Architectonics of Ubiquitin Chains

Full Text

Сокращения: Ub – убиквитин; APC/C – убиквитинлигаза; ЖХ – жидкостная хроматография; МС – масс-спектрометрия.

1. ВВЕДЕНИЕ

Убиквитин (Ub) – небольшой (~8 кДа) сигнальный белок, играющий центральную роль во многих клеточных процессах, включая деградацию белков [1, 2], активацию сигнальных путей и репарацию ДНК [3, 4]. Известно до 14 различных семейств убиквитина и убиквитин-подобных белков, различающихся по аминокислотной последовательности, но имеющих характерную пространственную структуру.

 

Рис. 1. (а) – В данной методике используется введение мутаций в убиквитин с последующим нанесением на ПААГ и масс-спектрометрией для выявления образования разветвленных цепей (табл. 1); (б) – представлен вариант обнаружения убиквитиновых цепей при помощи присоединенных эпитопной метки и сайта расщепления с последующей обработкой протеазой и иммуноблоттингом (табл. 1); (в) – показана схема метода иммунопреципитации, в котором присутствие разветвленных цепей детектируется последовательным иммуноблоттингом, ЖХ и МС (табл. 1).

 

Убиквитин прикрепляется к белку-мишени с помощью последовательных действий представительного семейства ферментов. Ковалентное присоединение убиквитина к субстратам осуществляется при помощи системы, состоящей из трех ферментов: активирующей убиквитин E1-лигазы, конъюгирующей E2-лигазы и убиквитинлигазы E3. Существует множество способов модификации белков убиквитином, из которых выделяют моноубиквитинирование (одного или нескольких сайтов), а также полиубиквитинирование с разными параметрами связи и длинами убиквитиновых цепей. ε-Аминогруппы семи остатков лизина K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63, входящих в состав убиквитина, позволяют ему образовывать изопептидные связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина одной молекулы убиквитина и аминогруппой другой молекулы убиквитина, которая, в свою очередь, связана с белком-субстратом посредством С-концевого остатка глицина G76 [5]. Параметры цепей крайне разнообразны: они могут быть как гомогенными или гомотипическими (т.е. образовывать связи через остатки лизинов в строго определенном положении), так и гетерогенными или гетеротипическими (комбинировать разные типы связей); последние, в свою очередь, могут разветвляться посредством убиквитинирования сразу по нескольким сайтам (разветвленные цепи) [6]. Считается, что значение сигнала убиквитинирования зависит от типа связи и длины убиквитиновой цепи. Так, классическое представление состоит в том, что цепи, образованные через остаток лизина K48, обычно маркируют белки, предназначенные для деградации в протеасоме, в то время как цепи, образованные связью через остаток лизина К63, играют ключевую роль в координации процессов направленного эндоцитоза, воспаления, трансляции и репарации ДНК. Если физиологические функции были охарактеризованы для некоторых гомотипических убиквитиновых цепей [7], то гетеротипические цепи остаются практически неизученными. Существование и физиологическая роль большей части гетеротипических комбинаций – до сих пор открытый вопрос. В основном это связано с тем, что на несмотря на довольно широкий репертуар методов, используемых для изучения убиквитиновых цепей [7], ввиду большой сложности объекта исследования очень затруднительно корректно интерпретировать получаемые результаты.

В данном обзоре рассмотрены используемые в настоящий момент методы изучения убиквитиновых цепей, их характеристики и ограничения, а также особенности функционирования как описанных, так и пока мало изученных гомо- и гетеротипических цепей.

2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ УБИКВИТИНОВЫХ ЦЕПЕЙ

Традиционно убиквитинирование белков – процесс, важный для регуляции клеточных функций, – исследовали биохимическими методами, в первую очередь, используя иммуноблоттинг с антителами к убиквитину. Этот метод наиболее распространен для обнаружения и подтверждения убиквитинирования отдельных белков. Однако иммуноблоттинг – аналитически сложный метод, что ограничивает его применимость для полного профилирования убиквитинирования белков. С развитием масс-спектрометрических подходов все чаще используются протеомные методы для профилирования убиквитинирования. Для повышения чувствительности идентификации убиквитинированных белков осуществляют их обогащение из лизатов клеток. Для этого присоединяют к убиквитину различные эпитопные (Flag, HA, V5, Myc, Strep и His) или белковые метки (GST, MBP, SUMO, CBP, Halo, Nus A и FATT) (рис. 1) [8]. C помощью этого метода было обнаружено значительное число сайтов убиквитинирования на различных субстратах [9, 10].

Несмотря на то что данный подход довольно прост и удобен, он имеет довольно низкую эффективность и высокий уровень “шума”, поэтому большее внимание привлекают подходы, позволяющие обогащать эндогенные убиквитинированные белки.

Для профилирования эндогенно убиквитинированных субстратов было разработано несколько типов антител к убиквитину, способных распознавать все типы связей [11]. Помимо антител к тотальному убиквитину используют антитела, специфичные к определенным типам связей (M1/ K11/K27/K48/K63) [12]. Этот подход успешно применяется для характеристики убиквитинирования белков из тканей животных или клинических образцов без необходимости генетических манипуляций.

 

Рис. 2. (а) – В данной методике к образцу с субстратом добавляют деубиквитиназы, в результате чего происходит отщепление убиквитиновых цепей от субстрата с последующей их визуализацией методом масс-спектрометрии; (б–г) – представлены варианты масс-спектрометрических подходов, в которых использовано расщепление трипсином (б, в) и разделение убиквитиновых цепей в зависимости от их способа ветвления (б–г) (табл. 1). Частично заимствовано из работ [19], [82], [90–94].

 

Помимо антител используются белки, содержащие убиквитин-связывающие домены, которые распознают убиквитин, что также может быть использовано для связывания и обогащения эндогенно убиквитинированных белков [13, 14] (рис. 2, табл. 1). Тандемно повторяющиеся убиквитин-связывающие домены (TUBEs) продемонстрировали значительно более высокую аффинность (наномолярные концентрации), чем одиночные домены [14, 15]. Были разработаны TUBEs для специфических связей K63, K48 и M1 [15, 16].

Кроме того, используются методы, включающие в себя введение радиоактивных изотопов для отслеживания образования разветвленных цепей (рис. 3) (табл. 1).

 

Рис. 3. (а) – В данной методике происходит убиквитинирование радиоактивно меченым убиквитином с последующим нанесением на ПААГ, вырезанием из геля, обработкой трипсином и разделением на масс-спектрометрии в соответствии с изотопным составом; (б) – представлена комбинация методов ЖХ и тандемной-масс-спектрометрии, в результате которой становится возможной идентификация убиквитиновых цепей; (в) – в этом случае к флуоресцентно меченым убиквитиновым цепям присоединяется белковая метка GST, впоследствии пробу наносят на ПААГ и выявляют флуоресцентным сканированием (табл. 1). Частично заимствовано из работы [95].

 

Важно отметить, что убиквитинирование можно изучать и при помощи баз данных, таких как SCUD и UbiProt [17].

Цепи убиквитина с различной топологией регулируют стабильность белка, белок-белковое взаимодействие или локализацию белка в эукариотических клетках и, таким образом, играют важную роль в многофункциональных сигналах [18]. Рассмотренные выше подходы в основном обнаруживают убиквитинированные субстраты и сайты убиквитинирования, но не способны определить архитектуру цепей. Существует несколько возможностей детекции архитектуры цепей, например, для идентификации различных топологий используют специфические антитела или TUBEs [8].

 

Рис. 4. (а) – Схема методики PRIME, примененной в работе Kudriaeva et al. [7]. Показана синхронная экспрессия резоруфин-лигазы и белка интереса, а также обработка клеток резоруфином; (б) – схема профилирования стабильности убиквитина у млекопитающих [7]. Стабильные линии клеток HEK293T с одновременной экспрессией вариантов LAP-UbK0 с заменой R на K и TagBFP-LplA(AAG), смешанные в равном соотношении, обрабатывали резоруфином, инкубировали с DMSO или ингибитором протеасомы в течение 2 ч и далее фракционировали с применением проточной цитометрии. Фракции клеток с разным соотношением флуоресценции TagBFP и резоруфина подвергали ПЦР для амплификации геномного кластера, кодирующего соответствующий вариант убиквитина, и далее NGS-секвенированию. Показан график зависимости распространенности вариантов убиквитина от их стабильности. Сокращения: гДНК – геномная ДНК.

 

Важное значение для определения параметров круговорота Ub имеет работа Kudriaeva et al. (2021) (рис. 4) [7]. В ней авторы использовали лентивирусные конструкции, обеспечивающие синхронную экспрессию ZsGreen и модифицированной липоатлигазы LpIA (AAG), конъюгирующей к ε-аминогруппе лизина в составе LAP пептида флуорофор резоруфин. В результате анализа флуоресценции клеток HEK293T, экспрессирующих LAP-Ub и ZsGreen-LpIA (AAG), было установлено, что время полужизни убиквитина в клетках млекопитающих составляет τ_1/2 ~ 4 ч. Динамическое равновесие между процессами убиквитинирования и деубиквитинирования соответствовало 6–7 молекулам Ub на субстрат. Отношение флуоресценции ZsGreen и резоруфина позволило определить стабильность вариантов Ub. Так, стабильность снижалась в ряду WT > R27K > > R29K > R33K > R6K > R11K > R63K > R48K > > UbK0^VV. Профилирование стабильности вариантов Ub методом FACS выявило, что аминокислотный остаток K27 обеспечивает стабильность всей молекулы Ub. Анализ полученных данных показал, что только каждый четвертый захват полиубиквитинового субстрата приводит к потере одной молекулы убиквитина из состава всей цепи, и что каждая молекула Ub принимает участие в среднем в 16 циклах конъюгации, каждые 15 мин включаясь в новые цепи.

Подробное описание методов, позволяющих изучать гетеротипические цепи, представлено в табл. 1.

 

Таблица 1. Методы изучения разветвленных цепей

Метод	Достоинства	Недостатки	Ссылки
Вставка сайта расщепления TEV после Gly53, Glu64 и FLAG-эпитопа с последующим иммуноблоттингом	– Позволяет отслеживать образование разветвленных убиквитиновых цепей in vivo, в отличие от масс-спектрометрии – Выяснено, что APC/C, Ube2C и Ube2S присоединяют к субстратам разветвленные цепи	– Изменение поверхностных свойств белка и нарушение его способности формировать цепи – Только качественная идентификация – Возможны артефакты	[19, 20]
Масс-спектрометрия “bottom-up” Варианты: 1) обработка трипсином с последующей ЖХ-МС 2) к лизатам клеток добавляли антитела, специфичные к определенным связям между убиквитинами, (иммунопреципитация), затем наносили на гель-электрофорез и окрашивали по Кумасси, далее вырезали фрагменты и обрабатывали трипсином, затем МС 3) аффинная хроматография, обработка трипсином, затем МС 4) иммунопреципитация, обработка трипсином и MС-MС 5) нанесение на гель-электрофорез, обработка трипсином, затем Ub-AQUA (изотопно меченые распознаваемые пептиды (signature peptides (AQUA peptides)) для восьми типов связей добавляют к образцам в качестве внутренних стандартов), ЖХ-МС, мониторинг параллельных реакций (parallel reaction monitoring (PRM)) 6) мутация R54A, нанесение на гель-электрофорез, обработка трипсином, затем Ub-AQUA (изотопно меченые распознаваемые пептиды (signature peptides (AQUA peptides)) для восьми типов связей добавляются к образцам в качестве внутренних стандартов), ЖХ-МС, PRM 7) + TR-TUBE, обработка трипсином, Ub-AQUA/PRM	– Были обнаружены цепи K6/K11, K27/K29, K29/K33 и K48/K63 (после модификации Ub c мутацией Arg54) – К преимуществам геля относятся эффективная денатурация белков, удаление несовместимых с МС солей и хаотропов – Возможно обнаружение разветвленных K48/K63-цепей и отделение их от K48- и K63-цепей – Позволяет одновременно детектировать все восемь типов связей и определять их стехиометрию – Достоинства PRM: высокая чувствительность и точность – Позволяет избежать неспецифической адсорбции гидрофобных пептидов – Можно определить K48/K63-, K48- и K63-цепи	– Не позволяет выявлять цепи с аминокислотными остатками лизина, расположенными непоследовательно, по причине ферментативного гидролиза и исчезновения разветвленного пептида – Неточное вырезание из геля может приводить к ошибкам (введение небольшого количества Ub из других дорожек) – Невозможно детектировать разветвленные цепи кроме тех, в которых ветви расположены на соседних лизинах (K6/K11, K11/K27 и K27/K29) – Не удается определить K48/K63-цепи из-за R54А – Адсорбция образцов из-за высокой гидрофобности разветвленных K48/63- и K63-цепей – Метод фокусируется на составе связей и не позволяет определить архитектуру высокого порядка: для регистрации остальных разветвленных полимеров (кроме K48/K63) необходимо ввести еще больше мутаций, что приведет к увеличению размеров полимера и затруднит идентификацию [21, 22]	[9, 23–26]
UbiCRest Варианты: 1) обработка деубиквитиназой Trabid 2) предварительная иммунопреципитация cIAP1, затем добавление деубиквитиназ: сконструированных K48-специфичной OTUB1* и K63-специфичной AMSH*, а также pan-DUB Usp2cc, затем МС	– Позволяет выяснять порядок образования связей на цепях – Гидролиз связей K29 доказал их присутствие – Обнаружено, что K63-цепи расположены проксимальнее к cIAP1, и на их основе происходит конъюгация с K11- и K48-цепями – Обнаружено, что K48-цепи – самые дистальные	– Требует оптимизации эксперимента, экспертной оценки специалиста, позволяет обнаружить ограниченное количество вариантов цепей [27] – Ограничение способа заключается в том, что полимеры могут изменить структуру после добавления деубиквитиназ [19]	[23, 28, 29]
Иммунопреципитация Варианты: 1) + PRM 2) иммунопреципитация белка cIAP1, активированного LCL-161, далее ЖХ-МС, затем PRM 3) + K11/K48-специфичное антитело + убиквитин-специфичная пептидаза 2 (USP2) 4) поверхностный плазмонный резонанс (SPR) + K11/K48 биспецифичное антитело, иммуноблоттинг + убиквитинлигаза APC/C, убиквитин-конъюгирующие ферменты UBE2C, UBE2S	– Подтверждено, что K48-цепи собирает CRL2VHL – Выявлено, что к cIAP1 прикреплены K11-, K48- и K63-цепи – Показано, что после ингибирования протеасомы белок C9orf72 модифицируется K11/K48-цепями – Обнаружено, что после добавления деубиквитиназы K11/K48-цепи отщепляются – Антитела продемонстрировали более высокую аффинность к разветвленным K11/K48-цепям, чем к гомотипическим – Выяснено, что APC/C собирает K11/K48-цепи in vitro	– Низкий выход и кросс-специфичность антител – Получаются смеси убиквитина и конъюгатов убиквитина, с низкой эффективностью разделяемые обращенно-фазовой ЖХ	[28–32]
Ub-clipping (масс-спектрометрия “middle-down”) Варианты: 1) + TUBE, потом + протеаза Lbpro, затем растворение трипсином в геле, далее AQUA МС 2) синтез стандартов K48/K63, K11/K63 и K11/K48 3) обработка трипсином, МС, диссоциация при переносе электронов (electron transfer dissociation (ETD))	– Упрощенное определение структуры за счет C-концевого мотива GG – Подтверждено, что убиквитинлигаза TRIP12 рекрутируется к белку BRD4 посредством комплекса CRL2VHL и добавляет гетеротипические K29-связи, что способствует ветвлению при помощи K48-связей с участием CRL2VHL – Обнаружено, что K11- и K48-цепи конъюгированы с K63-связанными цепями (самыми проксимальными), и разветвленные цепи включают связи K11/K48, K48/K63 и, возможно, K11/K63 – Возможно определить ветвление цепей – Выяснено, что убиквитинлигаза NleL создает K6/K48-разветвления, убиквитин-конъюгирующие ферменты UBE2S и UBE2R1 образуют K11/K48-ветви, убиквитин-конъюгирующие ферменты UBE2N/UBE2V2 с UBE2R1 формируют K48/K63-бифуркации	Не позволяет определить разветвленный Ub [1]	[26–29, 33]
Масс-спектрометрия “top-down” ЖХ-МС, ETD, ProSight Lite, кислотный гидролиз при помощи микроволн (microwave-supported acid cleavage)	Возможно точное определение архитектуры разветвленных цепей	Требуется оптимизация метода [34]	[26, 35]
Изотопно-разрешенная масс-спектрометрия пептидов Этапы: 1) добавление субстратов diUb, затем убиквитинирование K48-цепями, нанесение на денатурирующий гель-электрофорез, далее визуализация 2) мечение проксимального убиквитина 15N и дистального 14N, убиквитинирование, SDS-PAGE, вырезание из геля, обработка трипсином, МС	– Не требует флуоресцентных меток или замен в ферментах или субстратах, не вызывает возмущений в биологической системе во время эксперимента – Позволяет определить, как синтезируются цепи и с какой скоростью – Выявлено, что предпочтительный субстрат для E2-25K – цепи K63-diUb – Выяснено, что предпочтительнее образуются разветвленные K48/K63-цепи, смешанные K29/K48-цепи и одинаковые количества разветвленных и смешанных K27/K48-цепей	Невозможно разделить смешанные или разветвленные цепи	[1]
UbiChEM-MS – 1-й вариант Этапы: 1) + TUBE/NZF1, минимальный трипсинолиз, обращенно-фазовая ЖХ, МС 2) + ингибитор протеасомы MG132,+ тандемные убиквитин-связывающие домены (TUBE) 3) + ингибитор протеасомы MG132,+ белок NZF1 4) ETD 5) UbiCRest, + деубиквитиназа TRABID, + деубиквитиназа OTUB1, + деубиквитиназа USP15, WB	– Позволяет обнаруживать цепи, которые не идентифицируются масс-спектрометрией “bottom-up”, и отслеживать их динамику – Возможна идентификация ветвления эндогенных цепей – Разделяет линейные и разветвленные цепи – Использует DUB с разной селективностью для определения архитектуры цепей – Добавление TUBE позволяет выделить цепи с высокой молекулярной массой. Выяснено, что 57% of Ub1–74 существует в виде monoUb, 41% – GGUb1–74, 2% – 2×GGUb1–74 – Разветвленные цепи накапливаются, а значит, участвуют в протеасомной деградации – Выяснено, что цепи, обогащенные NZF-доменом, не участвуют в протеасомной деградации – Выявлены остатки Gly-Gly на K29- и K48-цепях – Обнаружено, что NZF1-обогащенные цепи содержат K29- и K48-связи	–	[36]
UbiChEM-MS – 2-й вариант + связь-специфичные антитела к K11, WB, минимальный трипсинолиз, масс-спектрометрия “middle-down” высокого разрешения, ETD- фрагментация	– Показано, что в асинхронно растущих клетках HEK293 содержится 72–78% Ub1–74, 21–26% GGUb1–74, ~1% 2×GGUb1–74 – Обнаружено, что разветвленные цепи накапливаются после остановки митоза – Выявлено, что цепи K11/K48 образуются циклозависимо	–	[2]
Микроскопический термофорез	– Показано, что UCH37(C88S)–RPN13C имеет самую высокую аффинность к [Ub]2–6,48Ub	Невозможно измерить белок-белковые взаимодействия [37]	[38]
ЖХ, тандемная масс-спектрометрия	Возможно прямое и эффективное определение конъюгатов убиквитина и убиквитиновых цепей	Возможны “изобарные” интерференции, “эффект супрессии иона” [39]	[30]
Мутанты Ub Варианты: 1) мутанты Ub (K11R), ubiK11, масс-спектрометрия 2) мутанты K48R, R42A, + белок Ubc1	– Выявлено, что в присутствии мутантных форм убиквитинирование киназы Nek2A с помощью Ube2S не происходит – Обнаружено, что убиквитин-конъюгирующий фермент Ube2S образует разветвленные цепи – Показано, что APC/C прикрепляет связи K11, K48 и K63 к Nek2A – Установлено, что UBA-домен Ubc1 связывается с дистальным фрагментом K63-Ub2, чтобы совместить UBC-домен с проксимальным Ub, тем самым способствуя образованию разветвленных цепей K48/K63	Применение ограничено системами in vitro [3]	[20, 40]
Добавление GST-слитных белков к флуоресцентно-меченым K48- и K63-цепям, SDS-PAGE, флуоресцентное сканирование	Показано, что K63-цепи связываются сильнее с UBA-доменом Ubc1	Фотообесцвечивание и аутофлуоресценция	[4]

Примечание: UbiCRest – рестрикция убиквитиновых цепей (Ubiquitin Chain Restriction); UbiChEM-MS – масс-спектрометрия “middle-down”-обогащения убиквитиновых цепей (Ubiquitin Chain Enrichment Middle-down Mass Spectrometry).

 

3. ФУНКЦИИ УБИКВИТИНОВЫХ ЦЕПЕЙ

3.1. K6-цепи

Известно, что цепи K6 (рис. 5) регулируют митофагию [28, 41–43].

 

Рис. 5. Кристаллическая структура K6-связанного диубиквитина как пример гомотипических цепей K6 (PDB: 2XK5). Показана изопептидная связь между остатком K6 проксимального убиквитина и C-концом аксиального.

 

Интересно, что на лишенных природного убиквитина клетках U2OS, в которые был введен экзогенный убиквитин, было показано, что у популяций клеток с заменой на аргинин K6 или K63 наблюдается задержка митофагии. Кроме того, методом протеомики AQUA рассчитано, что во время деполяризации митохондрий происходит шестикратное увеличение содержания K6-, K11-, K48- и K63-связанных полиубиквитинов, образованных при участии убиквитинлигазы Parkin. Деубиквитиназа USP30 избирательно удаляет цепи K6 и K11 с белков внешней мембраны митохондрий. Другой аналогичный фермент, USP8, удаляет полиубиквитины, связанные через K6, с Parkin, и препятствует аутоубиквитинированию Parkin, что говорит о роли данных форм убиквитина в контроле качества митохондрий [42]. Помимо этого выявлено, что численность K6-связанных цепей не растет при ингибировании протеасомы [44, 45]. Считается, что полимеры с данным типом связи участвуют в репарации ДНК, осуществляемой при помощи фермента E3 BRCA1–BARD1. Под воздействием УФ-лучей содержание K6- и K33-связанных цепей возрастает [46].

3.2. K11-цепи

 

Рис. 6. Кристаллическая структура K11-связанного диубиквитина как пример гомотипических цепей K11 (PDB: 2MBQ). Показана изопептидная связь между остатком K11 аксиального убиквитина и C-концом проксимального.

 

Цепи K11 (рис. 6) способствуют протеасомному гидролизу субстратов и завершению митоза [23, 47]. Так, количество подобных полиубиквитинов возрастает во время деятельности убиквитинлигазы APC/C в течение митоза [48]. Также цепи K11 регулируют прогрессию клеточного цикла, способствуя деградации его медиаторов [49]. K11-цепи не только регулируют прохождение клеточного цикла, но и участвуют в клеточном ответе на гипоксию [47]. Функция данных форм во врожденном иммунитете иллюстрируется деградацией факторов, ответственных за это явление [50]. Так, белок STING под действием присоединенных K11-цепей продолжает функционировать в клетке [50]. После этого запускается активация интерферонов I типа и провоспалительных цитокинов [51]. Считается, что убиквитинлигаза RNF26, прикрепляющая к субстратам K11-полиубиквитины, регулирует метаболизм интерферонов I типа, и что данный процесс протекает времязависимо [50]. Кроме того, известно, что K11- и K48-формы, модифицирующие белок Beclin-1, регулируют протеолиз [52]. Более того, убиквитинирование данного белка K11-цепями противодействует аутофагии и способствует реакции интерферонов I типа после гидролиза белка Beclin-1.

3.3. K27-цепи

 

Рис. 7. Кристаллическая структура K27-связанного диубиквитина (PDB: 5J8P) как пример гомотипических цепей K27. Показаны остаток K27 аксиального убиквитина и C-конец проксимального.

 

Методом масс-спектрометрии с множественным мониторингом реакций обнаружено, что K27-связанные конъюгаты (рис. 7) присоединяются к гистону H2A, и что данная разновидность цепей преобладает на хроматине во время повреждения ДНК [47, 53].

Благодаря гомотипическим цепям K27 к месту повреждения ДНК направляются такие белки репарации, как 53BP1, Rap80, RNF169 и RNF168 [53]. Аналогично отсутствие K27-соединенных полиубиквитинов на гистонах H2A и H2A.X препятствует ответу на повреждение ДНК, поскольку его медиаторы (53BP1, Rap80, RNF168 и RNF169) не получают убиквитиновый сигнал для начала ответной реакции [53]. Кроме того, убиквитинирование TRIM23 вышеупомянутыми цепями приводит к повышению активности TBK1 и, в свою очередь, к фосфорилированию p62 и аутофагии при появлении в клетке вирусных ДНК и РНК [54]. Любопытно, что аналогичный фермент TRIM26 тоже модифицируется вышеуказанными цепями при запуске сигнального пути RLR и после фосфорилирования данной убиквитинлигазы при помощи TBK1 [50]. Впоследствии белок NEMO связывается с K27-полимерами на убиквитинлигазе TRIM26, что повышает экспрессию провоспалительных цитокинов, интерферонов I типа и интерферон-стимулированных генов (ISGs) [5]. Опубликованы данные об участии подобных полимеров в иммунном ответе на экзогенную ДНК микроорганизмов [55]. Так, STING подвергается убиквитинированию K27-связанными формами при помощи белка AMFR, что повышает активность серин-треониновой протеинкиназы TBK1, что, в свою очередь, дает возможность фактору транскрипции IRF-3 фосфорилироваться и запустить экспрессию интерферонов I типа [55]. Появились сообщения и о том, что присоединение K27-цепей к NEMO активирует каскад RLR, транскрипционный фактор NF-κB и IRF3 [6]. Предполагается, что белки, ответственные за врожденный иммунитет, такие как Rhbdd3, прикрепляются к полиубиквитинам на белке NEMO [7]. После этого K27-полимеры образуются на Rhbdd3, и к ним приближается деубиквитиназа A20, которая расщепляет цепи K63 на NEMO, что ослабляет сигналинг NF-κB [7]. Таким образом, Rhbdd3 регулирует деятельность дендритных клеток и препятствует развитию Th17-клеточного колита на мышиной модели [8]. Обнаружено, что благодаря убиквитинлигазе TRIM40 происходит убиквитинирование цепями K27 и K48 рецептора опознавания паттерна RIG-I и RIG-I-подобного рецептора MDA5, что приводит к протеолизу данных субстратов [56]. Также выяснено, что к белку MAVS присоединяются цепи K27 при участии убиквитинлигазы TRIM21 [57, 58]. Аналогичную функцию выполняет E3-фермент MARCH8 [59]. Сходным действием обладает и убиквитинлигаза RNF34, убиквитинирующая MAVS цепями K27 и K29 [60]. Известно, что K27-полиубиквитины задействованы в реакции иммунной системы на ДНК-вирусы или бактерии рода Listeria [61, 62]. Описано и совместное действие гомотипических цепей в клетке. Так, предполагается, что K27- и K63-формы запускают каскад TAK1 [10]. Установлено, что K27- и K33-цепи участвуют в реакции на стресс [63].

3.4. K29-цепи

Цепи K29 (рис. 8) участвуют в протеолитической деградации [23].

 

Рис. 8. Кристаллическая структура K29-связанного диубиквитина (PDB: 4S22) как пример гомотипических цепей K29. Показаны остаток K29 аксиального убиквитина и C-конец проксимального.

 

Выявлено, что гомотипические цепи K29 представляют собой наиболее многочисленный вид полимеров с нестандартной архитектурой [64–66]. Например, есть данные о том, что убиквитинлигаза Smurf1 присоединяет гомотипические K29-цепи к белку Axin [11]. Подобная посттрансляционная модификация препятствует связыванию Axin с корецепторами Wnt LRP5 и LRP6 (LRP5/6), что нарушает присоединение фосфатов к LRP6 и способствует подавлению каскада Wnt/β-катенин [67]. Кроме того, известно, что деубиквитиназа Trabid, ассоциированная с сигналингом выше, отщепляет полиубиквитины c K29- и K33-связями [65, 68–71]. Считается, что данная E3 осуществляет взаимодействие и отщепляет убиквитины с APC [72]. Синтез гомотипических цепей K29 и K48 осуществляется при помощи фермента E3 UBE3c/Hul5 [73]. Отщепление первых цепей происходит благодаря домену OTU деубиквитиназы TRABID [74]. Имеются данные о том, что убиквитинлигаза TRIP12 в одиночку формирует K29-связанные убиквитиновые цепи [28]. Это было подтверждено методом замены лизина на аргинин в мутантных формах убиквитина [28].

3.5. K33-цепи

Поскольку данные цепи (рис. 9) не накапливаются при нарушении работы протеасомы, считается, что они влияют на независимую от протеолиза деятельность клетки [25].

 

Рис. 9. Кристаллическая структура K33-связанного диубиквитина (PDB: 4XYZ) как пример гомотипических цепей K33. Показана изопептидная связь между остатком K33 аксиального убиквитина и C-концом проксимального.

 

Синтез K11- и K33-цепей происходит при участии убиквитинлигазы AREL1 [64, 65]. Предполагается, что убиквитинирование данным ферментом белков, способствующих программируемой клеточной гибели (SMAC, HtrA2 и ARTS), предотвращает данный процесс [75]. Обнаружено, что K33-полиубиквитины ингибируют работу Т-клеточного рецептора (TCR) и AMPK-родственных протеинкиназ [12, 13]. Также имеются сведения об участии подобных форм в транспорте белков после аппарата Гольджи [76]. Ранее считалось, что K63-цепи принимают участие в секреции и эндоцитозе, способствуя сортировке белков мембраны [47]. Теперь выяснено, что фермент E3 Cul3–KLHL20 добавляет K33-формы к коронину-7 (Crn7) [47]. Полученный конъюгат взаимодействует с белком Eps15, что направляет его в транс-Гольджи на связывание с F-актином и подавляет его деполимеризацию [47].

3.6. K48-цепи

Считается, что чаще всего встречается именно этот тип цепей (рис. 10), отвечающих за направление на деградацию белков протеасомой [23, 77].

 

Рис. 10. Кристаллическая структура K48-связанного диубиквитина (PDB: 3AUL) как пример гомотипических цепей K48. Показаны остаток K48 аксиального убиквитина и C-конец проксимального.

 

Выявлено, что K48- и K63-полиубиквитины контролируют врожденный иммунитет против вирусных инфекций [50]. Методом иммунопреципитации определено, что с белком BRD4 в присутствии PROTAC MZ1 преимущественно связываются K48-цепи [14].

Циклические формы K48-цепей образуются при участии убиквитин-конъюгирующего фермента E2-25K [78]. Несмотря на конформационные ограничения, подобные цепи могут взаимодействовать с рядом белков [78]. Выявлено, что сложнее гидролизовать деубиквитиназой циклический диубиквитин, чем линейный [78]. По-видимому, при связывании с ферментом OTUB1 у циклического диубиквитина происходит трансформация конформации в более открытую форму, и они начинают взаимодействовать не только I44-патчами, но и соседними участками [78]. Предположительно, рост злокачественных опухолей ассоциирован с транскрипционным фактором p53, к которому прикрепляются цепи K48 [63].

3.7. K63-цепи

K63-формы (рис. 11) содействуют аутофагии, митофагии и утилизации патогенов [77].

 

Рис. 11. Кристаллическая структура K63-связанного диубиквитина (PDB: 2JF5) как пример гомотипических цепей K63. Показаны остаток K63 аксиального убиквитина и C-конец проксимального.

 

Вышеупомянутые полимеры также влияют на круговорот белков, эндоцитоз, сборку сигнальных комплексов, репарацию ДНК, иммунный ответ и активность киназ [23, 49, 79–81]. Предполагается, что цепи подобного строения принимают участие в митозе, образовании мРНК, проверке правильности структуры белков и в различных каскадах [32, 82, 83]. Появились свидетельства того, что K63-полиубиквитины взаимодействуют с комплексом ESCRT0 и его составляющими, белками STAM и Hrs [15]. После разрушения структуры на обеих цепях ДНК фермент E3 RNF8, формирующий K63-полимеры на гистоне H1 и белке L3MBTL2, привлекает к месту повреждения белки репарации, такие как 53BP1 и BRCA1 [84, 85]. Таким образом, функционирование убиквитинлигаз RNF8 и RNF168 приводит к убиквитинированию K63-, K48- и K27-цепями областей хроматина с двухцепочечными разрывами ДНК [16, 17]. Выявлено, что специфичность убиквитинлигазы к связям K48 и K63 определяется типом аминокислоты на C-конце HECT-домена [86]. Отмечено, что в отличие от E3, присоединяющих K48- или K63-цепи, на C-конце убиквитинлигазы TRIP12 находится серин [28]. Обнаружено, что присоединенный валин на C-конце данной убиквитинлигазы меняет селективность на K48-цепи [28].

4. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛИУБИКВИТИНОВЫХ ЦЕПЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ВЕТВЛЕНИЯ

 

Рис. 12. Разветвленные К11/К48 (PDB: 6OQ1) (а) и К48/К63 цепи (PDB: 7NPO) (б).

 

Согласно последним данным, разветвленные цепи (рис. 12) составляют 5–20% всех убиквитиновых цепей в клетке [18, 19]. Кроме того, известно, что представленность разветвленных цепей изменяется, реагируя на различные стимулы; например, инфицирование бактериями влияет на содержание разветвленных K6/K48-цепей, образованных при участии NleL [87, 88]. Считается, что M1/K63-цепи ответственны за активацию NF-κB [32]. Разветвленные цепи K48/K63 участвуют в сигналинге NF-κB и собираются адаптерным белком TRAF6 и убиквитинлигазой HUWE1 IL-1β-зависимо [20]. Также они задействованы в каскадах апоптоза [28] и протеасомной деградации [29]. Цепи K29/K48 ускоряют PROTAC-направленную деградацию субстратов и участвуют в протеасомном гидролизе [28, 29]. Кроме того, они контролируют ЭПР-ассоциированную деградацию (ERAD) у млекопитающих и убиквитин-зависимую деградацию (Ub fusion degradation) у дрожжей [28]. Сборка данных цепей осуществляется при помощи убиквитинлигазы TRIP12 и комплекса CRL2^VHL [28]. K11/K48-цепи направляют на деградацию субстраты, участвующие в клеточном цикле, экспрессии генов и контроле качества белков, регулируют митоз (при формировании APC/C) [14, 21]. Смешанные цепи K11/K48, вероятно, регулируют репарацию двухцепочечных разрывов ДНК [22]. Выявлено, что белок C9orf72 – субстрат K11/K48-убиквитинирования [31]. Обнаружено, что деубиквитиназа UCH37 предпочтительнее связывается с разветвленными K6/K48-цепями, чем с цепями K11/K48 или K48/K63 [38]. Более того, выяснено, что смешанные цепи Ub–⁶Ub–⁴⁸Ub и Ub–⁴⁸Ub–⁶Ub почти не деубиквитинируются [38]. Цепи K48/K63 участвуют в ответе на введение IL-1β [22]. K11/K63-цепи, вероятно, участвуют в интернализации рецепторов [36]. Кроме того, считается, что образование смешанных цепей происходит во время эндоцитоза или иммунного ответа [20]. Сообщалось, что разветвленные цепи модифицируют эффекты, вызванные гомотипическими цепями [89].

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Убиквитинирование является одной из наиболее сложных для идентификации и изучения посттрансляционной модификаций из-за сложной структуры – образования цепей различной длины и типов связей, а также динамической регуляции. Конформация убиквитиновой цепи играет важнейшую роль в регуляции функции субстратов в различных физиологических и патологических клеточных процессах. Для идентификации убиквитинирования белка было разработано множество экспериментальных и вычислительных подходов, однако на настоящий момент экспериментальные методы – единственный способ получить представление об архитектуре убиквитиновых цепей. Вместе с тем ни один из существующих методов не может однозначно идентифицировать топологию и длину разветвленных цепей. Таким образом, для понимания архитектуры убиквитиновой цепи, ее точной структуры, а также физиологической функции крайне необходимо развитие новых методологий.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 21-74-10154).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K. A. Ivanova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: anna.kudriaeva@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. A. Belogurov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: alexey.belogurov.jr@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. A. Kudriaeva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: anna.kudriaeva@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

References

Supplementary files