Стресс у крапчатых сусликов (Spermophilus Suslicus Güld. 1770) при переселении из природной популяции в условия полувольного содержания

Полный текст

Численность крапчатого суслика (Spermophilus suslicus Güldenstädt 1770, Sciuridae, Rodentia) неуклонно сокращается. Этот процесс, начавшийся во второй половине XX века, и сегодня продолжается на большей части ареала вида (Сапельников, Сапельникова, 2021) как на территории России (Титов, 2001; Шилова и др., 2010; Шекарова, Савинецкая, 2019; Брандлер, 2021 и др.), так и за ее пределами (Загороднюк и др., 2005; Gondek, 2004; Русин, 2013; Ziółek et al., 2017; Шокало, 2019; Abramchuk et al., 2021 и др.). Среди причин вымирания крапчатого суслика назывались: повсеместная распашка лугов, закраин полей, переход к стойловому содержанию крупного рогатого скота на фермах, отказ от содержания коров в домашних хозяйствах, зарастание покосов, палы сухой травы на неиспользуемых землях (Лобков, 2006; Шокало, 2019; Сапельников, Сапельникова, 2021). Все это ведет к изменению качества свойственных виду местообитаний (Шилова и др., 2010). Немалое негативное значение могло сыграть использование ядохимикатов, поскольку десятилетиями вид считался вредителем сельского хозяйства (Шокало, 2019). Ныне крапчатый суслик занесен в Красный список МСОП (IUCN Red List (NT), Appendix II and Resolution No. 6 of the Bern Convention), в Красные книги государств и государственных административных областей.

В нашей стране меры охраны, принимаемые в традиционном формате, по-видимому, не способны остановить катастрофическое падение численности вида. Помимо разведения крапчатого суслика в питомниках и зоопарках, эффективной мерой для России может стать создание искусственных популяций сусликов в непосредственной близости от населенных пунктов, вблизи людей и под их защитой, в местах с низким прессом хищников (Сапельников, Сапельникова, 2021) с последующим расселением в естественные биотопы. Основанием для такого пути сохранения вида может быть предполагаемая способность крапчатого суслика легко преодолевать стрессовые ситуации, быстро адаптироваться к новым условиям, в том числе к соседству с человеком. Крапчатый суслик легко приручается (Сапельников, Сапельникова, 2021). В недавно проведенном болгарскими коллегами исследовании было показaно, что уровень стрессированности переселенных на новое место близких к крапчатому европейских сусликов (S. citellus) начал неуклонно снижаться сразу после выпуска и в течение первого месяца стал ниже, чем у сусликов в донорской популяции (Kachamakova et al., 2021).

Переселение представителей угрожаемых видов на новое место для восстановления популяций – общепринятая в мире природоохранная практика – неразрывно связана со стрессом. Манипуляции, связанные с отловом и переселением, в том числе транспортировка, как правило, вызывают острый стресс, тогда как незнакомая среда и социальное окружение на новом месте, разрыв родственных и социальных связей потенциально могут вызвать хронический стресс, определяя в конечном итоге успех или неуспех переселения (Letty et al., 2007; Dickens et al., 2010). Поэтому при планировании и проведении переселения животных на новое место необходимо, по возможности, оценивать уровень их стрессированности (Kachamakova et al., 2021).

В статье описан проведенный нами эксперимент по переселению крапчатых сусликов из природной популяции в условия полувольного содержания в специально построенной в природной обстановке вольере, защищающей зверьков от наземных и пернатых хищников в организуемом на базе ФГБУ “Государственный природный заповедник “Воронинский” Центре сохранения и реинтродукции крапчатого суслика (Бурканова и др., 2024). Переселение в вольеру нацелено на создание устойчивой полувольной популяции для дальнейшего выпуска сусликов в природу. Для этого необходимо оценить способность вида адаптироваться к новым условиям – задача, решению которой посвящена статья. В частности, мы попытались оценить, насколько легко крапчатый суслик способен преодолеть стресс, связанный с переселением в ограниченную по площади вольеру. Эта задача решалась нами путем сравнения состояния животных сразу после отлова в природе, после транспортировки и передержки в индивидуальных отсадниках до выпуска в вольеру (первые сутки), через трое суток после выпуска и через месяц перед залеганием в спячку. В качестве характеристик состояния животных использовали массу тела и показатель стрессированности зверька – уровень иммунореактивных к антителам на кортизол метаболитов глюкокортикоидов (ИМГ) в фекалиях сусликов, собранных на каждом из означенных выше этапов исследования. Помимо этого, мы оценили успешность зимовки крапчатых сусликов в новых условиях.

Кортизол – глюкокортикоидный гормон стресса, вырабатываемый корой надпочечников. Из двух глюкокортикоидных гормонов (кортизол и кортикостерон) именно он доминирует у наземных беличьих рода Spermopilus (Boswell et al., 1994; Mateo, Cavigelli, 2005; Mateo, 2008; Delehanty, Boonstra, 2012 и др.), включая и близкого к крапчатому европейского суслика (Aschauer et al., 2006; Brenner et al., 2017; Kachamakova et al., 2021). Для оценки уровня стрессированности сусликов мы использовали не сыворотку крови, в которой присутствует нативный кортизол, а фекалии, где глюкокортикоид представлен в основном продуктами его метаболизма (Möstl, Palme, 2002; Palme et al., 2005). Поэтому сопутствующей задачей исследования была валидация применимости иммуноферментного анализа с использованием антител, специфичных к кортизолу, в коммерчески доступной тест-системе. Необходимость валидации методики обусловлена в том числе и видовыми различиями в выделении глюкокортикоидов в ответ на одни и те же стрессоры. Различия наблюдаются даже у близкородственных видов (Navarro-Castilla et al., 2021).

В последние десятилетия анализ содержания метаболитов глюкокортикоидов в фекалиях млекопитающих получил широкое распространение, поскольку сбор образцов для анализа исключает травмирование животного при отлове и манипуляциях с ним (Герлинская и др., 1993; Möstl, Palme, 2002; Touma, Palme, 2005; Palme, 2019 и др.).

Другое преимущество неинвазивного подхода обусловлено тем, что в фекалиях представлен сглаженный уровень метаболизированных глюкокортикоидов, который меньше зависит от краткосрочных стрессирующих воздействий, что предпочтительно при исследовании долгосрочных процессов (Touma, Palme, 2005; Колосова и др., 2008).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Донорская популяция. Источником для переселения послужила изолированная (далее донорская) популяция крапчатого суслика на окраине города Липецка (52.6074° с. ш., 39.4408° в. д.), обитающая на площади около 60 га. Хотя мы не располагаем количественными оценками плотности донорской популяции, ее безусловно можно оценить как высокую. В поле зрения единовременно можно было наблюдать до 5–7 сусликов. Достаточно сказать, что при первом отлове в донорском поселении было выставлено 50 ловушек на площади около 15 га, и всего за 7 часов было поймано 45 сусликов. Вторая особенность донорской популяции – высокая рекреационная нагрузка: традиционно эту территорию регулярно посещает большое количество людей (Пиванова, Шубина, 2011).

Отлов и перевозка. Сусликов в донорском поселении (затем и в вольере) отлавливали цилиндрическими “Донскими” ловушками из металлической сетки (Лобков, 1999; Павлова, 1951), которые устанавливали в нору после ухода в нее суслика, а также сетчатыми ловушками конструкции Щипанова (1987) около нор на тропах с приманкой из семян подсолнечника. Пойманного суслика в течение 15 мин пересаживали в клетку для сбора фекалий (см. ниже). Суслики на территории отловов не боятся людей. Поэтому постоянные проверки ловушек не влияли отрицательно на активность зверьков. После сбора образцов фекалий сусликов помещали в индивидуальные 10-литровые отсадники из пластика с опилками и кормом, закрытые крышками из металлической сетки. В этих отсадниках животных перевозили и содержали до выпуска в вольеру. Отлов проводили дважды с 9 ч до 16 ч. Первый раз 04.07.2023 было отловлено 25 сусликов. Дополнительно 06 и 07.07.2023 для переселения были отловлены еще 15 сусликов (табл. 1). Время переселения (начало июля) выбрано с учетом особенностей годового цикла крапчатых сусликов: в это время большинство молодых зверьков, вышедших на поверхность в мае-июне, уже самостоятельны и расселяются или уже расселились (Titov, 2003). Среди молодых зверьков выбирали особей массой тела не менее 140 г, что исключало из выборки детенышей, недавно вышедших на поверхность. Учитывая, что залегание в спячку происходит в августе (Пиванова, Шубина, 2011), у переселенных зверьков оставалось 1.5–2 месяца для того, чтобы освоиться на новом месте и подготовиться к спячке. Кроме того, поскольку для крапчатого суслика характерна полигиния (Смирин, 2008), соотношение полов (самки: самцы) среди зверьков, выбранных для переселения, было сдвинуто в сторону самок (24: 16, табл. 1). Все отловленные суслики были перевезены в ФГБУ “Государственный заповедник “Воронинский” (Тамбовская обл., РФ, 52.3675° с. ш., 42.6052° в. д.). Транспортировка зверьков проводилась в прохладное время суток 04.07.2023 с 18 до 24 часов и 08.07.2023 с 4 до 9 часов.

Индивидуальное мечение. Сусликов при отлове метили магнитными чипами с индивидуальным номером: Animal ID Стандарт ISO: 11784/11785 1.25 × 7 мм (молодые суслики), 1.4 × 8 мм (взрослые суслики). Чипы вводили подкожно в область холки, место прокола заклеивали медицинским клеем БФ-6. Для визуального распознавания сусликов метили красителем для шерсти – урзолом черным.

Условия жизни переселенных сусликов. На территории заповедника на участке суходольного луга, где еще в конце XX века по свидетельствам местных жителей обитали крапчатые суслики, была подготовлена вольера размером 40 х 40 м, огороженная металлической сеткой с ячеей 2.5 × 2.5 см. Высота сетки над землей 2 м; сетка была закопана в землю на глубину 1.5 м. Сверху вольера по всей площади была накрыта нейлоновой сетью для защиты от пернатых хищников. Площадь вольеры была размечена на 64 квадрата (5 × 5 м) для удобства наблюдения (рис. 1).

 

Рис. 1. Вольера в заповеднике “Воронинский” (фото С. В. Павловой).

 

В центре каждого квадрата предварительно под углом 30°–45° к поверхности были пробурены норы диаметром 6 см и глубиной 80–90 см. Для европейского суслика было показано, что наклонные искусственные норы – важный фактор успеха переселения (Gedeon et al., 2012). Перед выпуском сусликов трава в вольере была скошена на высоту 3–4 см. В дальнейшем до залегания сусликов в спячку покос проводили 3 раза при достижении высоты травостоя 15–20 см ручной газонокосилкой на высоту 5 см. Как было показано, поддержание низкого травостоя при помощи кошения или выпаса скота способствовало успешному закреплению европейских сусликов в местах переселения (Matějů et al., 2012; Koshev et al., 2019). С момента заселения и до залегания в спячку сусликам давали дополнительную подкормку (яблоки, морковь, семечки подсолнечника, сухари), регулярно удаляя недоеденное.

На следующее утро после транспортировки (05.07.2024 с 11 до 12 ч) 20 сусликов из первой серии отлова (12 самцов и 8 самок) были выпущены в вольеру. Утренние часы, до пика дневной активности – наиболее подходящее время для выпуска, как было показано для европейского суслика (Gedeon et al., 2011). Пять сусликов (3 самца и 2 самки) были оставлены в индивидуальных клетках из металлической сетки для валидации методики оценки ИМГ в фекалиях. Эти суслики были выпущены в вольеру утром 09.07.23, то есть на пятые сутки после перевозки и завершения проведения с ними необходимых манипуляций (см. ниже). Восьмого июля утром в вольеру выпущены 15 дополнительно отловленных сусликов. Всего в июле 2023 г. в вольеру было переселено 40 сусликов (табл. 1).

 

Таблица 1. Половозрастной состав сусликов, переселенных из донорской популяции в вольеру на территории Государственного природного заповедника “Воронинский”

Половозрастная  категория	Отловлено
	Всего для переселения в 2023 г.	Первый отлов		Дополнительно
		Выпущено в вольеру сразу	Взято для валидации
Самцы взрослые	6	5	0	1
Самки взрослые	13	5	0	8
Самцы молодые	10	7	3	0
Самки молодые	11	3	2	6
Итого	40	20	5	15

 

Плотность популяции в вольере, таким образом, составила 250 особей на 1 га. Это высокая плотность, однако для крапчатого суслика, как в южных, так и в северных частях его ареала, показано, что местами плотность достигала в прошлом 200– 300 и даже более особей на 1 гектар (Лобков, 1999; Чабовский и др., 2005; Бабицкий и др., 2006).

Сбор и хранение образцов фекалий. Образцы фекалий от каждого суслика после отлова в донорском поселении и вольере собирали, пересадив суслика максимально быстро в клетку (10 × 10 × 33 см) с сетчатым полом, под который подкладывали чистый лист флизелина для предупреждения намокания фекалий при попадании на них мочи. Сбор образцов продолжался в течение двух часов после попадания в ловушку. Двухчасовой лимит при сборе образцов должен был исключить эффект кратковременного стресса, вызванного манипуляциями с животным. Этот отрезок времени в 4 раза короче времени до статистически значимого превышения концентрации ИМГ в фекалиях после стрессового воздействия у рыжей полевки (Роговин, Найденко, 2010), в 7 раз короче такового у большой песчанки (Колосова и др., 2008). Двухчасовой период, в течение которого мы собирали образцы, также существенно короче времени прохождения пищи через желудочно-кишечный тракт у таких филогенетически удаленных, полностью или частично растительноядных видов, как кролик (3.8 ч), морская свинка (4.2 ч), серая крыса (7.2 ч), золотистый хомячок (3.3 ч) (Sakaguchi et al., 1987).

Для оценки динамики концентрации ИМГ образцы фекалий собирали четыре раза и только у сусликов из первой серии отлова: 1 – после отлова в донорской популяции, для характеристики фонового уровня стрессированности (04.07.23); 2 – после перевозки непосредственно перед выпуском (05.07.23); 3 – после отлова в вольере через трое суток после выпуска в нее и до выпуска второй партии сусликов (08.07.23); 4 – после отлова в вольере через месяц после выпуска, перед залеганием в спячку. На первых двух этапах пробы собирали у всех 25 сусликов, отловленных 04.07.23 (табл. 1). Сюда вошли и 5 молодых сусликов, которых использовали для валидации методики оценки уровня ИМГ (см. ниже). Эти 5 молодых отсутствовали среди отловленных через 3 суток после выпуска, поскольку были выпущены только 09.07. К сожалению, нам не удалось отлавливать всех сусликов на каждом из двух этапов после выпуска 04.07.23. Через трое суток было отловлено 17 сусликов, через месяц перед спячкой – 10 сусликов. На этом последнем этапе большинство взрослых уже залегли в спячку (отловлен только один взрослый самец).

Пробы фекалий помещали в индивидуальные бумажные пакетики и клали в проветриваемое сухое, защищенное от солнца место (дневные температуры в этот период составляли 27–30°C, а ночные до 15– 22°C). Сразу после возвращения в лабораторию пробы досушивали в течение 12– 16 часов при температуре +60°C в термостате. Пробы хранили при –20°C до дальнейшего анализа.

Сусликов взвешивали три раза с точностью до 1 г: 1 – при отлове в донорской популяции, 2 – через трое суток после выпуска в вольеру, 3 – через месяц после выпуска перед залеганием в спячку. На следующий день после отлова и переезда взвешивание не проводили, чтобы дополнительно не травмировать животных.

Валидация методики оценки уровня стрессированности сусликов по содержанию ИМГ в фекалиях. Наиболее точным и часто используемым методом проверки применимости коммерческих тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА), созданных для оценки содержания нативных глюкокортикоидов (кортизола или кортикостерона), является введение тестируемым животным адренокортикотропного гормона (АКТГ; Goymann et al., 1999; Touma, Palme, 2005; Sheriff et al., 2010; Роговин, Найденко, 2010; Palme, 2019). АКТГ вырабатывается передней долей гипофиза (в ответ на продукцию под влиянием стрессоров кортиколиберина в мозге) и по кровяному руслу направляется в кору надпочечников, где стимулирует выработку глюкокортикоидов. Если после инъекции АКТГ в образцах фекалий повысится уровень ИМГ, детектируемый тест-системой ИФА, то мы вправе считать, что тест-система ИФА пригодна для измерения уровня ИМГ и может быть использована для индикации уровня стрессированности у данного вида.

Пять молодых сусликов-сеголетков (2 самки и 3 самца) были отобраны для физиологической валидации метода. Этих зверьков после отлова в донорской популяции и перевозки не выпустили в общую вольеру 05.07.2023, а продолжали содержать в индивидуальных клетках из сетки. Образцы фекалий у каждого из пяти сусликов собирали при отлове 04.07.23 в донорской популяции (описано выше), после перевозки в заповедник 05.07.2023 (11:00–12:00), а также 06.07.2023 в 08:00, 12:00, 16:00 и 20:00. В 8 часов утра 07.07.2023 каждому животному сделали инъекцию синактена – синтетического АКТГ (Synacthen, Alphasigma, Nederland) внутримышечно в дозировке 40 мкг на 100 г веса (средняя дозировка для АКТГ-теста, Palme, 2019). Продолжали собирать фекалии еще двое суток в 8, 12, 16 и 20 часов, последний сбор 09.07.2023 в 8 часов утра. В дальнейшем пробы досушивали в течение 12–16 часов в термостате при температуре +60°С и хранили при –20°С.

Экстракция ИМГ. Экстракцию иммунореактивных глюкокортикоидов из фекалий проводили по стандартной процедуре (Павлова, Найденко, 2008) с небольшими изменениями: замороженные фекалии измельчали в фарфоровой ступке пестиком, отмеряли аликвоты измельченных фекалий массой 0.1 г с точностью до 0.001 г на весах Ohaus (ScoutSPX 123) и переносили в микроцентрифужную пробирку 1.5 мл для дальнейшей экстракции. Далее в каждую пробирку добавляли 0.9 мл 80% метанола (наиболее пригодная концентрация для экстракции метаболитов ГК у млекопитающих, Palme et al., 2013) и экстрагировали 30 мин в ротационном шейкере (BioSanBio RS-24). Затем экстракты центрифугировали 10 мин при 1500 g (Eppendorf, Centrifuge 5424) и 400 мкл полученного супернатанта переносили в чистые пробирки. Поскольку метанол при проведении ИФА может влиять на аффинность антител и снижать чувствительность анализа, для снижения конечной концентрации метанола в пробе к полученному экстракту добавляли 400 мкл дистиллированной воды (Павлова, Найденко, 2008; Pribbenow et al., 2014). Экстракты хранили при –20°C до проведения ИФА.

Иммуноферментный анализ. Концентрацию ИМГ в фекалиях оценивали при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Мы использовали готовые коммерческие наборы фирмы ХЕМА (г. Москва) для определения кортизола в сыворотке крови в соответствии с инструкцией, за одним исключением. Поскольку мы работали не с сывороткой крови, а с экстрактами фекалий в метаноле, максимальный стандарт, поставляющийся с набором реагентов (2000 нмоль/л), пересчитывали в нг/г и разбавляли 40% метанолом так, чтобы первый стандарт соответствовал 400 нг/г, следующие стандарты получали разбавлением (40% метанолом) в 2 раза, а последний стандарт содержал только спирт (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 нг/г). Конечная концентрации метанола в ячейке планшета (8%) не оказывала влияния на результат определения концентрации ИМГ. Каждое измерение в каждой пробе проводили дважды для определения коэффициента вариации, а для дальнейшей обработки принимали среднее значение. При величине коэффициента вариации более 5% для данного образца проводили повторные измерения. Коэффициент вариации составил в среднем 2.2.

Статистический анализ. Анализ результатов проведен с использованием пакета статистических программ Statistica 12.0. (Stat. Soft. Inc.).

Статистические оценки при валидации методики неинвазивной оценки уровня стрессированности по концентрации ИМГ в фекалиях сусликов проведены с помощью дисперсионного анализа для связанных измерений (Repeated Measures ANOVA). Использовали логарифмированные показатели ИМГ; в этом случае распределения не отличались от нормальных.

Поскольку значимые различия между полами в уровне ИМГ среди взрослых и среди молодых отсутствовали на каждом из этапов исследования (тест Манна-Уитни, p > 0.05) и выборки были ограниченного размера, анализ динамики уровня ИМГ был проведен без разделения по полу сначала для всей выборки (взрослые и молодые) и затем отдельно для сравнительно многочисленной выборки молодых особей.

В анализ динамики ИМГ вошли не все собранные у сусликов пробы фекалий. Пробы с недостаточным количеством субстрата (< 0.1 г) были исключены. Недостаточные для ИФА пробы были характерны для конца сезона, когда суслики уже мало потребляли корма: 6 проб из 12 были отбракованы по этой причине на последнем этапе, и лишь одна проба – на всех предшествующих этапах. Кроме того, для семи проб анализ не получился по неясным причинам. Таким образом, в целом в статистический анализ вошло 65 проб. Размеры выборок для каждого из этапов указаны на рисунках.

Для анализа динамики массы тела и уровня ИМГ в пробах фекалий мы использовали смешанную линейную модель (Mixed General Linear Model, MGLM) с номером особи в качестве случайного фактора и фиксированного фактора “Этап” в качестве категориальной независимой переменной. В том случае, когда зависимой переменной был уровень ИМГ, переменная “Этап” включала четыре градации состояния животных: 1 – отловленных в донорской популяции перед транспортировкой (базовая характеристика); 2 – после транспортировки, непосредственно перед выпуском в вольеру; 3 – через трое суток после выпуска в вольеру и 4 – через месяц, перед залеганием в спячку. В случае, когда зависимой переменной была масса тела, модель включала три градации фиксированного фактора “Этап”, поскольку мы не взвешивали сусликов сразу после транспортировки перед выпуском. Данные по массе тела и концентрациям ИМК в фекалиях предварительно логарифмировали. Поскольку распределения логарифмов массы тела и показателя стрессированности не отличались визуально или статистически (критерий Шапиро-Уилка, Shapiro-Wilk Тest) от нормальных, использование смешанной линейной модели мы сочли оправданным. Модель позволила учесть влияние повторно отлавливаемых сусликов и отдельно фиксированного фактора “Этап”. Post hoc сравнения проведены с помощью теста Тьюки (Tukey HSD Test).

Ввиду малого размера выборок, для сравнения несвязанных данных мы использовали непараметрический тест Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test), а для сравнения связанных измерений – парный тест Вилкоксона (Wilcoxon Matched Pairs Test).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Суточный ритм. Контроль уровня ИМГ у трех самцов и двух самок, содержавшихся в индивидуальных клетках 05–07.07.2023 до инъекции АКТГ, показал отсутствие у этих особей сколько-нибудь выраженной суточной вариации уровня ИМГ (рис. 2А, 2Б).

 

Рис. 2. Динамика уровня ИМГ у пяти крапчатых сусликов, использованных для валидации методики определения уровня ИМГ в фекалиях. Временной интервал включал отлов в донорской популяции (фоновый уровень стрессированности), транспортировку, передержку в клетках в течение последующих трех суток (с 07.07.2023 по 09.07.2023) и выпуск в вольеру утром на четвертые сутки. В скобках указан порядковый номер суток. A – самцы, Б – самки. Аномально низкое значение ИМГ в пробе от самца 39m, взятой 07.07.2023 в 16 ч, показано отдельным кружком и не было включено в последующий анализ.

 

Единственное аномально низкое значение концентрации ИМГ у самца 39m в 16 ч 06.07.2023 едва ли можно интерпретировать как свидетельство проявления у него циркадного ритма адренокортикальной активности.

Валидация методики оценки стрессированности. Проверка пригодности тест-системы ИФА для оценки стрессированности крапчатых сусликов по пробам фекалий показала выраженные индивидуальные особенности ответа на АКТГ у каждой из пяти особей. Тем не менее все пять сусликов продемонстрировали отсроченный подъем концентрации ИМГ в фекалиях, пик которого наблюдался через 8–12 ч после инъекции АКТГ (рис. 2А, 2Б), в среднем через 12 ч, рис. 3), а возвращение до уровня, предшествовавшего инъекции, или близкого к нему уровню наблюдалось у одного самца через сутки после инъекции, у остальных – к концу вторых суток (рис. 2A, 2B); в среднем – через 36 ч после инъекции (рис. 3). Дисперсионный анализ для повторяющихся измерений (Repeated Мeasure ANOVA) продемонстрировал наличие статистически значимого эффекта (F_{8, 32} = 6.3, p < 0.001). Значимые отличия от пикового уровня ИМГ получены для уровня ИМГ за 12 ч до инъекции АКТГ, для уровня ИМГ непосредственно перед инъекцией и для уровня через 4 ч после инъекции АКТГ. Значимое падение уровня ИМГ зарегистрировано через 36 ч после пика (тест Тьюки: p < 0.05), когда уровень ИМГ опустился почти до базового уровня, предшествовавшего инъекции АКТГ и значимо от него не отличался (рис. 3).

 

Рис. 3. Валидация методики неинвазивной оценки уровня ИМГ в фекалиях пяти крапчатых сусликов через оценку физиологического ответа на инъекцию адренокортикотропного гормона. Инъекция АКТГ каждому зверьку была сделана через сутки после перевозки сусликов к месту выпуска в 8 утра 07.07.2023 г. Приведены средние концентрации ИМГ и их ошибки. Одинаковые латинские буквы показывают отсутствие значимых различий (p > 0.05, тест Тьюки).

 

Отметим также, что на протяжении суток до инъекции АКТГ значимые изменения в уровне ИМГ отсутствовали (F_{4, 16} = 0.7, p = 0.61). Подъем уровня ИМГ произошел именно в ответ на АКТГ и не был связан с вероятным суточным ритмом, поскольку в те же часы накануне инъекции повышения уровня ИМГ не было.

В свою очередь, транспортировка сказалась на уровне адренокортикальной активности. У каждого из трех самцов подъем уровня ИМГ был выше, чем у каждой из двух самок. У всех пяти сусликов наблюдалось значимое повышение уровня ИМГ после перевозки по сравнению с показателем фонового уровня ИМГ непосредственно после отлова (тест Вилкоксона (Wilcoxon Matched Pairs Test): Z = 2.0, N₁ = N₂ = 5, p = 0.04), а также при сравнении уровня ИМГ после перевозки с уровнем ИМГ утром следующего дня (через сутки), через 28 и 32 часа (тест Вилкоксона: Z = 2.0, N₁ = N₂ = 5, p = 0.04 во всех случаях). Повышение уровня ИМГ в результате перевозки может рассматриваться как биологический тест, также подтверждающий валидность использованной нами методики оценки стрессированности крапчатых сусликов по пробам фекалий (Palme et al., 2005; Touma, Palme, 2005).

Динамика массы тела и уровня стрессированности у переселенных сусликов. Масса тела взрослых сусликов при отлове составляла 295 ± 15 г (среднее и ошибка), а после переселения через трое суток после выпуска уменьшилась до 272 + 13 г (тест Вилкоксона: Z = 2.0; N₁ = N₂ = 7; p = 0.04). У молодых сусликов изменения массы тела не произошло (167±6 г при отлове и 168±7 г через трое суток после выпуска (тест Вилкоксона: Z = 0.4; N₁ = N₂ = = 10; p = 0.7). Анализ динамики массы тела молодых сусликов-сеголетков с помощью смешанной линейной модели с номером особи в качестве случайного фактора и этапа исследования в качестве фиксированной (категориальной зависимой) переменной показал наличие статистически значимого эффекта как номера особи (F_20,11 = 5.1, p < 0.01), так и этапа исследования (F_2,11 = 69.66, p < 0.001). Средняя масса тела сеголетков перед залеганием в спячку составила 274+16 г (N = 9) и была существенно более высокой по сравнению с этим показателем при первом отлове в донорской популяции и при отлове в вольере спустя трое суток после выпуска (тест Тьюки: p < 0.001) (рис. 4). Единственный взрослый самец, не залегший через месяц после выпуска в спячку, весил 390 г.

 

Рис 4. Масса тела сеголетков крапчатых сусликов (среднее ± ошибка), отловленных в донорской популяции (1), через трое суток после перевозки и выпуска (3) и перед залеганием в спячку (4). Результат использования смешанной линейной модели (Mixed General Linear Model) с номером особи в качестве случайного фактора (random effect) и этапа в качестве категориального фиксированного фактора (fixed effect). Одинаковые латинские буквы показывают отсутствие значимых различий (p > 0.05, тест Тьюки); n – размер выборки.

 

В донорской популяции на этапе отлова животных уровень стрессированности (ИМГ в фекалиях) был значимо выше у взрослых особей по сравнению с молодыми, однако после перевозки перед выпуском в вольеру, а также через трое суток после выпуска различий между взрослыми и молодыми не было (табл. 2).

 

Таблица 2. Сравнение уровней ИМГ (нг/г) в фекалиях взрослых и молодых крапчатых сусликов на разных этапах

Возраст, показатель	Отлов
	Фоновый уровень			После перевозки			Через трое суток после выпуска
	Среднее ± E	N	Медиана (мин. – макс.)	Среднее ± SE	N	Медиана (мин. – макс.)	Среднее ± SE	N	Медиана (мин. – макс.)
Взрослые	497.5±100.3	9	534 (65–1001)	520.4±141.0	9	285 (99–1133)	210.6±77.1	3	239 (65–328)
Молодые	277.3±37.8	14	214 (145–560)	407.6±52.3	16	373 (138–822)	222.2±42.1	8	214 (24–406)
Статистика: M-W-U test	Z = 1.76; p = 0.077			Z = 0.339; p = 0.734			Z = –0.204; p = 0.838

N – размер выборки.

 

Анализ динамики уровня ИМГ в фекалиях у переселенных сусликов с помощью смешанной линейной модели с номером особи в качестве случайного фактора и этапа исследования в качестве фиксированной переменной показал наличие статистически значимого эффекта как номера особи (F_32,29 = 2.2, p = 0.015), так и этапа (F_3,32 = 4.1, p = 0.014). Парные post hoc сравнения (тест Тьюки) показали наличие значимо меньшего уровня стрессированности уже через трое суток после перевозки и выпуска (p = 0.011) и тенденции к меньшей стрессированности перед залеганием в спячку по сравнению с этапом перевозки (p = 0.069) (рис. 5A).

Рис 5. Уровень ИМГ (среднее ± ошибка) на разных этапах эксперимента у крапчатых сусликов, изъятых из донорской популяции: А – все особи (F_{3, 32} = 4.1, p = 0.014), Б – сеголетки (F_{3, 21} = 6.3, p = 0.003). 1 – сразу после отлова (фоновый уровень стрессированности), 2 – после перевозки, 3 – через трое суток после выпуска в вольеру, 4 – перед залеганием в спячку. Приведен результат использования смешанной линейной модели (Mixed General Linear Model) с номером особи в качестве случайного фактора (random factor) и этапа в качестве категориального фиксированного фактора (fixed effect). Одинаковые латинские буквы показывают отсутствие значимых различий (p > 0.05, тест Тьюки); n – размер выборки.

 

Результат такого же анализа только для молодых особей оказался сходным, но с более высокой статистической поддержкой, и показал наличие статистически значимого эффекта как номера особи F_21,19 = 3.04, p = 0.007), так и номера этапа (F_{3, 21} = 6.3, p = 0.003). Парные post hoc сравнения продемонстрировали наличие значимо меньшего уровня стрессированности молодых сусликов как через трое суток после перевозки и выпуска (p = 0.013), так и перед залеганием сусликов в спячку (p = 0.032) по сравнению с этапом перевозки (рис. 5Б). Наиболее важно, однако, то, что уже через трое суток после перевозки и выпуска уровень стрессированности сусликов значимо не отличался от уровня в донорской популяции. Значимые различия отсутствовали и при сравнении уровня ИМГ у сусликов в донорской популяции и перед залеганием в спячку (рис. 5А, 5Б).

Зимовка переселенных сусликов. В июле 2023 г. в вольеру Воронинского заповедника было выпущено 40 сусликов. К середине августа 2023 г. все суслики залегли в спячку. Первая открывшаяся нора-веснянка обнаружена 26 марта 2024 г., а 31 марта в вольере было уже 20 открытых нор. С 11 по 14 апреля нами было отловлено в вольере и помечено урзолом для визуального опознавания 25 сусликов, что составляет 62.5% от выпущенных в вольеру. Среди них было 8 самцов (50% от числа переселенных) и 17 самок (68%). В результате визуального учета сусликов в период их максимальной активности 14 апреля с 16:10 до 16:25 на поверхности был зарегистрирован 21 суслик. Из них помеченных красителем – 18 особей (72%). Расчетное число успешно перезимовавших сусликов составило 29 особей из 40 выпущенных в вольеру в 2023 г. (72.5%).

ОБСУЖДЕНИЕ

Общепринятой практикой при решении задач восстановления популяций угрожаемых видов является переселение животных. Это неизбежно сопряжено со стрессом, не только острым, связанным непосредственно с перевозкой и сопутствующими манипуляциями, но и с хроническим, который часто имеет кумулятивную природу и может быть вызван разрывом родственных, социальных связей, новой экологической и социальной средой (Letty et al., 2007; Dickens et al., 2010). Хронический стресс влияет на репродуктивные, иммунные функции, когнитивные способности перемещенных животных, тормозит или делает невозможной адаптацию в новых условиях (Teixeira et al., 2007). Оценивать, насколько легко животные преодолевают стресс, связанный с переселением на новое место, – важная и даже необходимая задача при переселении редких видов с целью создания новых популяций. Однако мало кто из исследователей эту задачу намечает (Teixeira et al., 2007; Kachamakova et al., 2021).

Мы попытались это сделать в рамках эксперимента по созданию полувольной популяции крапчатого суслика. Проведенная валидация методики определения концентрации иммунореактивных метаболитов глюкокортикоидов в фекалиях сусликов подтвердила возможность использования коммерчески доступного набора ИФА для анализа кортизола в сыворотке крови (ООО “Хема”) у крапчатых сусликов. Повышение уровня ИМГ после перевозки по сравнению с состоянием на этапе отлова (отражавшим предшествующий уровень ИМГ) мы отчетливо наблюдали на стандартизированной выборке из пяти молодых сусликов. Инъекция им же АКТГ провоцировала отсроченный статистически значимый подъем концентрации ИМГ. Это дало нам возможность оценивать у сусликов индивидуальный уровень стрессированности по пробам фекалий и позволяет другим исследователям неинвазивно оценивать уровень стрессированности в природных и искусственных популяциях этого краснокнижного вида с помощью ИФА, и при использовании коммерческих наборов компании Хема.

Важный результат нашего исследования состоит в том, что после перевозки и сопутствующих манипуляций, которые в совокупности должны вызывать острый стресс, (Letty et al., 2007), уже через трое суток уровень стрессированности у сусликов не только значимо снизился, но и перестал отличаться от фонового уровня в донорской популяции. Срок в трое суток после перевозки и выпуска мог оказаться недостаточным для оценки хронического уровня стрессированности возможного в новых условиях вольерного содержания. Высокий уровень стрессированности мог сохраняться в течение более длительного времени, мог снижаться медленно или даже возрасти. Известно, что острый стресс повышает толерантность к новым стрессорам, в частности таким, как новизна и сопутствующая ей непредсказуемость обстановки (Byrne et al., 2020). В свою очередь хронический стресс подавляет глюкокортикоидную реакцию на новые стрессоры (Rich, Romero, 2005). Однако именно то, что снижение уровня стрессированности до фонового уровня в донорской популяции произошло уже за трое суток, может свидетельствовать о быстром привыкании крапчатого суслика к новым условиям, которые сами по себе могут вызывать хронический стресс, негативно влияя на физическое состояние, здоровье, размножение и, в итоге, на успех переселения (Dickens et al., 2009, 2010).

В имеющихся на сегодня единичных работах по исследованию стресса в связи с переселением у мелких млекопитающих показано, что физиологическая адаптация к новым условиям происходит быстро. Так, у переселенных серых белок (Sciurus carolinensis) динамика концентрации ИМГ в фекалиях не отличалась от динамики этого показателя у белок в донорской популяции (Bosson et al., 2013). У европейского суслика в Болгарии – филогенетически близкого крапчатому суслику вида – уровень стрессированности был высоким лишь в первые 10 дней после переселения и лишь у некоторых зверьков, и в течение месяца, неуклонно снижаясь, он стал ниже, чем у резидентов (Kachamakova et al., 2021). Снижение стрессированности до фонового уровня (как мы наблюдаем у крапчатого суслика) или даже ниже (как у европейского) указывает именно на адаптацию к новым условиям, а не просто на восстановление после острого стресса, вызванного переселением (Kachamakova et al., 2021). В противном случае восстановление было бы заторможенным или вообще не происходило бы.

Уровень стрессированности у остававшихся активными перед залеганием в спячку в августе молодых крапчатых сусликов также не отличался от фонового уровня в донорской популяции в начале июля. Интерпретировать этот результат в контексте адаптации сложно, поскольку у нас нет сравнительных данных об уровне стрессированности в донорской популяции перед залеганием в спячку. Повышение уровня глюкокортикоидов может быть сопряжено с интенсивным накоплением жировых запасов к концу сезона активности. Так, у золотистой земляной белки (Spermophilus saturatus) уровень кортизола постепенно снижался в течение первой половины активного сезона у представителей обоих полов, но позже увеличился до сезонного максимума в конце сезона, совпадающего с пиком увеличения массы тела (Boswell et al., 1994). У свободноживущих сусликов Белдинга (Spermophilus beldingi) концентрация кортикостерона повышалась в течение активного сезона. Годовой пик концентрации кортизола в плазме крови наблюдался непосредственно перед увеличением массы тела, связанным с накоплением жира перед спячкой (Nunes et al., 2006). Повышенный уровень стрессированности скорее всего обусловлен перестройкой физиологии на интенсивную подготовку к гибернации и не обязательно должен совпадать по времени с залеганием в спячку (Sheriff et al., 2012). Именно с таким предгибернационным состоянием сусликов мы скорее всего столкнулись, поскольку на последнем этапе отловов взрослые суслики уже залегли, а сеголетки уже накопили запас жира. Интересно, что у переселенных европейских сусликов уровень стрессированости в конце активного сезона заметно снизился в отличие от резидентов (Kachamakova et al., 2021). Тем не менее, с учетом высокой массы тела молодых сусликов, отсутствие у них отличия в уровне ИМГ от уровня в донорской популяции косвенно указывает на их хорошее состояние перед спячкой.

Побочный, но важный результат исследования динамики стрессированности крапчатых сусликов в процессе переселения – наличие устойчивых межиндивидуальных различий в уровне ИМГ. На это указывает значимый эффект номера особи (случайного фактора) в смешанных моделях, свидетельствующий о том, что межиндивидуальные различия в уровне ИМГ выражены сильнее, чем изменчивость повторных измерений ИМГ у одной и той же особи – признак персональности (Dingemanse, Dochtermann, 2013). Индивидуальность в паттерне динамики ИМГ хорошо видна на рис. 2. До сих пор устойчивые межиндивидуальные различия в стресс-реактивности были показаны в очень небольшом количестве исследований (Carere et al., 2003; Cockrem, 2013; Qu et al., 2018; Surkova et al., 2024).

Отсутствие падения массы тела у молодых зверьков после перевозки и их успешная нажировка перед залеганием служат подтверждением успешной адаптации. Достигнутая сеголетками масса тела (274 г) в августе была даже выше, чем масса тела сусликов в донорской популяции в аналогичный период (Проявка и др., 2017). Не было обнаружено различий в динамике массы тела между переселенцами и резидентами и у европейского суслика (Kachamakova et al., 2021).

Очевидно, что низкий уровень стрессированности и нормальный набор массы после переселения говорят не только о присущей крапчатым сусликам, как и другим беличьим (Bosson et al., 2013; Kachamakova et al., 2021), способности быстро адаптироваться к новой незнакомой среде, но и об адекватности процедуры переселения и хороших условиях, созданных в вольере. Сочетание того и другого обеспечило успешную перезимовку сусликов (72.5%). Хотя в публикациях отмечается, что смертность во время спячки у видов – гибернаторов, такие как сурки и суслики, ниже, чем в период активности (Калабухов, 1985; Neuhaus, Pelletler, 2001), опубликованные данные все же говорят о возможности высокой смертности в этот период. Документированная зимняя смертность крапчатого суслика в Польше достигала 63% (Surdasky, 1968 – цит. по: Лобков, 1999). Данные по европейскому суслику в Чешской республике также подтверждают высокую смертность во время зимней спячки; так, смертность взрослых самцов зимой 2002–2003 и 2003–2004 гг. составляла 20 и 87.5% соответственно, взрослых самок – 25 и 80%, а смертность молодых сусликов в зимний период в эти годы была стабильно высокой 83.3– 90.9% (Matějů, 2008). В одном из экспериментов по переселению европейских сусликов в Болгарии выживаемость составила всего 10%, и в результате новая колония быстро вымерла (Koshev et al., 2019). В целом по всей Европе переселения европейских сусликов приводят к успеху лишь в 50% случаев (Matějů et al., 2012).

Таким образом, согласно полученным нами результатам, формирование благополучной полувольной популяции крапчатого суслика в условиях ограниченного пространства и высокой плотности возможно. У нас есть веские основания считать, что, первый эксперимент по созданию такой полувольной популяции на его первом этапе прошел успешно, а разработанная методология переселения может быть использована для создания новых полувольных популяций этого краснокнижного вида. Полученные данные о снижении уровня ИМГ в фекалиях, успешной нажировке и перезимовке сусликов подтверждают возможность их быстрой адаптации к новым условиям жизни.

 

Благодарности

Авторы выражают глубокую благодарность Сергею Федоровичу Сапельникову и Инне Игоревне Сапельниковой за помощь в организации работы по переселению сусликов и при отлове зверьков, сотрудникам Воронинского заповедника и особенно Сергею Валентиновичу Скобееву, без технической и моральной поддержки которых эта работа была бы невозможной, Аркадию Борисовичу Савинецкому за многократную и разностороннюю помощь в процессе подготовки и организации работы.

Финансирование работы

Работа выполнена в рамках государственной программы исследований Института проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова “Наземные экосистемы – структура и функционирование”, FFEP-2024-0018.

Соблюдение этических стандартов

Работы одобрены комиссией по биоэтике ИПЭЭ им. А. Н. Северцова РАН, протоколы № 73 от 03.07.2023 и № 73а от 01.04.2024. Отлов крапчатых сусликов в донорском поселении (г. Липецк) проведен в соответствии с разрешением Росприроднадзора № 053 от 21.04.2023.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

О. Н. Шекарова

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН

Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

Л. Е. Савинецкая

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН

Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

О. А. Бурканова

ФГБУ “Государственный природный заповедник “Воронинский”

Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Тамбовская область, 393310

Е. Н. Суркова

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН

Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

А. В. Чабовский

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН

Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

К. А. Роговин

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: krogovin@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

Список литературы

Дополнительные файлы