Фактор рибонуклеопротеиновых комплексов Ybx1 стабилизирует материнскую мРНК гена ssx2ip, кодирующего белок созревания центросом, в эмбриональном развитии лягушки Xenopus laevis

Полный текст

Сокращения: CSD – домен холодового шока; LIM-домен – от первых букв названий трех белков, у которых был впервые описан данный домен: LIN-11, Isl-1 и MEC-3; 6Myc-C-Ybx1– делеционный мутант белка Ybx1, содержащий последовательности шести пептидов Myc; 6Myc-Ybx1– полноразмерный белок Ybx1, содержащий последовательности шести пептидов Myc; pou5f3 – ген, кодирующий фактор плюрипотентности; RIPA – метод рибоиммунопреципитации; rxrg – ген, кодирующий ядерный рецептор ретиноевой кислоты; ssx2ip – ген, кодирующий консервативный белок Ssx2ip (Msd1, ADIP), компонент созревания центросом; Ybx1 – фактор рибонуклеопротеиновых комплексов; МО – морфолиновые олигонуклеотиды; мРНП – матричные рибонуклеопротеиды.

ВВЕДЕНИЕ

Материнские мРНК и белки определяют раннее эмбриональное развитие до активации зиготического генома [1]. Перед активацией зиготического генома транскрипционно неактивные ранние эмбрионы зависят исключительно от материнских транскриптов и белков, накопленных в оогенезе и необходимых для начальных стадий развития, включая оплодотворение, дробление и раннюю разметку эмбриона [2]. Чтобы стимулировать созревание ооцитов и ранний эмбриогенез в отсутствие транскрипции, стабильность транскриптов и синтез белка необходимо точно настроить с помощью специальных регуляторов трансляции, нацеленных на нужные группы материнских мРНК [3–9]. Регуляция стабильности и трансляции материнских транскриптов определяется комбинацией цис-мотивов, присутствующих в мРНК, и транс-регуляторов, РНК-связывающих белков, которые связываются с этими последовательностями.

Белок Ybx1 – один из наиболее изученных транс-регуляторов, способных эффективно стабилизировать мРНК, предотвращая ее деградацию. В этом процессе ключевую роль играет его домен холодового шока (CSD), который отвечает за связывание с РНК. Образуя компактные мРНП (матричные рибонуклеопротеиды) с недоступными экзонуклеазам 5′- и 3′-концами, Ybх1 ингибирует трансляцию и стабилизирует мРНК [10]. Этот механизм очень важен для половых клеток, особенно ооцитов. Показано, что нокаут гомолога Ybx1, основного зародышевого белка MSY2 мыши, приводит к дестабилизации мРНК и, следовательно, к остановке роста и созревания ооцитов [11]. В ооцитах MSY2 упаковывает мРНК в очень компактные комплексы, недоступные для клеточного аппарата деградации мРНК. Во время созревания ооцитов MSY2 фосфорилируется киназой CDK1, что вызывает переход MSY2-содержащих мРНП в менее компактные комплексы. Таким образом, запускается и трансляция, и распад мРНК [12]. Кроме этого, в случае развивающихся эмбрионов важно, чтобы материнские мРНК локализовались в определенных областях ооцита или эмбриона, где они затем транслируются в белок. Это помогает установить асимметрию в развивающемся организме, т.е. производить ткани, которые в конечном итоге станут верхней или нижней, передней или задней, левой или правой частью организма. Показано, что у эмбрионов рыбки Danio rerio Ybx1 не только предотвращает преждевременную трансляцию и передачу сигналов Sqt/Nodal, но и участвует в локализации транскриптов Sqt/Nodal в дорсальной половине эмбриона [13].

Изучение регуляции экспрессии Ssx2ip представляет интерес в связи с тем, что этот белок участвует в заякоривании микротрубочек на центросоме, вовлечен в организацию актинового цитоскелета [14] и, взаимодействуя с несколькими мембранными белками в ресничках, принимает участие в процессе цилиогенеза. Кроме этого, показана важная функция данного белка в раннем развитии: нокдаун Msd1, ортолога Ssx2ip из рыбки D. rerio, вызывает нарушение лево-правой асимметрии эмбриона [15]. Следует отметить, что участие гена ssx2ip в эмбриональном развитии только начинает привлекать внимание исследователей. Совсем недавно появилась работа с использованием эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis [16], в которой было обнаружено его взаимодействие с N-концевым доменом белка Wtip (Wilms tumor-1-interacting protein), представляющим собой адаптер, который содержит LIM-домены и модулирует сократимость актомиозина и цилиогенез у эмбрионов X. laevis. Wtip – представитель семейства зиксин-подобных белков. Его С-конец Wtip с тремя LIM-доменами ассоциирован с актин-связывающим белком Shroom3 и модулирует апикальное сужение в эктодерме клетки [16]. В то же время N-концевой домен Wtip локализуется в базальных тельцах в многореснитчатых клетках [16], и его взаимодействующие партнеры были неизвестны до этого исследования. Интересно, что одновременный нокдаун двух генов – wtip и ssx2ip – у ранних эмбрионов X. laevis выявил функциональное взаимодействие их белков во время закрытия нервной трубки [16]. Это указывает на возможную роль комплекса Wtip с Ssx2ip в ремоделировании клеточных контактов при морфогенезе нервной трубки.

В нашей предыдущей работе мы показали, что в раннем эмбриогенезе шпорцевой лягушки Ybx1 взаимодействует с белком зиксином, родственным Wtip [17]. Такое взаимодействие приводит к вытеснению мРНК белка эмбрионального стволового статуса клеток, Pou5f3.3 (ортолог OCT4 млекопитающих), а также мРНК рецептора ретиноевой кислоты Rxrg из их комплекса с Ybx1, что приводит к дестабилизации этих мРНК [17, 18]. Соответственно, искусственное снижение концентрации белка зиксина в эмбрионе вызывало увеличение концентрации мРНК pou5f3.3 и rxrg. В результате широкоформатного поиска c применением секвенирования нового поколения генов, экспрессия которых изменяется в клетках эмбриона шпорцевой лягушки X. laevis в ответ на искусственное подавление экспрессии гена zyxin, помимо генов pou5f3.3 и и rxrg мы обнаружили ген ssx2ip [17, 18], кодирующий белок Ssx2ip. В связи с этим мы предположили, что стабильность мРНК ssx2ip может регулироваться аналогично мРНК pou5f3.3 и и rxrg, т.е. за счет образования комплекса с белком-шапероном рибонуклеопротеиновых комплексов Ybx1 [19].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проверки профиля экспрессии ssx2ip по стадиям развития у эмбрионов X. laevis по имеющейся базе данных Xenbase (https://www.xenbase.org/xenbase/) оказалось, что это материнский ген, т.е. его мРНК запасается в ооцитах, сохраняется на ранних стадиях дробления и после активации генома зародыша уничтожается (рис. 1a, профили экспрессии). Поскольку мы показали способность белка Ybx1 специфично связывать и предохранять именно материнскую мРНК от деградации [17, 18], было интересно проверить этот феномен на материнской мРНК еще одного гена.

 

Рис. 1. (а) – Профиль экспрессии материнского гена ssx2ip (L-гомолог – зеленый, S-гомолог – синий) по стадиям развития лягушки X. laevis (по Xenbase); (б) – схема эксперимента по микроинъекциям в эмбрионы X. laevis; (в) – влияние экзогенных белков 6Myc-Ybx1 и 6Myc-C-Ybx1 на уровень мРНК гена ssx2ip в сравнении с ранее обнаруженными [17, 18] генами pou5f3.3 и rxrg, выявленное методом ОТ-ПЦР (* р < 0.05, ns – статистически незначимо); (г) – влияние подавления трансляции морфолиновыми олигонуклеотидами (МО) мРНК ybx1 на количество мРНК материнских генов pou5f3.3, rxrg, ssx2ip и восстановление нормального уровня этих транскриптов инъекцией синтетической РНК 6myc-ybx1, выявленное методом ОТ-ПЦР (* р < 0.01, ns – статистически незначимо); (д) – уровень мРНК ssx2ip в ответ на микроинъекции синтетической мРНК 6myc-ybx1 в условиях блокирования транскрипции актиномицином D, выявленное методом ОТ-ПЦР (* р < 0.05, ns – статистически незначимо). Для нормализации данных использовали ОТ-ПЦР c мРНК гена домашнего хозяйства odc1. Все вышеприведенные данные, выявленные методом ОТ-ПЦР, представлены в виде кратного изменения экспрессии генов в опытных эмбрионах по сравнению с экспрессией в контрольных эмбрионах. Во всех случаях для нормализации данных использовали гены odc1 и eef1a1, показаны стандартные отклонения, полученные в результате трех независимых экспериментов; (е) – результаты РНК-иммунопреципитации: осаждение факторами 6Myc-Ybx1 и 6Myc-C-Ybx1 мРНК ssx2ip в сравнении с ранее изученными мРНК rxrg и pou5f3.3 [17, 18] (* р < 0.01, ns – статистически незначимо). В качестве контроля использовали смолу с антителами анти-Flag. Данные представлены в виде процентного соотношения связавшихся мРНК к общему количеству данной мРНК в лизате. Во всех случаях показаны стандартные отклонения, полученные в результате трех независимых экспериментов; (ж) – эффект от подавления трансляции мРНК цитоскелетного белка зиксина морфолиновыми олигонуклеотидами (* р < 0.05, ns – статистически незначимо). Количество мРНК ssx2ip уменьшается, в то время как уровень мРНК генов pou5f3.3 и rxrg возрастает в ответ на нокдаун гена zyxin.

 

Исследования проводили по предложенной ранее [17, 18] схеме: во-первых, посмотрели ответ на усиление/подавление уровня фактора Ybx1 и проверили специфичность результатов методом “спасения” (resque); во-вторых, исключили возможность активации экспрессии гена ssx2ip фактором Ybx1, подтвердив увеличение количества его мРНК в условиях тотального подавления транскрипции; в-третьих, проверили методом рибоиммунопреципитации (RIPA) способность Ybx1 к образованию комплексов непосредственно с мРНК гена ssx2ip.

Для усиления экспрессии Ybx1 мы использовали имеющиеся плазмиды для получения синтетической мРНК, кодирующие полноразмерный меченный 6Мyc-эпитопом фактор Ybx1 (6Myc-Ybx1) и делеционный мутант Ybx1 (6Myc-C-Ybx1) без N-концевой части, включающей домен холодового шока (CSD) [17]. Укороченный с N-конца мутант, лишенный CSD, использовали в качестве отрицательного контроля. Схемы конструкций приведены на рис. 1б. Микроинъекции РНК в эмбрионы проводили в два бластомера с инкубацией до стадии гаструлы (11-я стадия). Далее зародыши лизировали, выделяли тотальную РНК [17, 18], а затем проводили количественную оценку транскриптов исследуемого гена и материнских генов pou 5F3.3 и rxrg в качестве положительного контроля методом ОТ-ПЦР.

В результате мы показали, что сверхэкспрессия только полноразмерного фактора 6Мyc-Ybx1 приводит к значительному увеличению количества транскриптов ssx2ip, сравнимому с уровнем усиления экспрессии гена pou5f3.3 (рис. 1в).

При подавлении экспрессии Ybx1 наблюдалось уменьшение количества мРНК ssx2ip, но при добавлении синтетической мРНК 6myc-Ybx1 происходило восстановление (спасение, resque) исходного уровня транскриптов ssx2ip (рис. 1г). Это подтверждает специфичность наблюдаемого ответа на изменение уровня Ybx1.

Экспрессию Мyc-тагированного Ybx1 и его делеционного мутанта подтверждали методом вестерн-блоттинга. С использованием антител к Myc-пептиду были детектированы полосы с соответствующей расчетным молекулярным массам электрофоретической подвижностью (45 кДа для 6Myc-C-Ybx1 и 60 кДа для 6Myc-Ybx1 [17]).

Для проверки возможности активации транскрипции мРНК ssx2ip мы проверили изменение ее количества в ответ на повышение концентрации Ybx1 в условиях тотального ингибирования транскрипции актиномицином D. Мы использовали отработанную ранее методику по инъекциям ингибитора транскрипции в полость бластоцеля [17]. Поскольку при полном ингибировании транскрипции уровень мРНК ssx2ip у эмбрионов со сверхэкспрессией Ybx1 был намного выше, чем у контрольных, мы подтвердили, что это увеличение происходит за счет стабилизации материнской мРНК, накопленной в ооцитах (рис. 1д).

Полученные результаты дают возможность предположить, что белок Ybx1 связывает мРНК ssx2ip, образуя стабильный рибонуклеопротеиновый комплекс. Применив разработанный нами метод RIPA (RiboImmunoPrecipitation) [20], мы показали образование комплекса между полноразмерным 6Myc-Ybx1 и мРНК ssx2ip, которое сравнили с изученными генами pou5f3.3 и rxrg. Следует отметить, что делеционный мутант 6MycС-Ybx1, лишенный CSD и содержащий только С-концевой домен, и в этом случае не смог образовать устойчивый комплекс, что доказывает необходимость наличия домена холодового шока для взаимодействия Ybx1 с РНК.

Ранее мы показали, что при понижении уровня цитоскелетного белка зиксина происходит возрастание уровня мРНК двух материнских генов: гена pou5f3.3, маркера стволовых клеток, гомолога известного фактора млекопитающих OCT4, и гена rxrg, ядерного рецептора ретиноевой кислоты, и что механизм этого явления связан с отрицательным влиянием зиксина на стабильность комплексов этих мРНК с фактором Ybx1 [17, 18].

Было интересно проверить, как влияет подавление зиксина, компонента комплекса фокальной адгезии, на уровень мРНК белка Ssx2ip. Мы использовали отработанную ранее методику подавления трансляции зиксина в клетках эмбрионов морфолиновыми олигонуклеотидами (МО) [17, 18, 21]. В качестве положительных контролей выбрали гены pou5f3.3 и rxrg, экспрессия которых стабильно повышается при подавлении зиксина [17]. В результате мы обнаружили, что в отличие от двух ранее изученных нами генов, в ответ на подавление зиксина наблюдается уменьшение количества транскриптов ssx2ip (рис. 1ж). Это наводит на предположение о том, что стабильность мРНК ssx2ip регулируется с участием зиксина, возможно, по другому механизму. Эти данные имеют большую ценность, поскольку показывают, что, во-первых, предложенный нами ранее механизм регуляции стабильности мРНК генов стволового статуса клеток за счет взаимодействия зиксина и Ybx1 специфичен именно для генов, участвующих в регуляции дифференцировки клеток; во-вторых, учитывая данные по ассоциации Ssx2ip с Wtip, не исключена возможность взаимной регуляции экспрессии цитоскелетных белков Ssx2ip и зиксина на ранних стадиях развития. Идентификация материнского гена ssx2ip, стабильность транскриптов которого зависит от Ybx1 по зиксин-независимому механизму, открывает перспективы по поиску и изучению других механизмов регуляции стабильности и, возможно, трансляционной активности материнских мРНК, взаимодействующих с фактором Ybx1.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение векторов. Стратегии создания ДНК-конструкций подробно описаны в работе Parshina et al. [17]. Векторные конструкции для экспрессии белка Ybx1 (Gene ID: 379054, база данных NCBI) представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Векторные конструкции на основе плазмиды pCS2-MT для экспрессии белка Ybx1

ДНК-конструкция	Праймеры и стратегии клонирования, использованные для создания ДНК-матриц для синтетических мРНК
pCS2MT-Ybx1	ПЦР с тотальной кДНК X. laevis с праймерами: F 5′-ATGCCCATGGTTATGAGC-AGCGAGGTTGAAACAC-3′ и R 5′-ATGCCTCGAGTTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGCC-3′ Рестрикция по сайтам NcoI и XhoI, лигирование в плазмиду pCS2-MT
pCS2MT-CTD Ybx1	Рестрикция pB42-CTD Ybx1 по сайтам EcoRI и XhoI Клонирование CTD Ybx1 в плазмиду pCS2-MT R1

 

Получение синтетической мРНК и микроинъекции мРНК в зародыши X. laevis. Получение зародышей X. laevis и искусственное оплодотворение, а также синтез мРНК и микроинъекции проводили по методике, разработанной нами ранее [21].

Выделение тотальной РНК из эмбрионов X. laevis, получение кДНК и ОТ-ПЦР. Зародыши X. laevis лизировали в тризоле и выделяли тотальную РНК [17, 18] с использованием реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) и набора CleanRNA (Евроген) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали с использованием набора MMLV RT (Евроген) из 250 нг РНК-образца, а для ПЦР применяли qPCRmix-HS SYBR (Евроген). ОТ-ПЦР проводили в амплификаторе DTPrime 4 qPCR (ДНК-Технология, Россия) по методике, разработанной нами ранее [17, 21]. Последовательности праймеров представлены в табл. 2. В качестве положительных контролей использовали материнские гены pou5f3.3 и rxrg. Для проверки статистической достоверности данные ОТ-ПЦР, полученные от трех независимых экспериментов, переносили в программу Microsoft Excel и анализировали с использованием метода ΔΔCt [22]. Для нормирования уровня экспрессии генов в качестве внутренних контролей использовали уровни экспрессии генов eef1a1 и odc1, кодирующих, соответственно, фактор элонгации EF-1α и орнитиндекарбоксилазу (ODC).

 

Таблица 2. Праймеры для ОТ-ПЦР, использованные в работе

Ген	Последовательности праймеров (5′-3′)	Длина ПЦР-фрагмента, п.н.
odc1	F: GCCAGTTCTAACAAAGAAACCCA R: TCTACGATACGATCCAGCCCA	93
eef1a1	F: GTTCATTTACCGCACAGGTTATCA R: ACACAGGGGCATATCCAGCA	70
ssx2ip	F: TCGTGTGTCCTTGCTATTCCT R: CCAACATAAAAGAGTTTGAGGGGA	91
rxrg	F: CTTCCTTCTCGCACCGCTC R: GCCTACTCCCGCATTGTGT	98
pou5f3.3	F: CACAAAACTGGACTTACTGGGG R: TCTCAACTGCCCTTACCTTCTC	70

 

Блокирование трансляции эндогенной мРНК инъекцией антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов (МО). Для подавления экспрессии Ybx1 трансляцию его эндогенной мРНК блокировали путем инъекций антисмысловых (анти-Ybx1) морфолиновых олигонуклеотидов (МО, 0.5 мM) в два бластомера на стадии начала дробления, инкубировали также до стадии 13, гаструлы [17].

Блокирование транскрипции актиномицином D. Транскрипцию в эмбрионах X. laevis подавляли путем микроинъекции 0.2 мМ актиномицина D (Sigma, США) в бластоцель на стадии 7. Эмбрионы развивались до стадии 13.

Осаждение рибонуклеопротеиновых комплексов методом рибоиммунопреципитации (RIPA). Осаждение рибонуклеопротеиновых комплексов проводили из лизатов зародышей X. laevis на стадии ранней гаструлы, инъецированных синтетическими мРНК, кодирующими полноразмерный белок 6Myc-Ybx1 (опыт) и делеционный мутант 6Myc-С-Ybx1 (отрицательный контроль). Для осаждения использовали разработанную нами ранее методику [17, 20].

Гель-электрофорез и иммуноблоттинг. Уровень белков Ybx1, 6Myc-Ybx1 и 6Myc-C-Ybx1 измеряли по разработанной нами методике [21] на лизатах эмбрионов X. laevis с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Myc-содержащие белки детектировали при помощи моноклональных анти-Myc-антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Sigma, США). Стабилизированный субстрат Western Blue (Promega, США) использовали для обнаружения антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы установили, что белок Ybx1 способен связывать и стабилизировать мРНК, кодирующую белок Ssx2ip (synovial sarcoma X breakpoint 2 interacting protein), в клетках раннего эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

Однако в отличие от мРНК pou5f3.3 и rxrg, искусственное снижение концентрации зиксина в эмбрионе приводило не к увеличению, а к снижению концентрации мРНК ssx2ip, что указывает на возможно иной механизм регуляции белком зиксином стабильности этой мРНК.

Полученные результаты, во-первых, расширяют список мРНК, взаимодействующих в раннем эмбриогенезе с РНК-связывающим белком Ybx1, а во-вторых, открывают перспективу для изучения возможной роли цитоскелетного белка зиксина в регуляции экспрессии Ssx2ip в эмбриональном развитии.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-74-30005 (https://rscf.ru/project/23-74-30005/).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных кем-либо из авторов данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Е. А. Паршина

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

А. Г. Зарайский

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Н. Ю. Мартынова

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Список литературы

Дополнительные файлы