Impact of Effectors on the Catalytic Activity of Galactonolactone Oxidase from Trypanosoma cruzi

Толық мәтін

Сокращения: TcGAL – галактонолактоноксидаза из Trypanosoma cruzi; AtGALDH – L-галактоно-1,4-лактондегидрогеназа из Arabidopsis thaliana; БХ – 1,4-бензохинон; ЭА – электроноакцептор; ФМС – феназинметосульфат; ДХФИФ – 2,6-дихлорфенолиндофенол; АОТ – натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты; CoQ0 – коэнзим Q0; CoQ1 – коэнзим Q1.

ВВЕДЕНИЕ

Галактонолактоноксидаза из одноклеточного паразита Trypanosoma cruzi (TcGAL) – мембранный фермент, катализирующий финальную стадию биосинтеза витамина С – антиоксиданта, жизненно необходимого T. cruzi [1]. Этот микроорганизм не способен потреблять витамин С извне и должен синтезировать его самостоятельно. По этой причине ингибиторы TcGAL рассматриваются нами как основа для разработки селективных лекарственных средств против болезни Шагаса, вызываемой T. cruzi, поскольку организм человека не содержит галактонолактоноксидазу [2].

Следует подчеркнуть, что TcGAL не функционирует в водной среде (не принимает нативную конформацию). Поэтому для изучения TcGAL мы ранее разработали методику, позволяющую сворачивать фермент и измерять его активность, используя систему обращенных мицелл ПАВ (АОТ) [3]. Для контроля влияния мицеллярной среды на распределение компонентов реакционной системы и тем самым на каталитическую активность фермента в данной работе использовался гомолог TcGAL – факультативно мембранный фермент L-галактоно-1,4-лактондегидрогеназа из Arabidopsis thaliana (AtGALDH), катализирующий ту же реакцию, но проявляющий активность как в мицеллах, так и в воде.

Каталитический цикл AtGALDH и TcGAL состоит из двух полуреакций. В ходе одной из них субстрат (галактонолактон) превращается в продукт (аскорбат), а в ходе другой кофактор флавин (FAD) возвращается в исходное окисленное состояние, отдавая электроны электроноакцептору (ЭА) (рис. 1).

 

Рис. 1. Каталитический цикл ферментов AtGALDH и TcGAL.

 

Роль ЭА в случае TcGAL могут играть как кислород, так и другие соединения, т.е. TcGAL обладает одновременно оксидазной и дегидрогеназной активностью [1]. В нашей предыдущей работе [2] мы разработали методику ингибиторного анализа для TcGAL с применением системы обращенных мицелл и выявили ингибиторы терпеноидного ряда (действующие в микромолярных концентрациях). Однако остается неясным, на какую из активностей TcGAL они преимущественно влияют – на дегидрогеназную или оксидазную. Для исследования этого аспекта в данной работе мы изучили влияние ЭА на два типа гомологичного фермента AtGALDH (из растительного источника A. thaliana). Так, AtGALDH дикого типа обладает только дегидрогеназной активностью (не может использовать кислород в качестве ЭА) и представляет собой удобную модель для изучения влияния эффекторов именно на дегидрогеназную активность TcGAL в мицеллярной и водной средах. При этом мутантная форма AtGALDH (замена Ala113Gly [4]) обладает одновременно дегидрогеназной и оксидазной активностью, фермент является аналогом TcGAL, функционирующим как в мицеллах, так и в воде. Перечисленные свойства мутантной формы AtGALDH позволяют использовать ее в качестве контрольной системы при изучении действия ингибиторов, ЭА и других эффекторов в водной и мицеллярной средах.

Природным ЭА для TcGAL и AtGALDH является цитохром с, однако он теряет вторичную структуру в обращенных мицеллах [1]. Поэтому цитохром с не пригоден для измерения активности TcGAL в мицеллах. Следовательно, в случае мицелл требуются искусственные ЭА, такие как предложенный нами ранее феназинметосульфат (ФМС) [2, 3].

В качестве перспективных ЭА или эффекторов AtGALDH и TcGAL мы рассматриваем 1,4-бензохинон (БХ, рис. 2а) и его аналоги коэнзимы Q [1, 5], поскольку они являются природными ЭА для ряда мембранных ферментов и играют роль переносчиков электронов в дыхательной цепи у различных организмов. Так, мембраны млекопитающих содержат гомологи CoQn с длинными изопреновыми цепями: у человека это Q10, у грызунов – преимущественно Q9 [6]. У бактерий, например, у E. coli, присутствует коэнзим Q8 [7], а у дрожжей (S. сerevisiae) имеется более короткий Q6 [6]. Интересно отметить, что коэнзимы с короткой изопреновой цепью, такие как Q1 и Q2, используются для измерения активности ряда ферментов, таких как сукцинатдегидрогеназа и альтернативная оксидаза, в том числе из трипаносоматид (включая вид T. brucei, родственный T. cruzi) [8].

 

Рис. 2. Структуры 1,4-бензохинона (а) и его аналогов: коэнзима Q0 (б), коэнзима Q1 (в), 2,6-диметокси-1,4-бензохинона (г), 2,5-гидидрокси-1,4-бензохинона (д) и тимохинона (е).

 

В работе мы рассматриваем коэнзимы Q1 и Q0 (СoQ1 и CoQ0), являющиеся структурными аналогами 1,4-бензохинона (БХ). Так, коэнзим CoQ1 отличается от БХ наличием OCH₃- и CH₃групп в бензольном кольце, и, кроме того, CoQ1 имеет изопреновую цепь (рис. 2в). У CoQ0 имеются те же заместители в бензольном кольце, что и у CoQ1, но отсутствует изопреновый фрагмент (рис. 2б).

С точки зрения использования в качестве ЭА для измерения активности AtGALDH и TcGAL (и потенциально других дегидрогеназ) коэнзимы CoQ0 и CoQ1 могут обладать преимуществами по сравнению с ранее исследованным БХ [5, 9]. Так, в шестичленном кольце CoQ1, в отличие от БХ, все атомы водорода замещены на алкильные или метоксигруппы (рис. 2), поэтому CoQ0 и CoQ1 более устойчивы в слабощелочной среде [4], что может способствовать их большей применимости в качестве ЭА для TcGAL с оптимумом активности при рН 8.8.

В литературе высказано предположение о важной роли изопреновой цепи, имеющейся у CoQ1, для электроноакцепторных свойств коэнзимов [10]. Однако согласно нашим данным, коэнзим Q10, обладающий длинной изопреновой цепью (10 звеньев), не является ЭА в случае AtGALDH, а напротив, оказывает некоторое ингибирующее влияние на фермент [5]. Таким образом, среди коферментов CoQ перспективными представляются CoQ0 и CoQ1 как потенциальные ЭА для TcGAL и AtGALDH.

Помимо коэнзимов, в качестве потенциальных ЭА для TcGAL и AtGALDH можно рассматривать 2,6-диметокси-1,4-бензохинон (рис. 2г), производное 1,4-бензохинона, встречающееся во многих растениях и выступающее в качестве эффективного ЭА таких ферментов, как 1,4-бензохинонредуктаза [11]. Другим перспективным ЭА выступает аналог 2,6-диметокси-1,4-бензохинона – 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинон, отличающийся заменой метоксигрупп на гидроксигруппы и их положением (рис. 2д). Электроноакцепторные свойства 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинона описаны в литературе: например, данное соединение выступает в роли π-акцептора в случае комплекса с переносом заряда, который образуется между 2-амино-4-метокси-6-метилпиримидином и 2,5-дигидрокси-1,4-бензохиноном [12]. Наконец, следует выделить тимохинон (рис. 2е), производное 1,4-бензохинона из растительных источников (можжевельник), являющееся электроноакцептором хиноноксидоредуктазы (NQO-1) [13] и объектом повышенного внимания ученых ввиду своих антидиабетических свойств [14–16].

Таким образом, целью данной работы было исследование влияния структуры потенциальных ЭА или эффекторов (1,4-бензохинона и его структурных аналогов) на активность TcGAL и гомологичного фермента AtGALDH.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние 1,4-бензохинона и его аналогов на дегидрогеназную активность AtGALDH. Для изучения влияния БХ и его производных на дегидрогеназную составляющую TcGAL мы использовали природную форму гомологичного фермента AtGALDH, обладающего только дегидрогеназной активностью. Измерение активности AtGALDH в присутствии каждого потенциального ЭА проводили спектрофотометрически с использованием красителя ДХФИФ, который обесцвечивается при взаимодействии с продуктом реакции – аскорбатом [3].

 

Рис. 3. Максимальная активность природной формы AtGALDH в водной (натрий-фосфатный буфер) (а) и в мицеллярной (0.1 М АОТ в н-октане, W₀ = 22) (б) средах в зависимости от структуры ЭА в присутствии красителя ДХФИФ. Концентрации: субстрат (1 мМ), ДХФИФ (120 мкМ), AtGALDH (6 нМ). Концентрации ЭА, при которых наблюдалась максимальная активность фермента, указаны в табл. 1.

 

Полученные зависимости максимальной активности AtGALDH от структуры используемого ЭА в водной и мицеллярной средах представлены на рис. 3. В качестве контроля на рис. 3 приведена активность AtGALDH в присутствии ФМС и красителя ДХФИФ (2,6-дихлорфенолиндофенол), которые использовали в качестве базисной системы в наших предыдущих работах [2, 3, 5].

Обнаружено, что в водной среде 2,6-диметокси-БХ и CoQ0 обеспечивают в 4–5 раз большую активность (V_макс) AtGALDH по сравнению с ранее исследованными БХ и CoQ1 [5] (табл. 1). При этом в мицеллярной среде 2,6-диметокси-БХ позволяет достичь более высокого значения V_макс по сравнению с таковым для БХ и CoQ1 (табл. 1).

 

Таблица 1. Каталитические характеристики 1,4-бензохинона и его аналогов как электроноакцепторов природной формы AtGALDH

Электроноакцептор	AtGALDH (природная форма)
	Водно-буферный раствор				Мицеллы
	Vмакс**, 10–7 M/c	фоновый сигнал**, 10–7 M/c	pH- оптимум	[ЭА]насыщ, мкМ	Vмакс**, 10–7 M/c	фоновый сигнал**, 10–7 M/c	pH- оптимум	[ЭА]насыщ, мкМ
CoQ0	25.7	–	8.8	0.016	1.6	–	8.8	0.9
2,6-Диметокси-БХ	21.5	–	8.8	2.3	13.5	–	8.8	14
БХ*	7.1	1.0	7.8	4 000	4.6	0.8	7.8	2 000
CoQ1*	5.4	0.5	7.8	4 000	1.1	0.4	7.8	2 000
ФМС	12.5	–	8.8	120	5.0	–	8.8	120

Примечание: V_макс – максимальная активность фермента; [ЭА]_насыщ – концентрация ЭА, при которой наблюдается V_макс.

* Данные для БХ и CoQ1 приведены из работы [5].

** Погрешность измерения каталитической активности не превышает 10%.

 

Отметим, что в обеих средах (водной и мицеллярной) 2,6-диметокси-БХ и CoQ эффективны при низких концентрациях (~0.02–10 мкМ), в то время как БХ и CoQ1 действуют лишь при концентрациях ~2 мМ. Следует учесть и другие ограничения при использовании БХ и CoQ1 как ЭА. Так, при измерении активности AtGALDH по изменению поглощения самого БХ или CoQ1 значительный вклад вносит фоновый сигнал. Кроме того, БХ подвержен окислению в слабощелочной среде при pH-оптимуме фермента в водной и мицеллярной средах [9, 5]. В отличие от БХ и CoQ1, комбинации 2,6-диметокси-БХ и CoQ0 с красителем практически не проявляют фонового сигнала (< 5% от целевого) и функционируют при pH-оптимуме AtGALDH (pH 8.8) (табл. 1).

Наконец, использование 2,6-диметокси-БХ и CoQ0 показывает преимущества не только по сравнению с БХ и CoQ1, но и по сравнению с разработанной нами ранее методикой с использованием ФМС как ЭА [3]. Так, в водной среде максимальная скорость (V_макс) в присутствии 2,6-диметокси-БХ или CoQ0 выше в 2 раза по сравнению с ФМС, а в мицеллярной – сопоставима (рис. 3). При этом используемые концентрации 2,6-диметокси-БХ и CoQ0 (0.02–10 мкМ) на несколько порядков ниже таковой для ФМС (120 мкМ [3]).

Учитывая гомологичность AtGALDH и TcGAL, а также наилучшие параметры для 2,6-диметокси-БХ как ЭА в мицеллах для дегидрогеназы AtGALDH, можно предположить, что 2,6-диметокси-БХ как ЭА будет наиболее эффективен и для TcGAL. Однако, как упоминалось выше, TcGAL обладает одновременно дегидрогеназной и оксидазной активностями, а дикий тип AtGALDH – только дегидрогеназной. Мутантная форма AtGALDH (замена Ala113Gly [4]), как и сам TcGAL, обладает обоими типами активности, что позволяет определить степень влияния ЭА на дегидрогеназную активность по отношению к оксидазной. Кроме того, поскольку AtGALDH функционирует не только в мицеллах, но и в водном растворе, с использованием мутантного типа AtGALDH мы можем изучить роль среды (мицеллы или вода) на свойства эффекторов в отношении целевого TcGAL, функционирующего только в мицеллах.

Влияние 1,4-бензохинона и его аналогов на активность мутантной формы AtGALDH. Для изучения действия эффекторов (1,4-бензохинона и его производных) на мутантную форму AtGALDH (замена Ala113Gly [4]) использовали методику с применением красителя ДХФИФ – проявителя продукта реакции (аскорбата) [3]. Действие таких эффекторов продемонстрировано на рис. 4.

 

Рис. 4. Максимальная активность мутантной формы AtGALDH в водной (натрий-фосфатный буфер, pH 8.8 для CoQ0 и 2,6-диметокси-БХ и pH 7.8 для CoQ1 и БХ) (а) и мицеллярной (0.1 М АОТ в н-октане, pH 8.8 для CoQ0 и 2,6-диметокси-БХ и pH 7.8 для CoQ1 и БХ, W₀ = 22) (б) средах в зависимости от структуры ЭА в сочетании с красителем ДХФИФ. Концентрации: субстрат (1 мМ), ДХФИФ (120 мкМ), AtGALDH (6 нМ). Для сравнения указана активность без добавления ЭА.

 

В отличие от AtGALDH дикого типа, в водной среде наиболее сильное воздействие оказывает БХ, усиливающий активность мутантной формы AtGALDH в 3 раза по сравнению с контролем (без ЭА) (рис. 4). В меньшей степени на активность AtGALDH влияют CoQ0 и 2,6-диметокси-БХ (усиление активности AtGALDH в 2 раза) и CoQ1 (усиление всего на 20%).

В случае мицелл драматическое воздействие оказывает 2,6-диметокси-БХ, усиливающий активность мутантной формы AtGALDH в 10 раз. В то же время остальные соединения усиливают активность фермента лишь в ~2 раза. Каталитические характеристики исследуемых эффекторов в отношении мутантной формы AtGALDH представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Каталитические характеристики эффекторов мутантной формы AtGALDH – 1,4-бензохинона и его аналогов

Эффектор	AtGALDH (мутантная форма, Ala113Gly)
	водно-буферный раствор				мицеллы
	C50, мкМ	Vмакс*, 10–7 M/c	pH	[ЭА]насыщ, мкМ	C50, мкМ	Vмакс*, 10–7 M/c	pH	[ЭА]насыщ, мкМ
БХ	0.5	13	7.8	12.8	1.5	1.4	7.8	20
Q1	5.0	5	7.8	20	3.8	1.3	7.8	10
2,6-OCH3-БХ	0.4	7.3	8.8	2.1	4.8	7.9	8.8	12
Q0	0.006	7.4	8.8	0.12	0.17	2.1	8.8	0.5

Примечание: C₅₀ – концентрация эффектора, вызывающая увеличение активности фермента в 2 раза по сравнению с активностью в отсутствие эффектора; V_макс – максимальная активность фермента; [ЭА]_насыщ – концентрация ЭА, при которой наблюдается V_макс.

* Погрешность измерения каталитической активности не превышает 10%.

 

Сравнивая результаты, полученные для дикой и мутантной форм AtGALDH, следует подчеркнуть, что в мицеллах обе формы наиболее активны в присутствии 2,6-диметокси-БХ (его влияние на оксидазную активность более выражено, чем на дегидрогеназную). Это позволяет предположить, что и в случае гомологичного TcGAL наибольшая активность должна наблюдаться для 2,6-диметокси-БХ. Кроме того, для TcGAL в качестве ЭА перспективен CoQ0, работающий при pH-оптимуме обоих ферментов (pH 8.8), в отличие от БХ и CoQ1.

Влияние 2,6-диметокси-БХ и его аналогов на активность TcGAL. Поскольку БХ и CoQ1 не оптимальны для определения активности фермента (показывают слишком высокую фоновую реакцию) при pH-оптимуме TcGAL [5] и оказывают слабое влияние на аналог TcGAL – мутантную форму AtGALDH, то представляется целесообразным изучить действие других производных БХ – 2,6-диметокси-БХ, CoQ1 и тимохинона – на активность TcGAL. Кроме того, интересно изучить влияние замены метоксигрупп на гидроксигруппы, имеющиеся, например, у 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинона, электроноакцепторные свойства которого описаны в литературе (является π-акцептором в случае комплекса с переносом заряда [12]). Полученные зависимости максимальной активности TcGAL от структуры вышеперечисленных потенциальных ЭА в комбинации с красителем представлены на рис. 5.

 

Рис. 5. Зависимость максимальной активности TcGAL в мицеллярной среде (0.1 М АОТ в н-октане, pH 8.8, W₀ = 22) от структуры эффектора (электроноакцептора) в сочетании с красителем ДХФИФ. Концентрации субстрата (1 мМ), ДХФИФ (120 мкМ) и TcGAL (34 нМ) поддерживались постоянными. Для сравнения показана активность TcGAL в присутствии 120 мкМ ФМС по ранее опубликованным данным [3]. Концентрации эффекторов (электроноакцепторов), при которых наблюдалась максимальная активность фермента: 2,5-дигидрокси-БХ (360 мкМ), тимохинон (200 мкМ), CoQ0 (0.72 мкМ), 2,6-диметокси-БХ (24 мкМ). Концентрация ФМС в контрольных измерениях – 120 мкМ.

 

Примечательно, что CoQ0 и 2,6-диметокси-БХ в случае TcGAL показывают тенденции, аналогичные наблюдаемым для обеих форм гомологичного AtGALDH в мицеллах (рис. 3–5). Так, CoQ0 функционирует при концентрациях на 1–3 порядка меньше, чем другие ЭА, а наибольшее значение максимальной активности наблюдается в случае 2,6-диметокси-БХ (рис. 5). Отдельно следует отметить тимохинон, который не является ЭА для TcGAL, а напротив, оказывает слабое ингибирующее действие (20%-ное ингибирование при 200 мкМ тимохинона).

Таким образом, наиболее эффективным ЭА среди изучаемых соединений оказался 2,6-диметокси-БХ при невыраженной фоновой реакции (< 5% от целевой). Столь высокая эффективность 2,6-диметокси-БХ как ЭА позволила нам предположить, что за ходом реакции можно следить и в отсутствие красителя (ДХФИФ), если 2,6-диметокси-БХ обладает достаточной разницей коэффициентов молярного поглощения окисленной и восстановленной форм.

Разработка подхода к измерению активности TcGAL без красителя с применением 2,6-диметокси-1,4-бензохинона в качестве электроноакцептора. Использование в мицеллах дополнительных реагентов, в том числе красителя ДХФИФ, желательно сводить к минимуму ввиду ограниченного объема водной фазы и возможного влияния красителя на другие компоненты системы. Установив, что 2,6-диметокси-БХ – наиболее эффективный потенциальный ЭА для TcGAL, мы исследовали возможность применения данного ЭА для определения активности TcGAL без использования красителя (ДХФИФ). Спектры окисленной и восстановленных форм 2,6-диметокси-БХ имеют наибольшую разницу в поглощении при длине волны 285 и 287 нм в водном растворе и в мицеллах соответственно (рис. 6).

 

Рис. 6. (а) – Спектры окисленной и восстановленной форм 24 мкМ 2,6-диметокси-БХ в натрий-фосфатном буфере, pH 8.8); (б) – спектры окисленной и восстановленной форм 24 мкМ 2,6-диметокси-БХ в мицеллярной среде (0.1 М АОТ в н-октане, W₀ = 22, pH 8.8); (в) – спектры реакционной смеси (1 мМ D-арабиноно-1,4-лактон, 24 мкМ 2,6-диметокси-БХ) в мицеллярной среде (0,1 М АОТ в н-октане, W₀ = 22) до и после протекания реакции (добавления 34 нМ TcGAL); (г) – зависимость активности TcGAL от концентрации 2,6-диметокси-БХ (без красителя) и от концентрации CoQ0 (в комбинации с 120 мкМ ДХФИФ), в качестве базовой линии указана активность TcGAL при комбинации 120 мкМ ФМС и 120 мкМ ДХФИФ.

 

Спектры поглощения реакционной смеси (содержащей все необходимые компоненты) до и после реакции (рис. 6в) также имеют вид, аналогичный спектрам окисленной и восстановленной форм 2,6-диметокси-БХ в водной и мицеллярной средах (рис. 6а, 6б). Это свидетельствует о том, что 2,6-диметокси-БХ расходуется в ходе реакции, т.е. является именно ЭА для TcGAL, а не, например, аллостерическим эффектором.

Варьируя концентрацию 2,6-диметокси-БХ в водной и мицеллярной средах, мы определили коэффициенты молярного поглощения окисленной и восстановленной форм 2,6-диметокси-БХ и их разницу (ε_{окисл — восст}) (табл. 3), которая составляет 13 900 (для водного раствора) и 4 600 М⁻¹см⁻¹ (для мицеллярной системы). Большее значение параметра ε_{окисл — восст} в мицеллярной среде по сравнению с незамещенным БХ и ФМС с разностными коэффициентами поглощения 3050 и 2100 М⁻¹см⁻¹ соответственно [3] говорит о возможности применения 2,6-диметокси-БХ для измерения активности TcGAL по расходу ЭА в процессе реакции.

 

Таблица 3. Спектрофотометрические параметры 2,6-диметокси-БХ в водной (PBS, pH 8.8) и мицеллярной (0.1 М АОТ в октане, W₀ = 22) средах

Среда	Длина волны, нм	εокисл, М⁻¹см⁻¹	εвосст, М⁻¹см⁻¹	εокисл — восст, М⁻¹см⁻¹
Вода	285	22 600	8 700	13 900
Мицеллы	287	9 200	4 600	4 600

 

Используя найденное значение ε_{окисл—восст} = 4 600 М⁻¹см⁻¹ (табл. 3), мы определили максимальную активность TcGAL в присутствии 24 мкМ (в насыщении по 2,6-диметокси-БХ, рис. 6г). Оказалось, что найденное значение (17.8 × 10^–7 М/c) в 1.5 раза выше активности в случае комбинации ФМС и красителя (контрольной системы), использовавшейся нами ранее для изучения TcGAL [2, 3]. Следовательно, 2,6-диметокси-БХ – эффективный ЭА для TcGAL, позволяющий надежно регистрировать активность TcGAL.

Таким образом, разработан улучшенный подход к измерению активности TcGAL с использованием 2,6-диметокси-БХ (24 мкМ) в качестве ЭА, который не требует использования дополнительных агентов (красителя).

Ингибиторный анализ TcGAL с применением 2,6-диметокси-1,4-бензохинона в качестве электроноакцептора. В наших предыдущих работах было продемонстрировано применение методики измерения активности TcGAL с использованием комбинации ФМС и красителя ДХФИФ для ингибиторного анализа TcGAL [2, 3]. В настоящей работе мы изучили возможность применения подхода с использованием 2,6-диметокси-БХ как ЭА (в отсутствие красителя) для ингибиторного анализа TcGAL. Для этого изучили действие двух соединений, аллилбензола и аллилтетраметоксибензола, которые проявляли ингибирующий эффект в отношении TcGAL в случае методики, разработанной нами ранее, с ФМС и красителем ДХФИФ [2] (рис. 7). Для оценки эффективности обоих ингибиторов в случае 2,6-диметокси-БХ была выбрана концентрация 200 мкМ, соответствующая максимальному эффекту обоих соединений в случае системы, содержащей ФМС и краситель [2].

 

Рис. 7. (а) – Схема ингибирования целевой реакции; (б) – сравнение ингибирующего эффекта аллилтетраметоксибензола и аллилбензола для краситель-содержащих систем (комбинация красителя ДХФИФ и ФМС или Q0 как ЭА) и системы без красителя (2,6-диметокси-БХ как ЭА). Концентрации веществ: 120 мкМ ДХФИФ, 1 мМ АР (субстрат), 34 нМ TcGAL, 24 мкМ 2,6-диметокси-БХ, 120 мкМ ФМС и 0.72 мкМ Q0, 200 мкМ аллилтетраметоксибензола и 200 мкМ аллилбензола. Среда: 0.1 М АОТ в н-октане, W₀ = 22.

 

Оказалось, что ингибирующий эффект при использовании 2,6-диметокси-БХ как ЭА действительно наблюдался, как и в случае ранее использованной методики с применением ФМС и красителя [2]. Эффективность изученных ингибиторов коррелирует для ФМС и 2,6-диметокси-БХ, а также для системы, содержащей CoQ0 как ЭА и краситель ДХФИФ (рис. 7). Следовательно, использование 2,6-диметокси-БХ в отсутствие красителя позволяет надежно регистрировать ингибирование TcGAL.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты. В работе использовали L-галактоно-1,4-лактон, D-арабиноно-1,4-лактон, 2,6-дихлорфенолиндофенол, натриевую соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (АОТ), коэнзим Q1, коэнзим Q0, 2,6-диметокси-1,4-бензохинон, 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинон, н-октан, ацетонитрил (Sigma-Aldrich, США); феназинметосульфат и 1,4-бензохинон (Merck, Германия); аллилтетраметоксибензол и аллилбензол (Acros Organics, Бельгия). L-галактоно-1,4-лактондегидрогеназа из Arabidopsis thaliana была любезно предоставлена проф. W.J.H. van Berkel (Вагенингенский университет, Вагенинген, Нидерланды).

Получение рекомбинантных белков AtGALDH и TcGAL, рефолдинг телец включения TcGAL. Экспрессию рекомбинантных белков AtGALDH (EC 1.3.2.3) и TcGAL (EC 1.3.3.12) в E. coli проводили согласно методике, описанной ранее [1, 9]. AtGALDH-His6 экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3) в виде растворимого цитоплазматического белка. Для продукции фермента TcGAL использовали клетки E. coli BL21 (DE3), несущие плазмиду pBAD-TcGAL. TcGAL формировал нерастворимые тельца включения. Рефолдинг TcGAL проводили согласно методике, описанной нами ранее [1]. Суспензию телец включения, собранных после лизиса клеток, промывали 6%-ным раствором Triton X-100, содержащим 60 мМ ЭДТА и 1.5 М NaCl (рН 7.0), и растворяли в 6 М гуанидинхлориде. Затем гуанидинхлорид удаляли диализом против 10 мМ фосфата натрия (рН 8.0). После диализа суспензию агрегированного фермента вносили в систему обращенных мицелл вода–АОТ–октан. Растворы окисленного и восстановленного глутатиона (10 мМ GSSG и 30 мМ GSH) в 10 мМ фосфате натрия (рН 8.0) смешивали, аликвоту (10 мкл) добавляли к 1 мл мицеллярного раствора фермента в 0.4 М АОТ. Рефолдинг фермента инициировали добавлением 10 мкл раствора FAD в воде (10-кратный молярный избыток по отношению к ферменту). Сворачивание и конечную концентрацию фермента в мицеллах контролировали методом КД-спектроскопии с использованием КД-спектрометра J-815 (Jasco, Япония).

Каталитическая активность AtGALDH и TcGAL. Для спектрофотометрического определения активности обоих ферментов использовали систему обращенных мицелл ПАВ, 0.1 М АОТ в н-октане (степень гидратации W₀ = 22), описанную нами ранее [3], с небольшими изменениями. Для измерения активности ферментов использовали комбинацию одного из потенциальных ЭА (1,4-бензохинон или его производные) и 120 мкМ водный раствор ДХФИФ в качестве красителя, обесцвечивающегося при образовании продукта реакции при длине волны 550 нм. Запасные растворы ЭА (CoQ0, CoQ1, 2,6-диметокси-1,4-бензохинона и 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинона) готовили в DMSO. Поглощение измеряли с помощью спектрофотометра Ultrospec-2100pro (Amersham Biosciences, США). В качестве субстратов использовали L-галактоно-1,4-лактон в случае AtGALDH и D-арабиноно-1,4-лактон в случае TcGAL. Концентрации субстратов составляли 1 мМ, ферментов TcGAL (34 нМ) и AtGALDH (6 нМ). Для построения графиков и статистической обработки данных с использованием t-критерия Стьюдента применяли программу SigmaPlot 11.1. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Ингибиторный анализ TcGAL. При разработке подхода к ингибиторному анализу использовали ЭА без красителя, добавляя один из исследуемых ингибиторов (аллилбензол или тетраметоксиаллилбензол) в реакционную среду. В качестве контрольной системы использовали систему, содержащую 120 мкМ ФМС и 120 мкМ ДХФИФ, описанную нами ранее [2]. Эффективность ингибиторов при использовании предлагаемого подхода в сравнении с методикой с применением красителя оценивали по ингибирующему эффекту при насыщающих концентрациях ингибиторов (200 мкМ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружены новые ЭА для TcGAL ряда 1,4-бензохинона (конзимы Q0, Q1, 2,5-дигидрокси-БХ и 2,6-диметокси-БХ) и выявлено влияние структуры ЭА на активность TcGAL. Так, установлено, что соединения, содержащие метоксигруппы, являются более эффективными электроноакцепторами для TcGAL (коэнзим Q0, 2,6-диметокси-БХ) по сравнению c соединениями, не имеющими OCH₃-групп (2,5-дигидрокси-БХ, а также тимохинон, являющийся слабым ингибитором TcGAL).

При исследовании двух форм AtGALDH (природной и мутантной) обнаружено, что в водной среде более “чувствительна” (наибольшая разница в значениях активности) к выбору эффектора природная (дегидрогеназная) форма. В то же время в мицеллах более чувствительна мутантная форма AtGALDH (сочетание дегидрогеназной и оксидазной активности), активность которой более резко возрастает при использовании 2,6-диметокси-БХ. По-видимому, и в случае трипаносомального фермента TcGAL, функционирующего в мицеллах, 2,6-диметокси-БХ оказывает влияние на оба типа активности (дегидрогеназную и оксидазную).

С применением 2,6-диметокси-БХ в качестве ЭА разработан новый подход к измерению активности TcGAL, обладающий преимуществами по сравнению с ранее предложенным подходом [3]. Так, новый подход не требует применения красителя и, кроме того, обеспечивает в 1.5 раза большую активность фермента при меньшей (в 5 раз) концентрации ЭА. Продемонстрирована возможность использования нового подхода для ингибиторного анализа TcGAL. Это еще один шаг в поиске ингибиторов данного фермента, которые могут рассматриваться в качестве основы для разработки лекарственных средств против болезни Шагаса, вызываемой T. cruzi [2].

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования (КД-спектрометр J-815, Jasco, Япония) по программе развития МГУ им. М.В. Ломоносова.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Авторлар туралы

A. Chudin

Lomonosov Moscow State University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: andrew_18@inbox.ru

Chemical Department

Ресей, Leninskie gory 1/3, Moscow, 119991

E. Kudryashova

Lomonosov Moscow State University

Email: Helenakoudriachova@yandex.ru

Chemical Department

Ресей, Leninskie gory 1/3, Moscow, 119991

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар