Vitamin В₁₂ in drug delivery systems

Толық мәтін

1. ВВЕДЕНИЕ

Витамин В₁₂ (В₁₂) необходим для осуществления многочисленных биохимических процессов, в том числе синтеза и обмена белков, углеводов, липидов, созревания эритроцитов и миелинового слоя. Поскольку В₁₂ не синтезируется in vivo (за исключением некоторых прокариот и архей), он попадает в организм человека посредством приема пищи. Основной источник В₁₂ – продукты животного происхождения (мясо, молоко, рыба и т.д.); лишь небольшую долю вещества можно получить с помощью растительной пищи, например, сушеных зеленых водорослей [1, 2].

Недостаток В₁₂ в клетках может возникать в результате наследственных факторов, которые обусловливают снижение всасываемости витамина В₁₂ в кишечнике: мутациях в генах CUBN и AMN (синдром Имерслунд–Гресбека) или различных мутациях гена GIF (мутации в сайтах сплайсинга, частичная делеция гена и др.) [3, 4]. Кроме того, дефицит В₁₂ наблюдается при повышенной потребности в нем (например, при беременности), неполноценного питания, нарушения всасываемости витамина (в том числе впоследствии хирургических вмешательств в желудочно-кишечный тракт), дефицита транспортных белков и др. При выраженном дефиците В₁₂ наблюдаются системные нарушения со стороны кроветворной, нервной и эндокринной систем, атрофии слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и развитие характерной клиники фуникулярного миелоза (повреждение спинного мозга).

Суточная потребность взрослого человека в витамине В₁₂ составляет 2.4 мкг. Для восполнения дефицита В₁₂ рекомендуется пероральное применение форм препарата или парентеральные (чаще внутримышечные) инъекции. Используют дозы 100–200 мкг/сут через день, а в случае нарушения функции нервной системы дозировку увеличивают до 500 мкг/сут в первую неделю ежедневно, далее – с интервалами между введениями до 5– 7 дней [5]. Остро стоит проблема восполнения дефицита В₁₂ у пациентов с существенными нарушениям ЖКТ, такими как целиакия и болезнь Крона, а также у пациентов после операций (уменьшение желудка и/или перестраивание кишечника вследствие бариатрической хирургии, резекция желудка или кишечника, особенно подвздошной кишки) [6, 7], поскольку пероральный прием препарата не приводит к удовлетворительным результатам, а пожизненная инъекционная терапия снижает качество жизни и сопряжена с развитием местных осложнений.

В качестве альтернативы для таких пациентов могут использоваться назальные формы В₁₂, для которых характерна биодоступность 2–5%, что соответствует показателю при пассивной адсорбции витамина в кишечнике [8]. Результаты клинических испытаний назальной формы В₁₂ CureSupport (Нидерланды) [9], проведенных на 51 пациенте с синдромом хронической усталости, показали увеличение концентрации В₁₂ в плазме крови в 3 раза через 3 месяца введения по 5 мг – по одной капле в каждую ноздрю 2 раза в неделю.

Также в качестве альтернативы существуют сублингвальные формы В₁₂. Согласно ретроспективному анализу перспективности использования таких систем в терапии, было показано [10], что прием сублингвальной формы Contract Pharmacal Corp. (США) позволяет повысить концентрацию В₁₂ в крови до уровня, который примерно соответствует результатам при внутримышечных инъекциях. К достоинствам такой формы введения относятся удобство и простота использования, что положительно сказывается на соблюдении пациентом рекомендаций врачей при длительной терапии.

В последнее время предлагается использовать В₁₂ не в свободной форме, а в комплексе с наноматериалами различной химической природы. При инкапсуляции препарата в систему доставки (носитель) возможно достижение замедленного высвобождения В₁₂ и увеличение его биодоступности. Подобные системы представляют собой перспективные материалы с точки зрения удобной формы В₁₂ для высокоэффективной терапии дефицита витамина [8]. С другой стороны, в литературе предлагается использовать В₁₂ для решения и других важных биомедицинских задач. В частности, в связи с особенностями некоторых свойств В₁₂ возможно его использование с целью направленной регуляции характеристик другой биологически активной молекулы.

Данный обзор посвящен исследованию существующих систем доставки, содержащих В₁₂ в качестве основного или вспомогательного компонента, для определения наиболее перспективной траектории поиска новых высокоэффективных лекарственных форм.

2. ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИТАМИНА В₁₂

В₁₂ относится к водорастворимым витаминам В-группы (растворимость в воде ~10 мг/мл [11]). С химической точки зрения под термином “витамин В₁₂” зачастую понимают круг корриноидных соединений (макроциклов, схожих с порфиринами). Присутствие иона кобальта обусловливает более распространенное название этой группы соединений – кобаламины (рис. 1): 5'-дезоксиаденозилкобаламин, метилкобаламин, гидроксокобаламин и глутатионилкобаламин и др. Среди всех кобаламинов наиболее часто в работах упоминается цианокобаламин – наиболее стабильная форма В₁₂. Вместе с гидроксикобаламином они представляют собой витамеры, т.е. соединения со схожей структурой и биологической функцией в организме.

 

Рис. 1. Химические структуры кобаламинов.

 

Часть молекулы В₁₂, связанная с кобальтом (корриновое кольцо), имеет плоское строение. В перпендикулярной плоскости расположен нуклеотидный фрагмент. Образованная структура носит название кобаламина. Шесть ковалентных связей кобальта распределены следующим образом: четыре связи – с атомами азота корринового кольца, одна связь – с азотом в нуклеотидном фрагменте, а шестая связь – с цианогруппой (для цианокобаламина), метильной группой (для метилкобаламина) и т.д. [12].

Стабильность цианокобаламина зависит от условий среды, в том числе от рН и температуры. Например, в работе [13] показано, что наибольшее значение времени полужизни (t_1/2) витамина наблюдается при рН 6 и 4°С (t_1/2 = 231 день). При нагреве растворов до 37°С увеличивается скорость деградации В₁₂: наблюдается снижение t_1/2 в ~2 раза. Важно отметить, что значение рН в большей степени оказывает влияние на стабильность цианокобаламина. Так, при 37°С для рН 6 t_1/2 составляет 116 дней, а при рН 2 t_1/2 – 8 дней.

Связанный с белками В₁₂ попадает в пищеварительную систему с пищей (рис. 2). Высвобождение В₁₂ происходит в желудке в результате кислотного гидролиза белков, после чего витамин образует комплекс с белком транскобаламином I, что позволят защитить В₁₂ от возможных химических превращений в агрессивной среде желудка [2].

 

Рис. 2. Схема метаболизма витамина В12 [32].

 

Комплекс В₁₂–транскобаламин I разрушается панкреатическими ферментами в двенадцатиперстной кишке. Путем пассивной диффузии энтероциты поглощают не более 2% В₁₂, поэтому ключевым аспектом, усиливающим дальнейший транспорт витамина, является образование его комплекса с гликопротеином внутренним фактором (фактором Кастла), который кодируется геном CUBN. Внутренний фактор обеспечивает поглощение В₁₂ путем рецептор-опосредованного эндоцитоза на апикально экспрессируемом рецепторе (кубулин). При дефиците или в отсутствие фактора Кастла в значительной степени снижается эффективность всасывания витамина В₁₂.

Спустя 2.5–4 ч после первоначального приема В₁₂ попадает в кровь в комплексе с белком транскобаламином II. После рецептор-опосредованного (TCblR) проникновения в целевые клетки свободный В₁₂ высвобождается в результате деградации комплекса в лизосомах. Внутри клеток вне зависимости от формы В₁₂ с помощью ряда ферментов и шаперонов витамин переводится в метилкобаламин (преобладающая форма В₁₂ в плазме крови) или в 5'-дезоксиаденозилкобаламин (преобладающая форма в тканях) [2, 14]. Таким образом, В₁₂ связывается с большим количеством белков, что необходимо учитывать при его использовании в качестве компонента системы доставки. Этот аспект подробнее будет рассмотрен далее.

В₁₂ участвует в большом количестве жизненно важных химических реакций. Так, аденозилкобаламин необходим для получения сукцинил-КоА, интермедиата цикла Кребса, а метилкобаламин – для превращения гомоцистеина в метионин. Преимущественно В₁₂ выступает в качестве кофактора или кофермента. Кобаламин-зависимые ферменты можно разделить на четыре основных класса, которые включают процессы метилирования, изомеризации, восстановительного дегалогенирования. Таким образом, дефицит В₁₂ может повлиять на широкий спектр биохимических реакций, затрагивающих метаболизм ДНК, гормонов, жиров и белков. Кроме того, происходит накопление продуктов метаболизма в плазме и моче, например, метилмалоновой кислоты, которая при высоких концентрациях токсична [8, 12].

3. МЕТОДЫ ПОВЫШЕНИЯ БИОДОСТУПНОСТИ В₁₂

Основной недостаток существующих методов восполнения дефицита В₁₂ при пероральном применении – низкая биодоступность препарата. Принимая во внимание разветвленную схему метаболизма В₁₂ (рис. 2), можно выделить две основные функциональные структуры, которые в наибольшей степени влияют на проникновение препарата в клетки: транспортные белки и поверхность эндоцитов.

Ramalho et al. [15] задавались вопросом о роли биомембран в биодоступности В₁₂ и исследовали взаимодействие В₁₂ с модельными биомембранами с целью выявления роли липидного состава везикул на распределение и проникновение В₁₂. Везикулы были получены на основе мажорных фосфолипидов биомембран эукариот (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, сфингомиелин и холестерин). Авторы исследовали коэффициент распределения В₁₂, а также локализацию витамина в бислое, его влияние на текучесть липидной мембраны. В₁₂ продемонстрировал высокое сродство к мембранам, при этом наиболее вероятно В₁₂ локализован вблизи гидрофильных фрагментов липидов, но также способен проникать в толщу бислоя. Взаимодействие В₁₂ с везикулами не обусловливает изменение текучести мембран. Авторы пришли к выводу, что количество типов липидов в бислое – это основной фактор, регулирующий взаимодействие В₁₂ с бислоем. Увеличение сложности архитектуры, упорядоченности и жесткости бислоя способствуют снижению возможной диффузии молекул. Тем не менее на основании результатов исследования можно предположить, что низкая биодоступность витамина не обусловлена только невысоким взаимодействием В₁₂ с биологическими мембранами.

Ранее обсуждалось, что недостаток белков, а именно транскобаламинов и внутреннего фактора, может способствовать возникновению дефицита В₁₂. Таким образом, использование комплекса белок–В₁₂ может способствовать увеличению биодоступности вещества. В 2018 г. для увеличения биодоступности В₁₂ в литературе были описаны еще три основных подхода (табл. 1). Важно отметить, что до сих пор не определена наиболее успешная стратегия разработки высокоэффективных терапевтических форм В₁₂.

 

Таблица 1. Основные методы увеличения биодоступности В₁₂ [48]

№	Метод	Примеры дополнительных компонентов	Степень изученности в литературе	Недостатки метода
1	Использование комплекса В12 с веществами, обусловливающими усиление пероральной адсорбции	Салькапрозат натрия, внутренний фактор, транскобаламин, D-сорбитол и др.	Средняя	Неизвестны задействованные механизмы, неочевиден потенциальный эффект улучшения абсорбции
2	Альтернативные методы введения В12	Пероральные, трансдермальные, сублингвальные формы, внутримышечные инъекции и др.	Средняя	Отсутствуют клинические исследования по сравнению различных форм введения
3	Альтернативные биотехнологические подходы	Рекомбинантный внутренний фактор, генно-модифицированные микроорганизмы – продуценты В12 и др.	Низкая	Нерациональность использования и высокая стоимость
4	Cистемы доставки	Инкапсуляция В12 в носители различной природы (неорганические и органические)	Средняя	Отсутствуют клинические обоснования для использования у человека

 

Наиболее простым решением могут показаться альтернативные способы введения В₁₂. В метаанализе 2024 г. обсуждается вопрос о наиболее эффективном способе приема В₁₂ [16]. Авторы выбрали 13 публикаций, из них 8 – рандомизированные клинические испытания, которые удовлетворяли ряду критериев: исследования проводились на пациентах с дефицитом В₁₂, экспериментальная и контрольные группы получали В₁₂ разными способами, оценивали концентрацию В₁₂ или В₁₂-ассоциированного показателя (фолиевая кислота, гемоглобин, гематокрит, средний объем эритроцитов, гомоцистеин плазмы, метилмалоновая кислота в моче, лейкоциты и тромбоциты). Показано, что повышение уровня В₁₂ в крови наиболее выражено для внутримышечных инъекций, далее идут подъязычные формы и на последнем месте – пероральное применение. Однако, как отмечают авторы, другие исследуемые показатели (общий анализ крови и концентрация гомоцистеина), а также клинические проявления были сопоставимы для всех трех способов введения В₁₂. Таким образом, все перечисленные способы введения В₁₂ в организм обусловливают сравнимый терапевтический результат, но с точки зрения переносимости пациентами, преимуществ и недостатков каждого способа сублингвальный способ предпочтительнее внутримышечного и перорального. Тем не менее требуются более масштабные исследования для подтверждения данного результата.

На сегодняшний день развиваются альтернативные биотехнологические подходы для преодоления дефицита В₁₂ (табл. 1, № 3). Например, в работе [17] предлагается использовать микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii в качестве дополнительного источника В₁₂, что особенно актуально для вегетарианцев. Авторы проводят обогащение клеток витамином В₁₂ посредством вставки кодируемого участка человеческого внутреннего фактора в ген PSAD и последующей экспрессии белка в цитоплазме и внеклеточном пространстве. Показано, что в случае цитоплазматического фактора Касла концентрация B₁₂ в клеточных лизатах выше, чем в контрольном штамме. Тем не менее биотехнологические подходы недостаточно изучены и не позволяют определить рациональность использования дополнительных компонентов, которые могут иметь высокую стоимость (в первую очередь, технологии их получения). Кроме того, недостаток исследований не позволяет предсказать, какие механизмы задействованы в регуляции биодоступности В₁₂ и на сколько данный показатель возможно увеличить.

Современные достижения инструментальных методов исследования и разнообразные подходы к дизайну наноматериалов открывают новые возможности для разработки высокоэффективных лекарственных форм. Таким образом, наиболее популярный подход к разработке новых форм В₁₂ – использование различных систем доставки, чаще всего для перорального введения [8].

4. СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ВИТАМИНА В₁₂

4.1. Регуляция физико-химических свойств В₁₂ при инкапсуляции в систему доставки

Описанные в литературе исследования систем доставки В₁₂ в основном нацелены на предотвращение неспецифического распределения витамина, а также разработки систем с контролируемым высвобождением. Данные задачи особенно важны для целенаправленной доставки В₁₂ в костный мозг и нервные клетки для восстановления миелина. Инкапсуляция В₁₂ в разнообразные носители способствует повышению биодоступности витамина, снижению частоты введения препарата, а также снижению стоимости продукции. Таким образом, подобные системы обладают значительными преимуществами для пациентов [8].

Некоторые примеры систем доставки В₁₂ представлены в табл. 2. В качестве носителей в большинстве случаев используются матрицы из органических веществ различной природы: полисахариды, синтетические полиэлектролиты, липиды и полипептиды. Чаще всего предлагаемые носители используют не в чистом виде, их подвергают модификации разнообразными агентами для регуляции свойств полученного высокомолекулярного вещества. Так, во многих работа показано, что сшивка цепей полимера обусловливает более выраженное замедленное высвобождение инкупсулированного В₁₂.

 

Таблица 2. Системы доставки витамина В₁₂

Тип системы	Химическая структура носителя В12	Тип включения В12 в систему доставки	Степень включения В12 в систему доставки*	Наиболее важные результаты	Ссылка
Полимерный носитель	Полиакриловая кислота, модифицированная цистеином	Добавление раствора с последующей лиофильной сушкой	–	Трехкратное увеличение площади под кривой (AUC) у крыс при пероральном введении	[49]
	Полимерные капсулы, полученные путем покрытия частиц карбоната кальция поли(гидрохлоридаллиламином) и поли(4-стиролсульфонатом)	Адсорбция из раствора	~100%	Формирование ассоциатов В12 в полимерной капсуле	[50]
	Кубосомы на основе фитантриола и плюроника F127	Добавление раствора к высушенной липидной пленке	30%	В12 стабилизирует липидную систему, выступая в роли структурообразующего элемента
	Гидрогель на основе желатина и дубильной кислоты	Адсорбция из раствора	–	Замедленное высвобождение В12 из носителя (за 24 ч 50% при рН 1.2 и 70% при рН 7.4)	[51]
	Микрочастицы из полиакрилата, модифицированного L-цистеином	Добавление раствора к полимеру перед распылительной сушкой	~1% по массе относительно микрочастиц	Замедленное высвобождение В12 (100% за 3 ч, рН 7.2). Увеличение проницаемости через монослой Caco-2 и слизистой оболочки кишечника крысы в ~3.8 и ~4.8 раза соответственно	[52]
	рН-чувствительные материалы на основе модифицированных нанослоев монтмориллонита	Адсорбция из раствора	20–160 мг на 1 г носителя	Отсутствие наблюдаемого высвобождения В12 при рН 1.2 и замедление кинетики высвобождения витамина при рН 7.4 (< 50%) за 400 мин	[53]
Полипептиды	Микрочастицы, нановолокна и пленки на основе зеина, проламина кукурузы	Добавление раствора к белку перед распылительной сушкой или электроспиннинга	>60%	Замедленное высвобождение В12 в этанол (100% наблюдается через 140–3000 мин в зависимости от формы носителя и способа его получения)	[54]
	Наночастицы из изолятов соевого белка	Добавление к раствору белка и внесение хлорида кальция	~10–13%	Увеличение проникновения В12 через монослой Caco-2 в 2–3 раза. Увеличение проникновения в 3–4-й участки тощей кишки крыс по сравнению с раствором свободного В12	[55]
Липидные системы доставки	Твердые липидные наночастицы	Добавление к липидной матрице в жидкокристаллической фазе	~92%	Замедленное высвобождение при рН 7.4 и 6.8 (только в первые 15 мин). Наночастицы локализуются в цитоплазме и мембране ядра клеточной линии H-Ras 5RP7 фибробластов, в то время как свободный B12 обнаружен преимущественно вне клеток. Усиление цитотоксических свойств препарата (наиболее выраженное усиление составляет 53%)	[56]
	Липосомы и липосомы, функционализированные трансферрином	Добавление к липидной пленке	14–27%	Выраженное замедленное высвобождение В12: за 9 дней 20% в случае В12, инкапсулированного в липосомы, модифицированные трансферрином, а в случае свободного В12 – 100% (рН 7.4)	[57]
Комплексные системы	Наночастицы на основе белков семян ячменя, α-токоферола и соевого фосфатидилхолина, модифицированные янтарным ангидридом	Добавление к исходной смеси компонентов	~70%	Замедленное высвобождение В12 в присутствии пепсина и без пепсина при рН 2.0 и с панкреатином или без панкреатина при рН 7.4. Улучшение проникновения в монослои Caco-2 в 20 раз, а также высокая степень поглощения клетками в присутствии ингибиторов различных путей эндоцитоза	[58]

* Если не указано иное, степень включения рассчитывали как отношение количества инкапсулированного В₁₂ относительно количества В₁₂, добавленного в систему.

 

Тем не менее не все системы доставки способны обеспечить замедленное высвобождение витамина В₁₂. Так, в работе [18] методом распылительной сушки были получены сферические микрочастицы (3 мкм в диаметре) на основе одного из трех биополимеров: хитозана, карбоксилированного хитозана и альгината. В данные системы был инкапсулирован В₁₂ или витамин С. В зависимости от химической природы носителя наблюдалась различная скорость высвобождения в деионизированную воду для обоих препаратов: 100%-ное высвобождение наблюдается в течение 120 мин для хитозана, 15–20 мин – для модифицированного хитозана и альгината. Авторы связывают скорость высвобождения препарата с морфологией микрочастиц – замедление характерно для образцов с более грубой поверхностью.

Предложены гибридные микрогели [19], полученные методом эмульсионной полимеризации, на основе хитозана и непористого силикагеля, модифицированных винильными группами. В зависимости от массового соотношения исходных полимеров были получены образцы микрогелей, способные высвобождать 100% инкапсулированного В₁₂ за 45–60 мин. Столь быстрое высвобождение авторы связывают с высокой гидрофильностью В₁₂, а также с тем фактом, что при рН 1.2 и 7.4 протонированные группы хитозана отталкиваются друг от друга, формируя каналы в геле, что снижает стерические затруднения для витамина В₁₂.

Согласно табл. 2, помимо профиля высвобождения витамина также исследуется и другой важный параметр – степень инкапсуляции В₁₂ в носитель. Как правило, витамин вносится в раствор материала на этапе его получения/синтеза или готовый носитель вымачивается в растворе В₁₂. После очистки системы доставки от несвязавшегося вещества проводят определение степени включения В₁₂ относительно добавленного количества. В целом для В₁₂ характерны степени включения >30%, при этом часто этот параметр достигает значений >80%.

В большинстве работ предложенные нано- и микрочастицы, волокна и гидрогели охарактеризованы с точки зрения морфологии поверхности материала, а также их физико-химических свойств. Результаты испытаний in vitro и in vivo, как правило, получены с использованием клеточного монослоя эукариотических клеток и исследований фармакокинетических параметров на животных моделях (грызунах) соответственно.

Для исследования влияния носителя на проникающую способность В₁₂ в клетки использовали монослой аденокарциномы Caco-2, моделирующий энтероциты, выстилающие тонкую кишку. Проницаемость препаратов изучают в двух направлениях (от апикальной стороны к базолатеральной и наоборот) на монослое 20-дневной клеточной культуры на микропористом фильтре. По изменению концентрации вещества во внешнем растворе с учетом площади клеточной поверхности рассчитывали коэффициент проницаемости P_app (apparent permeability coefficient, см/с), а также индекс асимметрии транспорта. Возможно проведение корреляции между данными in vitro и ожидаемыми результатами in vivo: при значениях Р_app ~ 10^–6 см/с препарат полностью (на 100%) адсорбируется в желудочно-кишечном тракте, а при Р_aaр ~10^–7 см/с адсорбция препарата составляет менее 1%. Оптимальным диапазоном значений P_app считается 10^–6–10^–5 см/с [20].

Инкапсуляция В₁₂ в системы доставки позволяет увеличить параметр P_app в несколько раз (табл. 2). Во многих работах проводили анализ поглощения В₁₂ клетками Caco-2 (в процентах относительно добавленного), а также определяли процент захваченных частиц. Отмечается, что инкапсуляция витамина в систему доставки приводила к значительному увеличению поглощения В₁₂ (от 2 до 20 раз).

Кроме того, особый интерес вызывает способность В₁₂ обусловливать нейропротекторные свойства in vitro как в свободном виде, так и в системе доставки. Так, в работе [15] была изучена многокомпонентная система для сублингвального и трансдермального применения. Авторы инкапсулировали В₁₂ в наночастицы, полученные из нескольких типов полимеров, и опционально впоследствии частицы помещали в матрицу нановолокна. Нейропротекторный потенциал синтезированных наноматериалов in vitro был изучен на клетках SH-SY5Y. Изначально к клеткам добавляли β-амилоидный пептид (Aβ_1–42), который способствовал подавлению жизнеспособности клеток до 28.6%. Предложенные наноматериалы, содержащие В₁₂, проявляли высокий нейропротекторный эффект, вероятно, из-за высокой дозы препарата и контролируемого высвобождения, что перспективно для разработки лекарственных форм с целью предотвращения нейродегенеративных заболеваний.

Таким образом, в качестве носителей для В₁₂ используются вещества различной природы, которые позволяют в значительной степени влиять на физико-химические и биологические свойства В₁₂. Среди предложенных систем доставки наиболее часто исследуются высокомолекулярные соединения в форме нано- или микрочастиц. На сегодняшний день большинство авторов предлагает системы для перорального введения. Интересно, что в работе [21] рассмотрены микрочастицы на основе бычьего сывороточного альбумина для ингаляционного введения В₁₂. Белок дополнительно покрывали мукоадгезивным полисахаридом пуллуланом. Система характеризовалась высокой ступенью загрузки микрочастиц витамином В₁₂ (88%), продемонстрировала выраженное увеличение максимальной концентрации В₁₂ в крови при интратрахеальном введении крысам, а также увеличение биодоступности в 4.5 раза. Тем не менее на сегодняшний день в литературе ингаляционный способ введения В₁₂ описан в недостаточной степени. Помимо вышеперечисленных систем доставки В₁₂ среди исследователей очень популярны системы трансдермальной доставки как наиболее простой и удобный способ введения В₁₂.

4.2. Трансдермальные системы доставки В₁₂

В работе [22] были получены гибридные нановолокна на основе полисахарида хитозана и азолектина методом электроспиннинга. Авторы определили размеры, структуру, морфологию волокон, а также продемонстрировали отсутствие цитотоксичности на культуре клеток фибробластов мыши L929. Загрузку волокон витамином В₁₂ осуществляли путем замешивания исходной смеси хитозана и азолектина с раствором препарата перед проведением электроспиннинга. Показано замедленное высвобождение В₁₂ (100% свободного витамина во внешнем растворе наблюдается по истечении 48 ч). К сожалению, на основе представленных результатов невозможно оценить перспективы использования нановолокон, поскольку не было проведено исследований в системе, моделирующей кожный барьер.

Напротив, Yekrang et al. [23] для своих систем определили не только физико-химические параметры, но и характеристики in vitro с точки зрения механической прочности материала и его биодеградации, а также фармакокинетические параметры В₁₂ in vivo. В работе предложены пластыри на основе нановолокон из поливинилового спирта и хитозана, полученных методом электроспиннинга. В экспериментах in vivo крыс разделили на контрольную группу и группу, в которой животным помещали пластырь на область кожи между лопаток. Для второй группы показано увеличение уровня В₁₂ в крови на 22% (спустя 8 ч после нанесения пластыря), что указывает на успешное проникновение и перенос В₁₂ через кожный барьер, а также поступление препарата в кровоток. Согласно гистологическим исследованиям, нановолокна не способствуют повреждению кожного покрова, а также не обусловливают возникновение воспалительных процессов. Состояние эпидермиса и дермы в обеих группах было одинаковым. Важно отметить, что для регуляции свойств материала предложена модификация нановолокон посредством сшивки цепей хитозана глутаровым альдегидом. При исследовании влияния сшивки на физико-химические параметры пластыря показано более значительное замедление высвобождения В₁₂ (в фосфатный буфер, 37°С), снижение скорости биодеградации (на ~20%) и улучшение механических свойств.

Более глубокое исследование системы трансдермальной доставки В₁₂ провели Ramöller et al. [24], которые предложили в качестве носителя В₁₂ быстрорастворимые микроиглы из поливинилпирролидона. В первую очередь, была исследована возможность проникновения микроигл в модель искусственной кожи (восемь слоев Parafilm M). Определено, что микроиглы заглубляются в толщу слоя до 381 мкм, что составляет ~64% от их общей длины (600 мкм). При нанесении пластыря с микроиглами на кожу новорожденных свиней >100% образца растворяется в течение 2 мин. C помощью вертикальной диффузионной ячейки Франца показано высвобождение В₁₂ в фосфатно-солевой буфер (рН 7.4) при 37°С: 20% через 15 мин и 70% через 5 ч. Таким образом, результаты исследований in vitro указывают на успешное проникновение системы доставки сквозь кожный барьер и эффективное высвобождение препарата.

При исследовании фармакокинетических параметров in vivo мышам вводили подкожно контроль (раствор В₁₂) или помещали образец материала (4 микроиглы) на кожу спины и фикировали пластырем. После удаления пластыря с микроиглами показано полное растворение образца и отсутствие покраснения кожи. При исследовании концентрации В₁₂ в крови в случае контроля (подкожное введение) максимальная концентрация составила ~1.30 ± 0.25 мкг/мл, что в 3.5 раза больше концентрации, достигнутой в случае трансдермального проникновения препарата. Важно отметить, что в пластыре содержалось в 2.7 раза больше В₁₂, чем в подкожной инъекции. Как отмечают авторы, такой результат может быть связан с тем, что не вся микроигла проникает в кожу (64% по результатам in vitro), что значительно снижает биодоступность препарата. Однако при дальнейшем определении содержания В₁₂ в крови обнаружено, что у мышей контрольной группы после 24 ч витамин не был обнаружен, в то время как в случае микроигл у отдельных животных был у отдельных животных зафиксировано присутствие препарата даже через 30 ч после введения.

Таким образом, в литературе предлагаются разнообразные материалы для трансдермальной доставки, в первую очередь, на основе полимерных волокон и микроигл. Однако применение трансдермальных форм В₁₂ все еще ограничено в связи с трудностями по преодолению кожного барьера.

Помимо непосредственно форм В₁₂ для трансдермальной доставки существует несколько работ по изучению влияния В₁₂ на эффективность заживления кожных ран. Например, в работе [25] получены нановолокна на основе поликапролактона и желатина (последний использовался для увеличения гидрофильности поверхности волокон). Добавление В₁₂ значительно усиливало пролиферацию клеток L929 спустя 1 и 3 суток культивирования. Авторы провели исследования in vivo на крысах для сравнения заживляющего потенциала материала. В результате хирургического вмешательства животным проводили удаление кусочка кожи в области спины, после чего закрывали рану пластырем, содержащим В₁₂, “пустым” пластырем или стерильной марлей. При анализе скорости заживления повреждения обнаружено, что за 7 дней в контрольной группе наблюдалось уменьшение размера раны на ~20%, а в случае В₁₂-нановолокон этот показатель составил ~60%. При этом для незагруженных нановолокон достижение 60%-ного заживления раны наблюдалось только за 14 дней, в то время как при использовании В₁₂-пластыря за две недели размер раны уменьшился на 92%. При обсуждении механизма такой выраженной эффективности заживления кожного повреждения авторы ссылаются на другие работы, в которых показано участие В₁₂ в пролиферации резидентных клеток фибробластов и кератиноцитов, а также в усилении синтеза белков, среди которых может быть коллаген.

Подобные исследования указывают на высокий потенциал применения материалов, содержащих В₁₂, для кожных покровов в качестве платформы как для доставки В₁₂, так и для ускорения заживления раневых повреждений. Особый интерес в случае трансдермальной доставки представляют собой носители – наноматериалы, в частности нановолокна, полученные методом электроспиннинга.

4.3. Комбинированные системы доставки B₁₂ с другими витаминами

Существуют и системы доставки с несколькими витаминами, один из которых – витамин B₁₂. Комбинированные лекарственные формы, содержащие ряд биологически активных молекул, перспективны в качестве терапевтических агентов, поскольку позволяют при однократном приеме обеспечивать одновременную доставку нескольких веществ.

В работе [26] предложена система одновременной доставки В₁₂ и витамина В₉ на основе частиц сополимера полигликолиевой и полимолочной кислот. Инкапсулирование препаратов в частицы с диаметром 190 нм показало высокий процент загрузки препаратами относительно количества введенного вещества: ~89% для витамина В₉ и ~70% для В₁₂. Система доставки обеспечивает значительное замедление высвобождения обоих витаминов в эксперименте с биорелевантными средами, моделирующими прохождение системы через пищеварительный тракт. Так, в общей сложности методом равновесного диализа показано, что за 5 ч из носителя высвободилось < 10% В₁₂, что более чем в 4 раза меньше по сравнению с раствором свободного витамина. Для витамина В₉ наблюдалась аналогичная тенденция, однако менее выраженная. Авторы склоняются к тому, что причина выраженной разницы в профилях высвобождения витаминов связана с более высокой гидрофильностью В₁₂. В продолжении эксперимента по высвобождению препарата в работе исследована биодоступность витаминов in vitro. Показано увеличение биодоступности В₁₂ в ~1.8 раза, что обусловлено замедленным высвобождением и защитой носителем от внешних факторов.

Более сложные многокомпонентные системы рассмотрены в работе [27], в которой предложены офтальмологические гели для более эффективного заживления ран роговицы и регенерации нервных волокон. Авторы изучали сшитые и несшитые гиалуронаты с инкапсулированным таурином, витамином В₆ и В₁₂, взятыми в различных массовых соотношениях, а также препарат RenerviX с аналогичным качественным составом. Результаты исследований формуляций на клеточной линии роговицы кролика (SIRC) и испытания in vivo на кроликах показали высокую эффективность систем для восстановления функциональных нервов роговицы, защиты клеток от окислительного стресса и высокую скорость заживления ран. Тем не менее для достижения ключевых показателей наличие витаминов было не обязательным фактором, что ставит под сомнение необходимость этих компонентов в формуляции. Однако в более ранней работе [28] в исследованиях на крысах для гелей аналогичного состава (гуалуронат, содержащий таурин и В₁₂) было показано выраженное ускорение реэпителизации роговицы после механической травмы при наличии 0.05% В₁₂.

В целом предлагаемые системы доставки нескольких витаминов аналогичны системам доставки В₁₂: наблюдается замедленное высвобождение препарата и увеличение биодоступности. Тем не менее в литературе не отмечается взаимное влияние В₁₂ на физико-химические и биологические параметры других витаминов, и наоборот. Таким образом, разработка многофункциональной системы на основе нескольких витаминов может быть весьма перспективной с точки зрения удобства для пациентов.

5. ВИТАМИН В₁₂ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ДЛЯ ДРУГИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

Во многих исследованиях В₁₂ используется в качестве не основного терапевтического агента, а вспомогательного компонента для улучшения ряда свойств другого препарата. Подобные системы, как правило, нацелены на адресную доставку широкого спектра лекарств, в основном низкомолекулярных соединений, а также макромолекул разных терапевтических групп. При этом возможно использование как свободного В₁₂ или его производных, так и ковалентная пришивка В₁₂ непосредственно к исследуемой молекуле или через спейсер. Наиболее известный пример подобных систем – конъюгат В₁₂–инсулин [29, 30], полученный с целью улучшения доставки белка для эффективной регуляции концентрации глюкозы в крови.

5.1. Конъюгаты В₁₂ и их антибактериальная активность

Для осуществления присоединения В₁₂ посредством формирования ковалентных связей необходимо обратить внимание на доступные функциональные группы В₁₂, по которым возможно провести модификацию [31]. Здесь следует подчеркнуть, что формирование комплексов В₁₂ с белками – важный фактор для химической стабильности и транспорта препарата in vivo (рис. 2). Поэтому необходимо учитывать, какие функциональные группы нежелательно задействовать для формирования новых связей. При этом в литературе отсутствуют работы по изучению влияния структурных изменений В₁₂ на формирование комплексов с белками. Отмечено [2, 32], что K_d комплексов белок–В₁₂ составляют ~10^–15 М, при этом комплексы образуются путем “обволакивания” почти всей молекулы В₁₂ белком. Таким образом, В₁₂ прочно удерживается внутри белковой глобулы. Незащищенной остается 5'-гидроксигруппа рибозного фрагмента – основной сайт химической модификации для получения производных В₁₂ или конъюгатов (рис. 1). Также часто подвергают модификации фосфатную группу и периферический ε-пропионамид.

Например, в работе [11] вводили небольшие фрагменты с концевыми карбоксильными группами в цианокобаламин путем образования сложноэфирных связей по 2′- и/или 5′-гидроксильной группе рибозного фрагмента. Синтезированные вещества в 20 раз превосходили исходный витамин по растворимости в фосфатно-солевом буфере и дистиллированной воде. В общей сложности <50% от внесенных в водный раствор конъюгатов поверглись гидролизу за 24 ч.

В литературе также предлагается модифицировать непосредственно макроцикл коррин, что было продемонстрировано в работе [33]. Авторы исследовали влияние структурных особенностей форм В₁₂ на проникновение молекул в бактериальные клетки. Для этой цели на примере кобировой кислоты была внесена флуоресцентная метка (Orgeon green или BoDIPY) через спейсер к С5 корринового кольца. Исследования проводили на нескольких штаммах E. coli, содержащих и не содержащих BtuB-рецептор, ответственный за поглощение В₁₂, а также на M. tuberculosis. Продемонстрировано успешное проникновение модифицированных аналогов кобировой кислоты в M. tuberculosis и E. coli с активным геном btuB, при этом для некоторых штаммов поглощение данных соединений на порядок превосходило поглощение исходного цианокобаламина. Таким образом, при разработке таргетных лекарственных форм с использованием В₁₂ необходимо учитывать не только взаимодействие В₁₂ с транспортными белками, но и особенности молекулярного узнавания витамина на поверхности клеток микроорганизмов.

Для разработки эффективных антибактериальных лекарственных препаратов в работах изучаются конъюгаты В₁₂ с пептидно-нуклеиновыми кислотами (ПНК) [34]. ПНК представляют собой олигомерные молекулы, в которых азотистые основания соединены с остовом (рис. 3) – пептидной незаряженной ахиральной структурой, не содержащей пентоз и остатков фосфорной кислоты. В связи с особенностью своего строения ПНК – это в некотором смысле аналоги нуклеиновых кислот, что обусловливает их способность образовывать устойчивые дуплексы ПНК–ПНК, ПНК–ДНК и ПНК–РНК, а также триплексы (ПНК)₂(ДНК). При этом, в отличие от нуклеиновых кислот, ПНК исключительно чувствительны к наличию некомплементарных пар в структуре ДНК или РНК [35].

 

Рис. 3. Схематичное представление взаимодействие цепи ПНК с ДНК/РНК.

 

Высокая чувствительность и стабильность обусловливает особый интерес к ПНК в вопросах создания новых лекарственных препаратов. Так, в работе [36] в качестве противомикробного компонента авторы синтезировали ПНК, комплементарную 10 остаткам нуклеотидов в мРНК гена acpP, кодирующего белок-переносчик, который участвует в биосинтезе жирных кислот. В₁₂ был присоединен к N-концу ПНК по 5'-ОН группе рибозного фрагмента двумя способами: либо с образованием карбамидной связи через линкер –(СН₂)₆– и триазол, либо с формированием связи –S–S–.

При исследовании антибактериальной активности образцов на E. coli K-12 MG1655 в бульоне Мюллера–Хинтон (МНВ) не наблюдалось ингибирование роста микроорганизмов. Авторы связывают этот результат с тем, что среда МНВ не селективная, содержит много разнообразных питательных веществ, в том числе и продукты животного происхождения, что может исключать необходимость дополнительного потребления клетками В₁₂-содержащего конъюгата. Выбор другой питательной среды (Cкарлет и Тернер) обусловлен наличием этаноламина в качестве источника азота. Химические превращения этого субстрата сопряжены с ферментом, для которого В₁₂ является кофактором. Для данных условий авторы продемонстрировали выраженную антибактериальную активность синтезированных конъюгатов, причем минимальная ингибирующая концентрация образцов (5 мкМ) была сравнима с конъюгатами, в которых вместо В₁₂ к ПНК был пришит пептид (KFF)₃K, который хорошо проникает в клетки. Поскольку использование таких катионных синтетических пептидов, как (KFF)₃K, не всегда целесообразно, В₁₂ показал себя перспективным компонентом ПНК для разработки высокоэффективных лекарственных форм.

К аналогичному выводу пришла группа ученых под руководством профессора J. Trylska [37–39]. Авторы исследовали методом компьютерного моделирования механизм проникновения конъюгатов В₁₂–ПНК внутрь бактериальной клетки, а также продемонстрировали антибактериальную активность таких систем на E. coli и S. typhimurium. Важно отметить, что ПНК был пришит к различным функциональным группам витамина В₁₂: кобальту, –ОН 5'-рибозного фрагмента, амидным группам c и е в мезо-положении и –ОН-группе кобинамида. Наиболее выраженная активность продемонстрирована для модификации рибозного фрагмента.

Помимо ПНК возможно использовать и олигонуклеотидные последовательности, которые могут блокировать репликацию белков посредством специфичного взаимодействия с мРНК. Так, показана возможность блокирования гена mrfp1 в плазмиде в клетках E. coli и S. typhimurium [40]. Снижение экспрессии красного флуоресцентного белка в бактериях на 50% указывало на успешное проникновение и ингибирование синтеза белка. Подобные конъюгаты можно использовать в качестве подхода для селективного ингибирования синтеза бактериальных белков.

Таким образом, системы ПНК–В₁₂ и олигонуклеотиды–В₁₂ – это перспективные антибактериальные агенты, которые можно использовать целенаправленно для ингибирования экспрессии необходимых бактериальных белков. Кроме того, данные конъюгаты имеют большое значение для преодоления резистентности микроорганизмов к существующим антибактериальным низкомолекулярным соединениям.

5.2. Светочувствительные конъюгаты В₁₂

Для биомедицинского применения В₁₂ T.A. Shell и D.S. Lawrence [41] предложили обратить внимание на особенности светочувствительности витамина. Авторы собрали свои основные результаты, а также достижения коллег по разнообразным конъюгатам В₁₂, способным разрушаться под действием электромагнитного излучения.

В случае синтезированных алкилкобаламинов связь углерод–кобальт непрочная (<30 ккал/моль), поэтому возможно провести направленный фотогемолиз под действием света в видимой области, который способно поглощать корриновое кольцо (330–560 нм), т.е. В₁₂ можно использовать для разработки фототерапевтических средств с заданными характеристиками активации. Например, авторы рассматривают возможности направленного действия конъюгатов В₁₂– доксорубицин и В₁₂–цАМФ. Оба типа конъюгатов не оказывали никакого воздействия на жизнеспособность и/или морфологию клеточных линий REF52 и HeLa соответственно. При облучении длиной волны 530 нм, при которой происходит фотогомолиз, высвобождаются свободные биологически активные агенты, и, ожидаемо, доксорубицин способствует снижению жизнеспособности клеток, а цАМФ – сокращению и округлению клеток. Интересно отметить, что в случае конъюгата В₁₂–BODYPY расщепление наблюдается при длине волны 650 нм, значение которой выходит за возможности поглощения корринового кольца. Таким образом, флуорофоры могут выступать в качестве “антенн” для длин волн активации до 800 нм.

В качестве сложной комплексной лекарственной формы, включающей в себя все рассмотренные результаты, авторы обсуждают двухкомпонентную систему, в которой представлены конъюгат липид–В₁₂–лекарство и липид–флуорофор. В экспериментах in vitro одновременно исследуются клетки HeLa и эндоциты, содержащие липидные конструкции. На примере противовоспалительного средства дексаметазона показано, что фототерапевтические конструкции изначально находились только на поверхности клеток-носителей; активация заданной длиной волны способствует высвобождению лекарственного препарата, который впоследствии проникает во второй тип клеток.

Важно отметить, что локализация подобных конструкций не ограничивается только поверхностью клеток-носителей, возможно введение в эндосомы, что может быть использовано для высвобождения вещества непосредственно в цитоплазму клеток-носителей. Подобные лекарственные формы были успешно протестированы in vitro на стволовых клетках, способных переходить в глиобластому, а также in vivo. Таким образом, вышеописанные примеры фотоактивных конструкций – перспективные сложные системы доставки лекарств с высокой временной точностью.

5.3. Конъюгаты В₁₂ с противоопухолевыми препаратами

В литературе витамин В₁₂ рассматривается как перспективный компонент многих комплексных лекарственных форм противоопухолевых препаратов. Многие авторы обращают внимание на активный метаболизм раковых клеток. Для клеточного поглощения В₁₂ требуется формирование комплекса витамина с транскобаламином II (рис. 2) с помощью белка рецептора плазматической мембраны (TCblR), кодируемого геном CD320. Поступление В₁₂ в клетки млекопитающих обусловлено высокой аффинностью и селективностью рецептора к комплексу транскобаламин–В₁₂. Важно отметить, что рецептор TCblR поглощается клеткой вместе с комплексом транскобаламин–В₁₂ и деградирует в лизосомах, что способствует высвобождению витамина в цитоплазму. Появление новых рецепторов на поверхности клеток зависит от уровня экспрессии CD320. Данный процесс взаимосвязан с клеточным циклом, т.е. высокое содержание белка наблюдается в активно пролиферирующих клетках, в то время как более низкий уровень экспрессии наблюдается в дифференцированных клетках в G₀-фазе. Таким образом, многие линии раковых клеток демонстрируют более высокую экспрессию TCblR, что может использоваться для адресной доставки и увеличения эффективности действия лекарств [42].

Для усиления эффекта от данного подхода можно обратить внимание на еще одну особенность раковых клеток: в опухоли концентрация глутатиона в 4 раза выше, чем в нормальной ткани, т.е. возможно более активное расщепление –S-S-связей посредством реакций тиол-дисульфидного обмена именно в патологической ткани. Так, в работе [43] авторы разработали трехступенчатый синтез конъюгатов В₁₂ с дисульфидной связью в 5′-положении рибозного фрагмента. Получены соединения, содержащие остатки цистеина, глутатиона, олигопептида и др. Дисульфидные конъюгаты перспективны тем, что глутатион/дисульфид глутатиона – хорошо изученная окислительно-восстановительная пара в животных клетках, которая обеспечивает антиоксидантную активность. Похожие системы доставки на основе полимеров подробно изложены в работе [44].

5.4. Использование В₁₂ в системе доставки других лекарственных компонентов

Для доставки низкомолекулярных лекарственных веществ (реже макромолекул) в литературе используют разнообразные носители (табл. 3). В случае подобных многокомпонентных систем с В₁₂ возможно включение витамина в систему посредством нековалентного связывания или путем “декорирования” носителя витамином (ковалентная пришивка), в который впоследствии будет инкапсулирован препарат. Модификацию В₁₂, как правило, проводят по –ОН-группе рибозного фрагмента с использованием спейсера небольшого размера или без спейсера. Согласно табл. 3, авторы используют разнообразные типы носителей с точки зрения химической структуры (однокомпонентные/многокомпонентные, неорганической/органической природы) и формы (нано- и микрочастицы, нановолокна). Особенно часто В₁₂ применяют для доставки противоопухолевых препаратов, по-видимому, вследствие высокой активности CD320.

 

Таблица 3. Системы доставки активного агента с использованием витамина В₁₂

Система доставки			Активное вещество		Наиболее важные результаты влияния введения витамина В12 в систему доставки	Ссылка
Тип системы	Тип модификации системы В12*	Химическая структура	Название	Краткая характеристика
Системы доставки низкомолекулярных веществ
Мицеллы	К	Модификация серицин-поли(γ-бензил-L-глутамата) c использованием N,N-карбонилдиимидазола	Паклитаксел	Противоопухолевое средство	Усиление проникновения паклитаксела в клетки BGC-823/PR через CD320-опосредованный путь эндоцитоза, что способствует более выраженному снижению деления клеток и их пролиферации. Данные эффекты значительно ниже в присутствии свободного В12. Значительное снижение размера опухолей в экспериментах in vivo	[59]
Силикагель	Н	Пористые наночастицы диоксида кремния с карбоксильными группами	Цисплатин	Противоопухолевое средство, неорганический комплекс	Снижение высвобождения цисплатина из наночастиц на 26% по сравнению с частицами, не содержавшими витамин В12	[60]
Частицы производных хитозана	К	Модификация гликоль-хитозана по аминогруппам дезоксихолевой кислотой и В12	Скутелларин	Противоопухолевое средство	Увеличение проникновения в клетки Caco-2 в 2.5 раза за 2 ч инкубации с Caco-2. Повышение биодоступности скутелларина в ~2–3 раза, выраженное снижение индекса резистентности и уровня экспрессии белков ангиогенеза (VEGF, VEGFR2 и vWF) сетчатки в in vivo экспериментах на крысах с диабетом II типа	[61]
Микрочастицы диатомовой земли	К	Модификация поверхности носителя с помощью янтарного ангидрида	Цисплатин, 5-фторурацил, комплекс трис-тетраэтил[2,2'-бипиридин]-4,4'-диамин–рутений(II)	Противоопухолевые средства	Значительное усиление адсорбции микрочастиц на поверхность клеток HT-29 и MCF-7 (увеличение количества адсорбированных частиц до 3 раз)	[62]
Частицы на основе гиалуроновой кислоты	К	Модификация поверхности гиалуроновой кислоты, в качестве линкера использовали колестин	Колестин	Пептид	Снижение нефротоксичности на 20–30% (HEK 293) при сохранении противомикробной активности. Увеличение Papp до 3.5 × 10–6 см/с	[63]
Модифицированные липидные частицы	К	Твердые липидные частицы, покрытые конъюгатом В12 со стеариновой кислотой	Амфотерицин B	Противогрибковый препарат	Снижение значения IC50 в 2 раза (Leishmania donovani)	[64]
Системы доставки макромолекул
Частицы производных хитозана	К	Модификация триметилхитозана по аминогруппе с использованием янтарного ангидрида	Инсулин	Гормон Белок	Усиление поглощения модифицированных частиц комплексом клеток Caco-2 и HT29-MTX при наличии и отсутствии слизи на клеточной поверхности	[65]
Мицеллы	К	Модификация декстран-g-полиэтиленоксидного цетилового эфира через 2,2'-(этилендиокси)бис(этиламиновый) спейсер	Циклоспорин А	Иммунодепрессант Полипептид	Увеличение апикального и базолатерального проникновения циклоспорина через монослои Caco-2 клеток в ~2 раза по сравнению с немодифицированными мицеллами	[66]

* К – ковалентная пришивка В₁₂ к носителю; Н – удержание молекул В₁₂ в носителе посредством нековалентных взаимодействий.

 

Некоторые работы исследуют комплексные системы с В₁₂, но не выявляют роль витамина в свойствах предлагаемого материала. Например, разработан пластырь из нановолокон из поликапролактона с инкапсулированным В₁₂ и ингибитором ацетилхолинэстеразы донепезилом для терапии болезни Альцгеймера [45]. Материал продемонстрировал двойной профиль высвобождения донепезила, повышение жизнеспособности клеток SH-SY5Y в присутствии Aβ_1–42 и снижение экспрессии генов, кодирующих предшественников β-амилоида.

Для низкомолекулярных лекарственных молекул вследствие инкапсуляции в носитель ожидаемо наблюдается замедленное высвобождение препарата. В₁₂ в качестве дополнительного агента в большинстве случаев ковалентно пришивают к системе доставки, т.е. проводят “декорирование” поверхности носителя. Главное преимущество подобных систем – выраженное увеличение эффективности транспортировки основной действующей молекулы через клеточный монослой. Такой результат достигается посредством взаимодействия В₁₂ на поверхности носителя с энтероцитами, что, по-видимому, повышает количество адсорбированных молекул лекарственных форм и последующее их поглощение.

Описанный эффект наблюдается и для биологически активных высокомолекулярных соединений. Особый интерес среди макромолекул представляют собой белки, поскольку в случае пероральной комплексной системы доставки возможно сразу решить две задачи: увеличение стабильности полипептида (ферментативная деградация, низкое значение рН), а также улучшение проникновения в энтероциты, что показано на клеточной линии Caco-2 (табл. 3). Например, в работе [46] были получены альгинатные наночастицы, модифицированные кобаламином. В данные системы инкапсулировали инсулин, который использовали в качестве модельного пептидного лекарственного препарата. Сферические частицы продемонстрировали более высокую способность к проникновению через монослой Caco-2 (увеличение значения P_app в среднем на 10–25%). Эксперименты in vivo показали, что при пероральном введении наночастиц мышам с сахарным диабетом I типа наблюдается более длительное удержание в кишечнике. Кроме того, продемонстрировано более выраженное снижение уровня глюкозы в крови в течение 12 ч (на 54% по сравнению с 25% в случае немодифицированных частиц при одинаковой дозе инсулина). Таким образом, использование В₁₂ в подобных системах имеет большой потенциал для эффективной пероральной доставки пептидных лекарственных средств.

Важно отметить, что также существуют работы по доставке олигонуклеотидов. Для ингибирования быстрого роста и метастазирования рака желудка в работе [47] предлагается декорировать витамином наночастицы двух типов: полиэтиленгликоля и сополимера гликолиевой и молочных кислот. В качестве противоопухолевого препарата авторы используют микроРНК, которая способствует апоптозу клеток рака человека. Для предложенных систем характерно избирательное связывание с CD320 и увеличение количества доставленной микроРНК в клетки BGC-823, что способствует митохондриально-опосредованному апоптозу. Испытания in vivo на мышах показали снижение размеров опухолей на 60–90%.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Витамин В₁₂ – жизненно необходимое соединение для человека. Наследственные заболевания, хирургические вмешательства, нарушение питания, а также низкая проникающая способность в клетки В₁₂ могут приводить к возникновению дефицита витамина. Для более эффективной терапии в литературе предлагается использовать несколько подходов, среди которых – инкапсуляция В₁₂ в системы доставки как наиболее изученный и быстроразвивающийся подход. Системы доставки кобаламинов в существенной форме способствуют замедленному или стимул-чувствительному высвобождению препарата, увеличению проникновения В₁₂ в энтероциты, а также увеличению биодоступности препарата. Степень загрузки В₁₂ может варьироваться в зависимости от природы носителя и в ряде случаев достигает значений >90%.

Поскольку на сегодняшний день отсутствуют крупномасштабные исследования по наиболее эффективному методу введения В₁₂ in vivo с точки зрения терапевтического эффекта, то все предлагаемые системы доставки имеют потенциал для дальнейшего применения. Наиболее популярны в литературе носители на основе модифицированных высокомолекулярных соединений (из одного или нескольких типов полимеров), формирующие наночастицы или волокна для пероральной или трансдермальной доставки соответственно.

Рассмотренные в обзоре системы доставки имеют потенциал последующей коммерциализации и внедрения в клиническую практику для коррекции дефицита витамина В₁₂. С другой стороны, фундаментальный интерес представляет собой использование витамина В₁₂ как вспомогательного компонента для доставки других лекарственных молекул: пептидно-нуклеиновых кислот, пептидов, белков и противоопухолевых препаратов. Здесь потенциал использования витамина В₁₂ существенно шире: рассматривается возможность включения его в лекарственные формуляции для борьбы с социально-значимыми заболеваниями, такими как резистентные инфекции, онкологические и нейродегенеративные заболевания. Это направление требует дополнительных исследований на стыке биоорганической и медицинской химии и потенциально открывает новые перспективы для создания лекарственных препаратов с улучшенными биофармацевтическими свойствами.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных кем-либо из авторов данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Все авторы внесли равный вклад в написание этой статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

Авторлар туралы

A. Skuredina

Lomonosov Moscow State University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: anna.skuredina@yandex.ru

Department of Chemistry

Ресей, Leninskie Gory 1/3, Moscow, 119991

D. Ialama

Lomonosov Moscow State University

Email: anna.skuredina@yandex.ru

Department of Chemistry

Ресей, Leninskie Gory 1/3, Moscow, 119991

I. Le-Deygen

Lomonosov Moscow State University

Email: anna.skuredina@yandex.ru

Department of Chemistry

Ресей, Leninskie Gory 1/3, Moscow, 119991

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар