Cell polyploidy. Cardiac muscle. Liver. Ontogenesis and regeneration

全文:

Изучение клеточной полиплоидии стало возможным с обнаружения соответствия между числом хромосом и содержанием ДНК в интерфазном ядре и разработкой метода цитофотометрии ДНК. В 1970–1980-е гг. обосновано общебиологическое распространение полиплоидных клеток и их особая значимость у млекопитающих. У них полиплоидные клетки обычны во всех зрелых тканях. В экспериментах определен механизм полиплоидизации, обоснованы ее причины. Данные экспериментальных работ обобщены в монографии, изданной в Кембридже (Brodsky, Uryvaeva, 1985). Исследования продолжались во многих лабораториях, и в 2020–2022 гг. опубликованы новые обзоры (Donne et al., 2020; Kirillova et al., 2021; Bailey et al., 2021; Anatskaya, Vinogradov, 2022). Общая их черта — игнорирование работ, выполненных до 2000 г. В результате предлагаются маловероятные или даже неверные представления о механизме умножения генома, причинах полиплоидизации клеток в онтогенезе и ее значимости в онтогенезе и при регенерации.

Задача настоящей статьи — рассмотреть экспериментальные данные об основах клеточной полиплоидии. Также приведены новые значимые результаты молекулярной генетики, перспективные для понимания остановки митоза при образовании двуядерных и одноядерных полиплоидных клеток. Основные объекты исследования в давних и современных работах — гепатоциты печени и кардиомиоциты желудочков сердца млекопитающих. Обсуждаются современные данные об их развитии в онтогенезе и в процессе регенерации.

КЛЕТОЧНАЯ ПОЛИПЛОИДИЯ В СЕРДЦЕ

Взрослые животные

Данные относятся к миоцитам желудочков сердца. Изучение срезов миокарда выявило сходные размеры ядер и привело к выводу о диплоидности кардиомиоцитов. Уже в первых исследованиях изолированных клеток обнаружено множество двуядерных клеток, т. е. как минимум тетраплоидных по суммарному геному — до 80% у крысы (Коган и др., 1976). Затем цитофотометрия ДНК подтвердила тетраплоидию и выявила октаплоидные двуядерные, а также одноядерные полиплоидные кардиомиоциты. Число диплоидных и полиплоидных клеток сходно в левом и правом желудочках изученных видов млекопитающих и мало отличается в разных слоях миокарда мыши и человека (Brodsky, 1991). В предсердиях полиплоидия выражена слабее, чем в желудочках, но миоциты с умноженным геномом есть и здесь. У всех изученных млекопитающих в желудочках нашли более 50% двуядерных клеток, минимально тетраплоидных по суммарному геному (табл. 1). Обычны в миокарде и многоядерные клетки.

 

Таблица 1. Клеточная полиплоидия в печени и миокарде левого желудочка сердца млекопитающих (Brodsky, Uryvaeva, 1985; Brodsky, 1991; Кудрявцев и др., 1997; Vinogradov et al., 2001; Derks, Bergmann, 2020): + 70–90%, ± 40–50%, — 5–10%, пустые ячейки — нет достоверных данных

	Печень	Миокард
Человек Homo sapiens	–	+
Шимпанзе Pan troglodytes	±
Бонобо Pongo pygmaeus	–
Горилла Gorilla gorilla	–
Резус Rhesus monkey		+
Макака Macaca mullata	–	+
Лисица Vulpes vulpes	–	+
Песец Alopex lagopus	–	+
Норка Mustella vison	–	+
Енотовидная собака Nycteretus procyonoides	–
Выдра Lutra lutra	–
Гепард Acinomyx jubatus	+
Собака Canis familiaris	–	+
Кошка Felis catus	–	+
Рысь Felix lynx	–
Мышь Mus musculus	+	+
Крыса Rattus rattus	+	+
Полевка Microtus fortis	±
Полевка M. sahaliensis sachalinensis	±
Полевка M. subarvalis	±
Полевка M. ochrogaster	+
Суслик Spermophilus ppygmaeus	+
Кролик Oryctolagus cuniculus	–	+
Морская свинка Cavia porcellus	–	+
Лошадь Equus caballus	–	+
Зебра Equus zebra	–
Свинья Sus scrofa	–	+
Пекари Tayassu tajacu	–
Корова Bos taurus	–	+
Лось Alces alces	–
Коза Capra hircus	–	+
Овца Ovis aries	–	+
Олень северный Rangifer tarandus	–
Косуля Capreolus capreolus	–
Антилопа Orix dammah	–
Жираф Giraffa camelopardalis	–	+
Еж Erinaceus europeus	–
Ехидна Tahyglossus aculeatus	–
Кенгуру Macropus agilis	+	+
Кенгуру M. canguru giganteus	±
Кенгуру M. rufogriseus	–

 

Исследование плоидности кардиомиоцитов миокарда у разных видов взрослых птиц показало полиплоидизацию со значительным преобладанием двуядерных клеток (Anatskaya et al., 2001). Немало многоядерных кардиомиоцитов с 3–8 диплоидными ядрами.

Отметим, что у тритона (Oberpriller et al., 1988) и рыб Danio rerio (Poss et al., 2002) миокард диплоидный. Такой миокард способен ответить на повреждение пролиферацией кардиомиоцитов и восстановлением структуры и функций сердца (Ellman et al., 2021). Ранее во многих работах было показано, что у тритона после повреждения глаза сетчатка полноценно восстанавливается из диплоидных клеток пигментного эпителия. В специальных исследованиях отмечены различия свойств пигментного эпителия у тритона и млекопитающих (Лопашов, Строева, 1963). Подобные исследования сердца рыб и тритона чрезвычайно перспективны. Уже показано, что полиплоидизация миокарда рыбы D. rerio ликвидирует способность к регенерации (Gonzalez-Rosa et al., 2018). В отличие от данио, миокард атлантического лосося содержит много двуядерных клеток (около 30% 2с × 2 и 4% 4с × 2; с — количество ДНК, соответствующее n — хромосомному набору — 16n, 64n и т. д.), есть одноядерные 4с и 8с (Мартынова и др., 2002). Не известно, как у лосося происходит регенерация. Скорее всего, не только диплоидия — фактор регенерации. Но на этот материал стоит обратить внимание, как это делается при сравнении регенерации сетчатки тритона и мыши (Grigoryan, 2022).

Изменения пролиферации кардиомиоцитов в онтогенезе

Все ткани новорожденных млекопитающих диплоидные. После рождения крысы или человека клетки делятся, умножая число клеток в органе. Через 3–4 дня в сердце и в печени многие полные митозы сменяются неполными, приводя к образованию двуядерных и одноядерных полиплоидных клеток (Brodsky et al., 1985b). Затем в 7–14 дни число митозов у крысы или мыши резко уменьшается, а к 20-му дню митозы в миокарде необратимо блокируются. При внимательном изучении десятков тысяч срезов миокарда взрослых мышей и крыс митозы не были найдены даже после значительных повреждений сердца (Румянцев, 1982). Не найдены и изменения в плоидности кардиомиоцитов.

Полиплоидизация миокарда перепела завершается в первые 40 дней после вылупления, ко времени полного завершения роста птицы (Anatskaya et al., 2001). Далее плоидность не изменяется. У взрослых птиц преобладают двуядерные миоциты, около половины всех клеток.

Митозы в миокарде блокируются у мыши или крысы к 20–21-му дню после рождения, у человека примерно к 10 годам. Изучение трансплантатов миокарда показало врожденную внутреннюю программу остановки пролиферации (делений и полиплоидизации кардиомиоцитов). В Мичиганском университете трансплантировали кусочки миокарда новорожденной крысы под капсулу почки взрослой крысы; в Москве фотометрировали ДНК и определяли кинетику двуядерных кардиомиоцитов (Brodsky et al., 1988). Клетки в трансплантате делились и полиплоидизировались в те же сроки, что в сердце in situ.

Давно предполагалось, что митозы в миокарде прекращаются по мере дифференцировки миофибрилл. Румянцев (Rumyantsev, 1977) отметил, что дезорганизация миофибрилл во время митозов нарушает развитие сердца в раннем онтогенезе. Остановка митозов становится условием дифференцировки клеток.

Кардиомиоциты, вышедшие из цикла, продолжают расти, интенсивно синтезируя белок. Крыса растет всю жизнь; к концу жизни, 2–3 годам, вес ее тела достигает 500–600 г. Растет и миокард, но только за счет увеличения массы непролиферирующих клеток.

На рис. 1 приведена обобщенная схема роста миокарда мыши до года ее жизни. В первые дни после рождения вес миокарда увеличивается примерно на треть за счет делений клеток, в это время диплоидных. Последующая полиплоидизация, укрупнение клеток приводят к увеличению массы миокарда более чем в 2 раза, а постмитотический рост цитоплазмы — еще в 4 раза. У человека вес сердца увеличивается наиболее интенсивно в первые годы жизни и в период полового созревания, до 18 лет. Митозы в кардиомиоцитах человека прекращаются в 9–12 лет (Takamasu et al., 1983). Поскольку в миокарде человека нашли размножение миоцитов и последующую полиплоидизацию, а затем и рост цитоплазмы, схема на рис. 1 может характеризовать и кинетику роста миокарда человека. Но конкретный вклад разных способов роста миокарда человека еще предстоит выяснить.

 

Рис. 1. Кинетика роста популяции желудочковых миоцитов мыши от одного дня после рождения до года. На верхней кривой изменения среднего содержания белков в миоцитах по данным цитофотометрии (1) сравниваются с кинетикой веса (2) желудочков (по: Brodsky, 1991, с изменениями).

 

В исследовании патологоанатомического материала сердца человека (Brodsky et al., 1991) была найдена значительная вариабельность плоидности кардиомиоцитов в миокарде здоровых людей (Brodsky et al., 1993, 1994). Исследование миокарда крыс и мышей, взятых из вивария, показывало большое сходство индивидуальных значений плоидности, хотя некоторая вариабельность отмечена и у них. В разные дни трехнедельного периода после рождения крыс варьирует и митотический индекс кардиомиоцитов (Большакова, 1980).

Как показали наши экспериментальные исследования развития сердца мыши (Brodsky et al., 1985a), одной из причин вариабельности плоидности клеток могут быть различия в режиме питания после рождения. Обычно мыши или крысы выращивают 7–8 сосунков у одной кормилицы. Такую группу брали как контроль. Были еще две группы: в одной к кормилице подсаживали 16 сосунков, в другой — только 4. Ко дню отъема, переходу к самостоятельному питанию на 21-е сутки. после рождения, обильно питающиеся мышата (4 у кормилицы) весили значительно больше, чем слабо питающиеся; их сердце весило вдвое больше. Так же отличалось и содержание белков в желудочковых миоцитах. Численность кардиомиоцитов у быстро растущих мышей ко дню отъема была на 20% больше, чем у медленно растущих. У последних было значительно больше диплоидных миоцитов и в 5–6 раз меньше октаплоидных. У быстро растущих были и гексадекаплоидные клетки (около 20%), которых не было у медленно растущих. В итоге суммарный геном быстро растущих был в 1.5–2 раза больше, чем у медленно растущих. Этот уровень сохранялся до 3 месяцев. Позже суммарный геном не оценивали, но митозов после 3 недель не видели.

Итак, мыши, различно растущие в детстве, к переходу на самостоятельное питание и на всю жизнь получают миокард разной плоидности. Вес миокарда быстро (к 3 месяцам) нивелируется за счет увеличения массы цитоплазмы. Но индивидуальная вариабельность плоидности у мышей и, что важно, здоровых взрослых людей различается вдвое. Может ли это иметь какое-либо значение в жизни организма? Возможно, это играет роль при гипертрофии миокарда после тяжелых повреждений сердца, таких, например, как инфаркт (требует специального анализа).

В отношении регенерации активности миокарда ранее отмечались лишь наблюдения патологической анатомии о гипертрофии органа после инфаркта и других повреждений. Существуют две точки зрения на способность поврежденного миокарда к регенерации. Согласно одной из них, миокард обладает слабым регенераторным потенциалом (Румянцев, 1982; Soonpaa, Field, 1998). Согласно другой точке зрения, миокард обладает достаточно высокой способностью к репаративной регенерации (Urbanek et al., 2005; Leri et al., 2011). При этом предполагается, что популяция кардиомиоцитов может пополняться не только за счет их собственной пролиферативной активности, но и путем дифференцировки резидентных стволовых клеток сердца или стволовых клеток иного происхождения (Buja, Vela, 2008; Laflamme, Murry, 2011; He et al., 2020).

Гипотеза, предполагающая высокую способность сердца человека к регенерации, основана на допущении высокой скорости оборота клеток в миокарде взрослого человека в ходе его старения (Anversa et al., 2006; Kajstura et al., 2012). Согласно этой гипотезе, высокая скорость оборота кардиомиоцитов достигается за счет непрерывной замены изношенных старых миоцитов новыми клетками, которые образуются из стволовых клеток сердца. Предлагалась такая схема оборота клеток при регенерации миокарда и в ходе его старения: стволовая клетка → прогениторная клетка → клетка-предшественник → амплифицирующийся миоцит, способный к митотическому делению и содержащий небольшое количество миофибрилл → зрелый, полностью сформированный кардиомиоцит взрослого млекопитающего (Anversa et al., 2013).

Наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что миокард левого желудочка взрослых млекопитающих обладает очень слабой способностью к регенерации путем восстановления численности миоцитов как в ходе старения, так и после его ишемического повреждения (Baidyuk et al., 2016, 2019). Не подтверждена гипотеза о ведущей роли стволовых клеток, однако вопрос их наличия в миокарде все еще дискутируется (He et al., 2020). Гипертрофия функционально активных кардиомиоцитов является единственным механизмом компенсации функции миокарда после потери клеток при старении сердца или после его повреждения. Если бы гипотеза о ведущей роли стволовых клеток была верна, на гистограммах распределения кардиомиоцитов по размерам, от стадии “амплифицирующихся” миоцитов с минимальным количеством миофибриллярных белков до зрелых кардиомиоцитов, которые содержат огромное количество этих белков, наблюдали бы непрерывный ряд размеров клеток. Однако этого не обнаружено. Кроме того, если бы кардиомиоциты формировались из диплоидных стволовых клеток, то в ходе их дифференцировки в зрелые кардиомиоциты следовало бы ожидать значительных изменений в распределении миоцитов по классам плоидности. Однако этого не наблюдалось (табл. 2).

 

Таблица 2. Плоидность кардиомиоцитов (КМЦ) левого желудочка сердца контрольных крыс (К) и крыс с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) после инфаркта в периинфарктной (пи) и интактной (инт) зонах через 2, 6 и 26 недель после коронароокклюзии (Baidyuk et al., 2016, модифицирована), среднее ± ошибка

Время, нед	Группа крыс	Доля КМЦ разных классов плоидности, %					Доля двуя-дерных КМЦ, %	Средняя плоидность КМЦ, с
		2с	2с × 2	4с	4с × 2	8c
2	К	15.00 ± 1.72	81.50 ± 1.67	2.30 ± 0.78	1.10 ± 0.37	0.10 ± 0.10	82.60 ± 1.98	3.75 ± 0.05
	ХСН, инт	13.20 ± 1.27	82.90 ± 0.68	2.60 ± 0.60	1.30 ± 0.25	0	84.20 ± 0.78	3.79 ± 0.03
	ХСН, пи	12.70 ± 1.76	84.20 ± 2.38	2.10 ± 0.81	1.60 ± 0.29	0	85.80 ± 2.49	3.83 ± 0.05
6	К	13.38 ± 4.96	83.50 ± 4.81	2.00 ± 0.91	1.13 ± 0.38	0	84.63 ± 4.98	3.78 ± 0.11
	ХСН, инт	9.20 ± 1.66	87.00 ± 1.57	2.40 ± 0.29	1.40 ± 0.43	0	88.40 ± 1.62	3.87 ± 0.04
	ХСН, пи	8.40 ± 1.10	86.90 ± 0.58	1.80 ± 0.41	2.70 ± 0.56	0.20 ± 0.12	89.60 ± 1.02	3.95 ± 0.04
26	К	14.58 ± 1.89	81.82 ± 2.15	1.94 ± 0.39	1.5 ± 0.52	0.16 ± 0.18	83.32 ± 1.91	3.77 ± 0.03
	ХСН, инт	15.95 ± 1.52	79.76 ± 1.84	2.62 ± 0.63	1.33 ± 0.47	0.35 ± 0.27	81.08 ± 1.69	3.75 ± 0.03
	ХСН, пи	14.91 ± 1.34	81.26 ± 1.02	1.76 ± 0.49	1.99 ± 0.61	0.07 ± 0.07	83.26 ± 1.19	3.78 ± 0.05

 

Таким образом, экспериментальные данные позволяют заключить, что стволовые клетки сердца не играют заметной роли при физиологической или репаративной регенерации миокарда млекопитающих. К аналогичному заключению пришли и другие авторы при исследовании большого числа генов, связанных с клеточным циклом кардиомиоцитов, у мышей разного возраста и оборота миоцитов в сердце взрослых мышей с использованием стабильных изотопов азота и масс-спектрометрии, наблюдая локализацию этих изотопов в сердце (Walsh et al., 2010; Senyo et al., 2013).

В отличие от других изученных полиплоидных клеток млекопитающих, кардиомиоциты не удваивают свою массу при дупликации генома. Белковая масса тетраплоидных кардиомиоцитов соответствует не четырем геномам, а лишь трем. Октаплоидные и более высокоплоидные кардиомиоциты примерно вдвое легче, чем можно было ожидать, исходя из их суммарного генома. С таким несоответствием массы клеток их геному мышь или человек живут до глубокой старости. В работе с патанатомом Д.С. Саркисовым показано, что кардиомиоциты человека добирают массу до двойной на первом этапе гипертрофии при патологии сердца (Brodsky et al., 1994). Возможно, высокая плоидность миоцитов, сложившаяся в детстве (Brodsky et al., 1985a), дает некое преимущество перед низкой плоидностью, поскольку в высокоплоидном миокарде выше резерв начального компенсаторного роста.

Заключение

Миокард изученных примерно 20 видов взрослых млекопитающих и птиц образован в основном полиплоидными клетками, главным образом двуядерными. Механизм полиплоидизации — замена полных митозов неполными. В позднем детстве происходит необратимая остановка пролиферации кардиомиоцитов, как деления клеток, так и полиплоидизации. Главный механизм роста сердца после остановки митозов в онтогенезе и при патологии — гипертрофия цитоплазмы.

ГЕПАТОЦИТЫ ПЕЧЕНИ

Первые методические работы по цитофотометрии ДНК в интерфазных клетках проводили на гепатоцитах крысы или мыши. Найдено до 90% полиплоидных клеток — одноядерных и двуядерных (напр., Nadal, Zaidela, 1966). Сложилось мнение, что паренхима печени млекопитающих всегда полиплоидная. Исследование многих видов животных показало, что мышь и крыса, скорее, исключения среди других примерно 40 изученных видов. Только пять видов исследованных млекопитающих имеют полиплоидную паренхиму, и еще у пяти видов ткань полиплоидная наполовину; у остальных хотя и есть полиплоидные клетки, но их мало (табл. 1). В печени взрослого человека содержится до 90% диплоидных гепатоцитов, полиплоидия возрастает после 50 лет и при патологии, стимулирующей пролиферацию (Watanabe et al., 1984; Kudryavtsev et al., 1993; Блинкова и др., 2017). Так, при гепатите число полиплоидных гепатоцитов, в основном двуядерных, может достигать 40%.

Изменения пролиферации гепатоцитов в онтогенезе

Гепатоциты, так же как кардиомиоциты, новорожденных млекопитающих диплоидные. До 7–8-го дня после рождения гепатоциты интенсивно делятся. После митоза цитоплазма продолжает увеличиваться примерно на 20–30% от двойной массы (Шалахметова и др., 1981б). Рост печени в это время обеспечивается примерно на 60% пролиферацией гепатоцитов и на 40% увеличением массы цитоплазмы. С 7 до 21-го дня к началу самостоятельного питания происходит полиплоидизация некоторых гепатоцитов крысы (Богданова и др., 1990). На 14–21-е сутки вклад трех способов роста в увеличение массы органа становится примерно одинаковым. В дальнейшем вклад увеличения цитоплазмы в рост печени заметно снижается и в период от 1 до 2 месяцев составляет лишь 1%, сравнительно с размножением клеток и их полиплоидизацией. На этой стадии развития прирост массы печени на 2/3 обеспечивается размножением клеток и на 1/3 — их полиплоидизацией. В целом ускоренный рост печени крыс от момента рождения до полового созревания (2 месяца), когда масса органа увеличивается примерно в 30 раз, характеризуется следующими показателями: вклад процесса пролиферации составляет 28%, полиплоидизации — 30%, постмитотического роста цитоплазмы — 42%. В дальнейшем рост печени замедляется. В период от 2 до 6 месяцев увеличение массы печени обеспечивалось главным образом размножением клеток (76%). Вклад полиплоидизации и гипертрофии составлял 8 и 16% соответственно.

В опытах с изменением условий роста печени в первые недели жизни мышей (разные по числу кормящихся у одной самки) показано, что в гнездах по 4 мышат средний геном гепатоцитов в 1.5 раза больше, чем у мышат из гнезд по 16 (Brodsky, Delone, 1990). В день отъема от кормящих самок (21 сут. после рождения) у избыточно и недостаточно питающихся так же различается вес мышат и их печени. К 3 месяцам отличия веса сглаживаются. Но если в миокарде различия геномов, заложенные в детстве, остаются на всю жизнь, в печени геномы гепатоцитов к 3 и 6 месяцам выравниваются и становятся сходными за счет делений и полиплоидизации клеток.

В отличие от миокарда, гепатоциты паренхимы печени мыши, крысы и человека могут входить в цикл в течение всей жизни организма. У мышат и крысят полиплоидизация гепатоцитов наиболее интенсивна в течение первых недель после рождения — во время перехода от питания молоком матери на самостоятельное питание (Brodsky, Uryvaeva, 1985; Богданова и др., 1990). К 20-му дню после рождения устанавливается постоянное соотношение диплоидных и полиплоидных гепатоцитов, и митозы становятся редкостью: один на 10–20 тыс. При этом метафазы находят постоянно. Такая слабо пролиферирующая популяция сохраняется до глубокой старости.

Сведения о регенерации печени детально изложены ранее; суммированы десятки экспериментов (Brodsky, Uryvaeva, 1985). Данные развивались до последнего времени (Wilkinson et al., 2019). При повреждении печени в любом возрасте гепатоциты входят в цикл; после стандартной (2/3) гепатэктомии циклируют все гепатоциты. В результате происходит их дальнейшая полиплоидизация. В.М. Фактор и И.В. Урываева (1975) в течение года удаляли часть печени у одной и той же мыши. Модальным классом вместо 2с × 2, 4с и 4с × 2 становился 16c в одноядерном и двуядерном варианте; находили 64c и даже 128c клетки. Иначе регенерирует печень китайского хомячка (Сакута и др., 2011). В паренхиме хомячка около 80% диплоидных гепатоцитов. Регенерация печени после частичной гепатэктомии у этого вида происходит исключительно за счет размножения диплоидных клеток.

Усиление полиплоидизации гепатоцитов продемонстрировано во многих экспериментах с воздействием на печень различных токсических веществ, в том числе CСl₄ (Кудрявцев и др., 1993; Bezborodkina et al., 2016). Через 6 месяцев воздействия на крыс CСl₄ доля 2с × 2 гепатоцитов в цирротической печени снижается на 25%, в то время как доля октаплоидных гепатоцитов увеличивается в 2.4 раза, по сравнению с нормальной печенью крыс того же возраста. Могут появляться гепатоциты, не характерные для печени контрольных крыс, — одноядерные 16с и даже двуядерные 16с × 2 клетки. Характерным признаком различных патологий печени человека, в частности вирусного гепатита, жирового гепатоза, внепеченочного холестаза и цирроза, также является усиление пролиферативной активности гепатоцитов и, как следствие, изменение распределения их по классам плоидности.

Интересной особенностью клеточной популяции паренхимы печени как у крысы, так и у человека является увеличение при циррозе доли одноядерных диплоидных гепатоцитов (Сакута, Кудрявцев, 2005). По-видимому, это явление связано с более высокой способностью 2с гепатоцитов к вступлению в митотический цикл, по сравнению с полиплоидными клетками (Урываева, Маршак, 1969; Watanabe, 1970).

Заключение

Паренхима печени всех 40 изученных видов млекопитающих содержит полиплоидные гепатоциты — одноядерные и двуядерные. Но лишь у немногих видов полиплоидные клетки преобладают; у большинства их немного, и они образуются в основном в старости или после повреждений печени и при патологии. В отличие от кардиомиоцитов, гепатоциты способны входить в митотический цикл в любом возрасте животных или человека. Основной эффект — полиплоидизация.

ПЕРЕХОД ОТ ДЕЛЕНИЙ КЛЕТОК К ПОЛИПЛОИДИЗАЦИИ

После Гейтлера (Geitler, 1939), описавшего эндомитоз — деление хромосом внутри ядерной оболочки у некоторых насекомых, такие сомнительные картины как будто видели у единичных видов других беспозвоночных. У позвоночных подобных картин не описывали, но термин “эндомитоз” почему-то прижился. Один из основных выводов из наблюдений клеток позвоночных — полиплоидизация является результатом обычных, но неполных митозов. Слияние клеток — крайне мало распространенное событие в нормальном онтогенезе.

Предположение о смене одноядерных и двуядерных гепатоцитов сделаны еще в 1960-е гг. (Nadal, Zaidela, 1966). Подробно динамика полиплоидизации гепатоцитов изучена в опытах с быстрой и продолжительной тимидиновой, а также с двойной ³H- и ¹⁴C-тимидиновой меткой (Урываева, Фактор, 1974; Brodsky, Uryvaeva, 1985). Показано, что сначала митозы останавливаются в телофазе, и образуются двуядерные клетки с диплоидными ядрами. В следующем цикле из них образуются две одноядерные тетраплоидные клетки (рис. 2). Неполный митоз каждой тетраплоидной клетки дает двуядерную с тетраплоидными ядрами, а из нее получаются две октаплоидные клетки. Подобная динамика названа Дунканом “конвеером” (Duncan et al., 2010). Такая же последовательность образования полиплоидии отмечена для миокарда (Урываева и др., 1980) и пигментного эпителия сетчатки (Маршак и др., 1976).

 

Рис. 2. Образование политенных хромосом, полиплоидных и многоядерных клеток. Схема.

 

Для некоторых клеток также известна остановка цикла в G2-периоде: хромонемы (хроматиды) удвоены, хромосомы не разделились. Повторение таких эндоциклов ведет к политении, иногда огромной: у дрозофилы более 1000с, у гигантских нейронов моллюсков и у железистых клеток шелкопряда — сотни тысяч (Brodsky, Uryvaeva, 1985). У человека скрытая политения свойственна клеткам трофобласта плаценты (Зыбина и др., 2004).

Как известно, двуядерные клетки не отличаются от одноядерных той же плоидности (2c × 2 от 4c, 4c × 2 от 8c и т. д.) по интенсивности транскрипции и трансляции, содержанию белков, РНК и гликогена, активности изученных ферментов, числу центриолей (Онищенко, 1978; Шалахметова и др., 1981а, б; Middleton, Cahan, 1982; Noorden et al., 1984; Безбородкина и др., 2009). То же показано в исследовании экспрессии многих генов в сердце и печени (Anatskaya, Vinogradov, 2007). По многим изученным показателям тетраплоидная клетка вдвое купнее и активнее диплоидной, а октаплоидная — в 4 раза. Однако при огромных удвоениях генома, не свойственных млекопитающим (например, у шелкопряда), происходит так называемая компенсация дозы генов.

Рассматривая полиплоидизацию организмов, обоснованно предполагают влияние стресса: изменений температуры, солености среды и т. д. (Fox et al., 2020; Anatskaya, Vinogradov, 2022). Предположение почему-то переносится на клеточную полиплоидию. Для органов млекопитающих, например печени, обсуждают физиологический стресс. Некоторые авторы уточняют: гепатоциты полиплоидизируются при переходе от молочного питания детенышей к самостоятельному кормлению, примерно в 3 недели у мышей и крыс (Donne et al., 2020; Anatskaya, Vinogradov, 2022). Между тем известно, что полиплоидизация гепатоцитов начинается до отъема мышат и крысят от маток. Выше мы приводили опыты с выращиванием мышат в разных гнездах. Ко дню отъема (3 недели после рождения) средний геном гепатоцитов у мышат в гнездах по 4 был в 1.5 раза больше, чем у мышат из гнезд по 16 (Brodsky et al., 1985b; Brodsky, Delone, 1990).

В новых работах не обсуждается одна из альтернатив. Давно предполагались конкурентные отношения пролиферации и дифференцировки. Основным механизмом, который ведет к замене полных митозов неполными, полиплоидизирующими, могут быть конкурентные отношения между предмитотическими и тканеспецифическими процессами (синтезами), которые происходят в ходе дифференцировки клеток. Так, при стимуляции митозов в печени мыши после частичной гепатэктомии резко снижалась функция детоксикации (Урываева, Фактор, 1976). CCl₄ не токсичен для клеток; в гепатотоксин он превращается специфическими ферментами гепатоцитов. В начале активной пролиферации после гепатэктомии паренхима печени перестала поражаться CCl₄. В регенерирующей печени снижена детоксикация различных лекарств. Известно и обратное влияние функции на пролиферацию: насыщение крысы глюкозой после частичной гепатэктомии замедляло регенераторный ответ (Takata, 1974). Выраженность конкурентных отношений в метаболизме (за АТФ, рибосомы, предшественники) объясняет вариабельность уровня плоидности гепатоцитов у разных видов млекопитающих: от почти полной полиплоидизации печени у крысы и мыши до преобладания диплоидных клеток у человека и многих других видов (табл. 1). Решающие факторы — масса тела животного, определяющая величину метаболизма, и еще больше скорость роста животного в постнатальном онтогенезе (Vinogradov et al., 2001).

Конкуренция синтезов вряд ли единственный способ перехода от полных митозов к неполным. Вполне вероятны и прямые воздействия на гены пролиферации. Так, тетраплоидные клетки возникают у р53-дефицитных мышей при критическом укорочении теломер (Davoli et al., 2010; Davoli, Lange, 2012), в которых, по теории Оловникова (Olovnikov, 1973), могут содержаться некоторые гены пролиферации. Насколько часты прямые воздействия неясно. Конкурентные отношения пролиферации и дифференцировки повсеместны.

Молекулярно-генетические механизмы остановки митоза

Циклин-зависимые киназы (cyclin-dependent kinases — CDK) — известные регуляторы митотического цикла — контролируют переход от фазы к фазе, к митозу и периодам митоза (Gjelsvik et al., 2019). Активный фактор — комплекс CDK, специфичной для определенного отрезка цикла, с также специфичным циклином. Нарушения в структуре комплекса или только в циклине останавливают подготовку к делению или какой-то период митоза (Nevzorova et al., 2009; Diril et al., 2012). Результат — умножение только хромонем, нерасхождение удвоенных хромосом или образование двуядерных клеток. Так, при ингибировании CDK1/cyclinB происходит задержка в G2-периоде, и в следующем полном митозе образуются две тетраплоидные клетки. Ингибирование CDK может и предотвращать вхождение в цикл. Так, блокируется циклирование стволовых клеток трофобласта и образование гигантских клеток (Ullah et al., 2008). С другой стороны, повышенная экспрессия циклина 1 увеличивает многоядерность кардиомиоцитов (Soonpaa et al., 1997).

Другие митотические киназы также могут изменять цикл. Так, Aurora-A экспрессируется при переходе от G2 к митозу и затем при сборке веретена. Возможно влияние этой киназы на цитокинез и образование двуядерных клеток (Marumoto et al., 2003).

Вместе с CDK или отдельно на переход от цикла деления к полиплоидизации могут влиять некоторые транскрипционные и другие активные факторы, такие как Ect2, E2F, Skp2 (Minamishima et al., 2002; Chen et al., 2012; Green et al., 2012; Ouseph et al., 2012; Sladky et al., 2020).

Примечательно влияние на CDK или неясный пока самостоятельный эффект на замену делений на полиплоидизацию таких регуляторных белков, как p53, ламилина, септина, или некоторых белков нейропротекторов (Sheahan et al., 2004; Ullah et al., 2008; Lin et al., 2014; Kim et al., 2016; Wang et al., 2018; Brodsky et al., 2020; Brodsky, 2022). Особое внимание привлекает YAP (yes-associated protein) — компонент сигнального пути Hippo, регулятора транскрипции генов, участвующих в пролиферации клеток (Huang et al., 2005; Noguchi et al., 2018).

Известны влияния на митотический цикл микроРНК, особенно miRNA-122, в связи с динамикой двуядерных клеток (Hsu et al., 2012).

Среди генов, влияющих на цитокинез в печени мыши, выделены Cdk1, Trp53, Cdkn1a, cMyc, Ccne, Birc5, Ssu72 (Fox et al., 2020).

Заключение

Молекулярно-генетические механизмы регуляции митотического цикла — одно из самых перспективных направлений изучения пролиферации и, в частности, полиплоидизации клеток. Уже имеющиеся данные очень интересны, хотя во многом описательны. Одно из ограничений их значимости — принятие совпадений событий во времени с причинной их связью. Экспрессия какого-либо гена во время полиплоидизации не означает регуляции умножения генома (неполного митоза) именно и только этим геном.

При полиплоидизации наряду с другими структурами удваивается число центриолей. В результате возможны мультиполярные митозы с неравным расхождением хромосом. В норме анеуплоидия редка (Duncan et al., 2012; Knouse et al., 2014), в опухолях обычна.

КЛЕТОЧНАЯ ПОЛИПЛОИДИЯ В ОПУХОЛЯХ

Злокачественные опухоли образуются, как правило, в диплоидных тканях — в легких, прямой кишке, пищеводе. По мере роста опухоли образуются полиплоидные клетки. Стимуляция делений в дифференцированных клетках поддерживает идею конкурентных отношений пролиферативных и тканеспецифических синтезов (см. выше). Но в опухолях могут преобладать аберрантные митозы с нарушенным геномом полиплоидных клеток. Поэтому полиплоидия может характеризовать состояние опухоли и прогнозировать течение болезни (Lothschütz et al., 2002; Olaharski et al., 2006; Dewhurst et al., 2014; Bielski et al., 2018). Фундаментальный факт: ключевые механизмы биологии стволовых и прогениторных клеток — общие в эмбриогенезе и в канцерогенезе печени (Lee et al., 2006; Krüger, 2015). Выявлено сходство регуляторных путей в эмбриональном развитии и в прогрессии гепатокарциномы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы выявления клеточной полиплоидии (цитофотометрия ДНК, проточная цитофлуорометрия, изучение изолированных клеток с подсчетом двуядерных и многоядерных) в последние годы принципиально не изменились. Не претерпела существенных изменений и концепция, согласно которой полиплоидия является альтернативной стратегией обеспечения роста, регенерации тканей, а также снижения рисков их заболеваний и дисфункции. Поэтому выводы работ второй половины прошлого века, обобщенные в книге, изданной в Кембридже (Brodsky, Uryvaeva, 1985), остаются основными до настоящего времени и являются следующими:

1) Клеточная полиплоидия — общебиологическое явление, один из распространенных способов роста, развития и регенерации тканей животных. Полиплоидия может быть способом дифференцировки клеток. Так, мегакариоциты начинают функционировать только с октаплоидного состояния. Гигантские нейроны моллюсков функционируют высоко политенными.

2) Полиплоидизация — результат незавершенного обычного митоза. Обычная причина — конкуренция процессов пролиферации и дифференцировки, а на уровне генома по новым данным — нарушения метаболизма циклин-зависимых киназ, некоторых других митотических киназ (AURORA), транскрипционных факторов Ect2, E2F, некоторых регуляторных белков (p53, ламинин, септин), а также компонентов сигнального пути Hippo. В опытах с трансплантатами миокарда экспериментально обоснована программа на время остановки митозов.

3) Полиплоидия необратима.

4) Миокард исследованных млекопитающих, включая человека, полиплоидный орган с высокой индивидуальной вариабельностью числа одноядерных и двуядерных полиплоидных кардиомиоцитов. В опытах с изменением питания мышей в первые недели после рождения экспериментально обоснованы причины вариабельности как условия жизни в раннем постнатальном онтогенезе.

5) Единственный способ роста миокарда в онтогенезе у крысы и мыши с 21-го дня после рождения, у человека с 9–12 лет — увеличение массы цитоплазмы миоцитов. В отличие от других изученных полиплоидных клеток млекопитающих, масса полиплоидных кардиомиоцитов не соответствует дозе генов; кардиомиоциты дорастают до нормальной для генома массы после тяжелых повреждений сердца (инфаркта) как первая фаза компенсаторной гипертрофии; чем более полиплоидный миокард (что произошло в детстве), тем больше резерв роста при гипертрофии.

Положительные эффекты полиплоидизации клеток можно видеть в следующем.

Полиплоидный геном устойчивее диплоидного. Разрушение аллельной пары в наборе приводит к гибели диплоидной клетки в митозе, а полиплоидная клетка выживает за счет целых хромосом другого набора. Первым это положение обосновал Б.Л. Астауров (Тульцева, Астауров, 1958), сравнив устойчивость к радиации диплоидов и полиплоидов тутового шелкопряда. То же показали В.В. Сахаров и соавт. (1960), обнаружив большую устойчивость тетраплоидов гречихи к радиации, сравнительно с диплоидами. Во многих исследованиях выявлена защищенность полиплоидных клеток in vitro и in situ. Проблема рассмотрена В.А. Струнниковым и соавт. (1982). Алкилирующий препарат дипин вызывал огромное количество хромосомных аберраций в регенерирующей печени мыши; при этом сохранялись лишь высокоплоидные клетки (Урываева, Фактор, 1982). Полиплоидные клетки яичника дрозофилы устойчивы к радиации, тогда как диплоидные гибнут (Mehrotra et al., 2008; Hassel et al., 2014).

Поскольку полиплоидная клетка крупнее и активнее диплоидной, полиплоидия способствует сокращению числа клеток в органе. Тем самым облегчается регуляция функций миокарда, синхронизация сокращений мышцы. На модели синхронно работающего сердца И.М. Гельфандом и М.Л. Цетлиным (1960) разработана первая математическая модель прямых межклеточных взаимодействий при синхронизации функций. Прекращение митозов важно для функции органа, работающего синхронно. Существенно для функции миокарда и прекращение профазной деструкции миофибрилл. Сначала в онтогенезе блокируются деления миоцитов, затем и неполные (полиплоидизирующие) митозы.

Двуядерность клеток, а их более половины от всей численности кардиомиоцитов у изученных млекопитающих, а также гепатоцитов у некоторых видов, может влиять на ядерно-цитоплазматические отношения. Особенно существенно это может проявляться в четырехъядерных 2с + 2с + 2с + 2с клетках, сравнительно с одноядерными октаплоидными клетками.

Несоответствие постмитотического роста цитоплазмы дозе генов создает резерв гипертрофии при тяжелой патологии сердца. Первая фаза гипертрофии — нормальное дорастание кардиомиоцитов до двойной массы. В этом случае очевидно преимущество полиплоидии. Возможно, и это является задачей будущих исследований, высокоплоидный миокард, сложившийся в детстве, полноценнее реагирует на инфаркт (компенсацию функций сердца) за счет первой фазы гипертрофии.

Использование методов биоинформатики (Pandit et al., 2013) показало, что на полиплоидию не реагируют гены гепатоцитов (структурно и функционально), а из многих тысяч генов мегакариоцитов и эндотелия — лишь единичные. Еще на одном уровне определена полноценность полиплоидии для биологии клеток.

Таким образом, наш обзор данных о клеточной полиплоидии и особенно полиплоидизации миокарда и печени млекопитающих обобщает базовые данные, что необходимо для продвижения современных исследований с использованием подходов молекулярной биологии.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим сотрудников Института биологии развития РАН В.М. Фактор, А.М. Арефьеву, Т.Л. Маршак и сотрудников Института цитологии РАН О.В. Анацкую, Е.В. Байдюк, Т.Г. Зыбину, Г.А. Сакута и Алма-Атинского университета Т.М. Шалахметову, а также сотрудника Мичиганского университета Б. Карлсона — соавторов наших работ.

Признательны В.В. Терских, Э.Н. Григорян и А.В. Васильеву за существенные замечания по тексту статьи.

С печалью и уважением мы вспоминаем покойных И.В. Урываеву, М.В. Кудрявцеву, Г.В. Делоне и С.А. Комарова — исследователей феномена клеточной полиплоидии и, в частности, полиплоидии в миокарде и в печени.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа входит в тему № 4 НИР ИБР РАН, номер ГЗ 0088-2021-0016, номер НИОКТР АААА-А21-121011490124-0.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проекта № 21-73-20264).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве лабораторных объектов.

作者简介

V. Brodsky

Koltzov Institute of Developmental Biology, RAS

Email: brodsky.idb@bk.ru
俄罗斯联邦, Vavilov Str., 26, Moscow, 119334

B. Kudryavtsev

Saint-Petersburg State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: brodsky.idb@bk.ru
俄罗斯联邦, University Ave, 26, St Petersburg, 198504

N. Bezborodkina

Zoological Institute, RAS

Email: Natalia.Bezborodkina@zin.ru
俄罗斯联邦, Universitetskaya Emb., 1, St Petersburg, 199034

参考

补充文件