивали 30 мин при охлаждении на водяной бане для кристаллизации целевых комплексов. Образовавшийся зеленый осадок отделяли фильтрованием, промывали изопропанолом и диэтиловым эфиром и высушивали при пониженном давлении.

I. Выход 258 мг (80%). ЯМР ¹Н (300 МГц; D₂O; δ, м.д.): 5.92 (д., J = 9.3 Гц, 1H, СНСНСОО), 6.50 (с., 1Н, СН), 6.70 (с., 1Н, СН), 7.42–7.45 (м., 4Н, СН), 7.61 (д., J = 9.4 Гц, 1H, СНСНСОО), 7.74–7.80 (м., 2Н, СН), 8.19–8.25 (м., 2Н, СН), 8.36–8.42 (м., 2Н, СН), 8.52 (д., J = 8.0 Гц, 2H, СН), 8.62 (д., J = 8.1 Гц, 2H, СН), 8.69 (д., J = 5.7 Гц, 1H, СН), 8.76(д., J = 5.7 Гц, 1H, СН). Масс-спектр (ESI), m/z: [Co(Bipy)₂(coumarin-diolate)]⁺, рассчитано – 547.08, найдено – 547.1.

II. Выход 269 мг (93%). ЯМР ¹Н (400 МГц; СD₃CN; δ, м.д.): 6.23–6.27 (м., 2Н, СН), 6.43–6.47 (м., 2Н, СН), 7.44–7.49 (м., 4Н, СН), 7.83 (т., J = 6.6 Гц, 2H, СН), 8.21 (т., J = 7.7 Гц, 2H, СН), 8.57 (д., J = 8.0 Гц, 2H, СН), 8.64 (д., J = 8.0 Гц, 2H, СН), 8.88 (д., J = 5.5 Гц, 2H, СН). Масс-спектр (ESI), m/z: [Co(Bipy)₂(catecholate)]⁺, рассчитано – 479.1, найдено – 479.2.

Спектры ЯМР ¹H комплексов кобальта регистрировали для растворов в дейтерированных ацетонитриле и воде с использованием спектрометров ЯМР Bruker Avance 300 и Bruker Avance 400 с рабочей частотой для протонов 300.15 и 400.13 МГц соответственно. Значения химических сдвигов определяли относительно сигналов остаточных протонов растворителей (¹H 1.94 м.д. – для ацетонитрила-d₃; ¹H 4.79 м.д. – для D₂O).

Масс-спектрометрический анализ комплексов кобальта и продуктов их восстановления выполняли с использованием жидкостного хромато-масс-спектрометра модели LCMS-2020 (Shimadzu, Япония) с ионизацией электрораспылением и квадрупольным детектором (регистрация положительных и отрицательных ионов с m/z в диапазоне 502000). Напряжение электрораспыления составляло 4.5 кВ, а температуры линии десольватирования и нагревательного блока – 250 и 400°C соответственно. В качестве распылительного и осушающего газа использовали азот (99.5%), подвижная фаза – ацетонитрил (99.9 + %, Chem-Lab) со скоростью потока 0.4 мл/мин. Объем анализируемеой пробы – 0.5 мкл.

РСА монокристаллов комплекса II проведен на дифрактометре Bruker Quest D8 CMOS (MoK_α-излучение, графитовый монохроматор, ω-сканирование) при Т = 100 K. Структура расшифрована с использованием программы ShelXT [15] и уточнена в полноматричном МНК с помощью программы Olex2 [16] в анизотропном приближении по F²_hkl. Положения атомов водорода рассчитаны геометрически и уточнены в изотропном приближении по модели наездника. Основные кристаллографические данные и параметры уточнения представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Кристаллографические данные, параметры эксперимента и уточнения структуры II

Параметр	Значение
Брутто-формула	C26H20N4O6ClCo
М	578.8
T, K	100
Кристаллическая система	Моноклинная
Пространственная группа	С2/с
Z	4
a, Å	11.9072(3)
b, Å	14.1760(3)
c, Å	14.7894(3)
α, град	90
β, град	105.3100(10)
γ, град	90
V, Å3	2407.80(9)
ρ (выч.), г/см3	1.597
µ, см–1	8.76
F(000)	1184
2θqmax, град	58
Число измеренных отражений	15754
Число независимых отражений	3188
Число отражений с I > 3σ(I)	3026
Количество уточняемых параметров	194
R1	0.0379
wR2	0.0999
GOОF	1.237
Остаточная электронная плотность (dmax /dmin), e Å–3	0.846/–0.639

 

Кристаллографические параметры для комплекса II депонированы в Кембриджском банке структурных данных (CCDC № 2262269; http://www.ccdc.cam.ac.uk/).

In situ спектроскопия ЯМР. В ампулу для спектроскопии ЯМР с завинчивающейся крышкой и септой помещали 10 мкмоль соответствующего комплекса кобальта I (6.4 мг) или II (5.8 мг), аскорбиновую кислоту (20 мкмоль, 3.6 мг), 550 мкл CD₃CN и 3 мкл дибромметана (внутренний стандарт). Далее ампулу замораживали в жидком азоте, вакуумировали и заполняли аргоном.

Для исходной смеси регистрировали спектр ЯМР ¹H при температуре 40°С на спектрометре Bruker Avance 300 с рабочей частотой для протонов 300.15 МГц. Значения химических сдвигов (δ, м.д.) определяли относительно остаточного сигнала растворителя (¹Н 1.94 м.д. для CD₃CN). Использовали следующие параметры регистрации: диапазон спектра – 150 м.д., время регистрации – 0.2 с, длительность релаксационной задержки – 0.6 с, длительность импульса – 9.5 мкс, количество накоплений – 32. Полученные спады свободной индукции обрабатывали для увеличения соотношения сигнал/шум с помощью экспоненциального взвешивания с коэффициентом до 1. Затем через септу с помощью шприца добавляли 150 мкл D₂O, смесь встряхивали до полного растворения аскорбиновой кислоты. Дальнейшую регистрацию спектров ЯМР проводили каждые 2 мин в течение 40 мин при температуре 40°С с использованием параметров, как при регистрации спектра исходной смеси. Скорость конверсии оценивали по расходованию исходного комплекса. Содержание комплекса в смеси (в % от исходного) рассчитывали по отношению интегральной интенсивности сигнала протонов дибромметана (5.09 м.д.) к интегральной интенсивности дублетов со значением химических сдвигов 8.84 м.д. (для I) и 8.88 м.д. (для II), выбранных из-за удобства интегрирования, поскольку они наблюдались на всем протяжении восстановления и не перекрывались другими сигналами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбранные комплексы кобальта(III) [Co(Bipy)₂(coumarin-diolate)]ClO₄ (I) и [Co(Bipy)₂(catecholate)]ClO₄ (II) были синтезированы по ранее описанным методикам [9, 12] при взаимодействии [Co(Bipy)₂Cl₂]Cl c 6,7-дигидроксикумарином и пирокатехином соответственно в присутствии триэтиламина и перхлората лития. Комплексы выделены в индивидуальном виде и охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР. Строение комплекса II также было подтверждено с помощью рентгеноструктурного анализа (рис. 1). Согласно полученным таким образом данным ион кобальта(III), занимающий в кристалле частное положение (ось второго порядка, проходящая через ион металла и центр линии O…O дианиона катехолата), находится в низкоспиновом состоянии, на что однозначно указывают длины связей Co–N < 1.95 Å [17]. Его координационное окружение, образованное четырьмя атомами азота двух симметрически-эквивалентных бипиридиновых лигандов (Co–N 1.9323(14) и 1.9452(14) Å) и двумя симметрически-эквивалентными атомами кислорода дианиона катехолата (Co–O 1.8804(12) Å), имеет форму, близкую к октаэдрической. Количественно это можно подтвердить с помощью “меры симметрии” [18], описывающей отклонение координационного полиэдра CoX₆ (X=O, N) от идеального октаэдра. Чем это значение меньше, тем лучше форма полиэдра описывается соответствующим многогранником. В комплексе II соответствующая величина, оцененная на основе рентгенодифракционных данных с помощью программы Shape 2.1 [18], составляет всего 0.365. Для сравнения, “мера симметрии”, описывающая отклонение координационного полиэдра от идеальной тригональной призмы, принимает заметно более высокое значение, равное 14.913. Симметрически-эквивалентные бипиридиновые лиганды в кристалле данного комплекса образуют стекинг-взаимодействие с расстоянием между центроидами пиридиновых колец и углом между ними, равным 3.3986(17) и 3.4713(17) Å и 3.90(6)° соответственно, которые объединяют катионы [Co(Bipy)₂(catecholate)]⁺ в 1D-цепи вдоль кристаллографической оси c (рис. 2).

 

Рис. 1. Общий вид комплекса II, иллюстрирующий координационное окружение иона кобальта(III). Здесь и далее перхлорат-анионы не показаны, а неводородные атомы представлены в виде эллипсоидов тепловых колебаний (p = 30%). Нумерация приведена только для иона металла и симметрически-независимых гетероатомов.

 

Рис. 2. Фрагмент кристаллической упаковки комплекса II, иллюстрирующий образование 1D-цепей за счет стекинг-взаимодействия между бипиридиновыми лигандами (выделены розовым цветом).

 

Восстановление комплексов кобальта(III) I и II исследовали in situ c помощью спектроскопии ЯМР с использованием разработанного нами ранее подхода [11] с небольшими модификациями. Ампулу с завинчивающейся крышкой и септой, содержащую раствор соответствующего комплекса в ацетонитриле-d₃ с 2 эквивалентами аскорбиновой кислоты и 3 мкл дибромметана, выступающего в роли внутреннего стандарта, замораживали в жидком азоте, вакуумировали и заполняли аргоном. Для полученной смеси регистрировали спектр ЯМР ¹Н при температуре 40°С. Затем в ампулу через септу добавляли дейтерированную воду для растворения аскорбиновой кислоты с последующей регистрацией спектров ЯМР ¹Н при 40°С.

Восстановление гетеролептических комплексов кобальта(III) (схема 2) приводило к изоструктурным комплексам кобальта(II), которые быстро элиминировали дианион 2-оксо-2Н-хромен-6,7-диолат или катехолат, что сопровождалось образованием комплекса кобальта(II) [Co(Bipy)₂(Solv)₂]²⁺. Последний в растворе вступал в реакцию обмена лигандами с аналогичными комплексными ионами, в результате чего образовались комплекс [Co(Bipy)₃]²⁺ и сольватированные ионы кобальта [9, 11].

 

Схема 2.

 

На рис. 3 приведены спектры ЯМР ¹Н, иллюстрирующие динамику процесса восстановления комплекса II аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона. Данный процесс приводил к образованию комплексов, содержащих парамагнитный ион Co²⁺, в связи с чем в спектрах ЯМР ¹Н можно было выделить диамагнитную (от 0 до 10 м.д.) и парамагнитную (от 15 до 120 м.д.) области. Первая содержала сигналы исходного комплекса, аскорбиновой кислоты, продукта ее окисления и свободного пирокатехина, а вторая – сигналы образующихся комплексов кобальта(II). Видно, что по мере протекания реакции интенсивность сигналов в диамагнитной области уменьшается, а в парамагнитной, наоборот, увеличивается. При этом количество наблюдаемых сигналов в парамагнитной области спектра оставалось постоянным в процессе восстановления, а менялась только их относительная интенсивность. Oтметим, что парамагнитные области спектров ЯМР, зарегистрированных спустя 40 мин после инициирования реакции восстановления комплексов кобальта(III) I и II, содержали восемь сигналов, значения химических сдвигов для которых совпадали (рис. 4). В спектре продуктов восстановления комплекса II обнаружено три дополнительных сигнала с низкой интенсивностью. Однако такие же сигналы появлялись и в спектрах смеси I с аскорбиновой кислотой спустя несколько часов после начала реакции. Совпадение значений химических сдвигов для сигналов в парамагнитной области указывало на то, что комплексы кобальта(II) состава [Co(Bipy)₂(L)]²⁺А^–₂, где L – дианион 2-оксо-2Н-хромен-6,7-диолат или катехолат, а А^– – противоион, не накапливаются в реакционной смеси. Из сравнения полученных спектров со спектром комплекса кобальта(III) [Co(Bipy)₃](ClO₄)₂, зарегистрированным в ацетонитриле-d₃, видно, что наиболее интенсивные сигналы совпадают с сигналами в спектре указанного комплекса (см. рис. 4, отмечены *). Из анализа полученных данных можно сделать вывод, что восстановление комплексов кобальта(III) I и II аскорбиновой кислотой сопровождается образованием комплекса кобальта(II) [Co(Bipy)₃](ClO₄)₂ в качестве основного продукта. Масс-спектры реакционных смесей (рис. 5) наряду с сигналами, соответствующими исходным комплексным ионам [Co(Bipy)₂(L)]⁺, содержали сигналы с m/z 263.6, 405.9 и 470.2, относящиеся к ионам [Co(Bipy)₃]²⁺, [Co(Bipy)₂Cl]⁺ [Co(Bipy)₂(ClO₄)]⁺. Появление в масс-спектре аддуктов с хлорид-анионом может быть связано с неполной заменой хлорид-иона на перхлорат при синтезе исследованных комплексов из [Co(Bipy)₂Cl₂]Cl. Данные спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии подтверждают механизм восстановления, представленный на схеме 2.

 

Рис. 3. Динамика изменения спектра ЯМР 1Н с течением времени при восстановлении комплекса II аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона (спектр зарегистрирован в смеси ацетонитрила-d3 и дейтерированной воды, 4 : 1 об.).

 

Рис. 4. Сравнение парамагнитных областей спектров ЯМР комплекса [Co(Bipy)3]ClO4 (сверху) и продуктов восстановления I (по центру) и II (снизу).

 

Рис. 5. Сравнение масс-спектров продуктов восстановления комплексов I (а) и II (б).

 

В дополнение к информации о составе реакционной смеси, полученной при восстановлении комплексов кобальта(III) I и II аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона, анализ данных in situ спектроскопии ЯМР позволил сравнить скорость реакции для двух комплексов, определить порядок реакции и константу скорости. На рис. 6 представлено сравнение кинетических кривых расходования комплексов I и II в процессе их восстановлении аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона. Из рис. 6 видно, что комплекс, содержащий дианион катехолат, восстанавливается в ~2 раза быстрее. Периоды полупревращения для комплексов II и I составили 9 и 19 мин соответственно. Зависимость натурального логарифма концентрации исходных комплексов от времени аппроксимировалась прямой с коэффициентом достоверности, близким к единице (рис. 7). Линейная аппроксимация свидетельствовала о первом порядке по исходному реагенту для процесса восстановления исследованных комплексов. По тангенсу угла наклона прямых, изображенных на рис. 7, оценена константа скорости процесса восстановления комплексов кобальта(III) II и I аскорбиновой кислотой в инертной атмосфере при 40°С, которая составила 2.0 × 10^–3 и 1.2 × 10^–3 с^–1 соответственно. Увеличение скорости восстановления комплекса при замене 6,7-дигидроксикумарина на пирокатехин может быть связано c уменьшением электронной плотности на ионе кобальта за счет уменьшения размера сопряженной π-системы при переходе от 6,7-дигидроксикумарина к пирокатехину.

 

Рис. 6. Кинетические кривые расходования комплексов I и II при восстановлении аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона.

 

Рис. 7. Зависимость логарифмов концентрации ln[C] комплексов I и II от времени реакции при восстановлении аскорбиновой кислотой в атмосфере аргона.

 

Таким образом, с помощью спектроскопии ЯМР in situ нами было изучено восстановление комплексов кобальта(III) II и I, отличающихся только лигандом, выступающим в роли модельного лекарственного препарата. Было показано, что комплекс II, содержащий дианион катехолат, восстанавливается аскорбиновой кислотой в ~2 раза быстрее в сравнении с комплексом, содержащим дианион 2-оксо-2Н-хромен-6,7-диолат, и определены константы скорости процессов восстановления. Зависимость скорости редокс-активации комплекса кобальта от структуры модельного лекарственного препарата, входящего в его состав, указывает на необходимость молекулярного дизайна оптимального комплекса для адресной доставки определенного лекарственного препарата.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данные спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии получены с использованием научного оборудования Центра исследования строения молекул ИНЭОС РАН при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (госзадание № 075-03-2023-642).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-73-00155).

Об авторах

И. А. Никовский

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН

Email: khakina90@ineos.ac.ru
Россия, Москва

К. А. Спиридонов

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН; Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Email: khakina90@ineos.ac.ru
Россия, Москва; Москва

А. А. Даньшина

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН; Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: khakina90@ineos.ac.ru
Россия, Москва; Долгопрудный

Е. А. Хакина

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: khakina90@ineos.ac.ru
Россия, Москва

Ю. В. Нелюбина

Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН

Email: khakina90@ineos.ac.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы