Effect of hypernatremia on protein reabsorption in renal proximal tubules of the lake frog Pelophylax ridibundus

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Основные механизмы регуляции водно-солевого баланса и эпителиального канальцевого транспорта, действующие в почках амфибий, во многом сходны с таковыми у млекопитающих. Это позволяет использовать амфибий в качестве экспериментальных моделей для изучения физиологических процессов, действующих в почках позвоночных животных, включая фундаментальные и эволюционные аспекты [1]. Как известно, реабсорбция белков в почке происходит в проксимальных канальцах нефронов. Согласно установленному рецептор-опосредованному клатрин-зависимому пути [2–4], эндоцитоз белка начинается с его взаимодействия с рецепторами (мегалином и кубилином) на апикальной плазматической мембране и интернализации этого комплекса в составе эндоцитозных везикул при участии клатрина и адаптерных белков. После распада лиганд-рецепторного комплекса в эндосомах и рециклинга рецепторов на апикальную мембрану осуществляется последующий везикулярный транспорт абсорбированных макромолекул и их утилизация в лизосомах. Основным рецептором, вовлеченным в захват и внутриклеточный транспорт белков, является мегалин – гигантский трансмембранный белок, принадлежащий к семейству рецепторов липопротеинов низкой плотности [4–7]. Присутствие мегалина на апикальной мембране эпителиоцитов служит четким критерием для идентификации проксимальных канальцев в срезах почек [8]. У млекопитающих, рыб и амфибий установлена идентичность молекулярных механизмов эндоцитоза белка [8–11]. В исследованиях на лягушках нами было показано участие рецепторов мегалина (мегалин/lrp2) и кубилина в захвате зеленого и желтого флуоресцентных белков (GFP и YFP), лизоцима и альбумина [11–13].

В проксимальных канальцах почек амфибий одновременно с профильтрованными белками реабсорбируется от 20 до 45 % Na⁺ и Cl^–, основных ионов плазмы крови [14]. В структурах почки разными методами идентифицированы основные транспортные белки, участвующие в перемещении Na⁺ и Cl^– [15]. В то же время мало что известно об их локализации и функциональной роли в клетках проксимальных канальцев, в отличие от дистальных сегментов нефрона и собирательных трубок, в которых на апикальной мембране эпителиоцитов имеются эпителиальный натриевый канал и Na⁺/H⁺-обменник [16–19]. Некоторые белки семейства генов хлоридных каналов клонированы у лягушек рода Xenopus, в том числе хлоридные каналы xClC-5 и xClC-3 [20] с идентичностью 78–90 % в сравнении с аналогичными каналами млекопитающих и человека, ClC-5 и ClC-3. Однако их функциональную экспрессию изучали преимущественно в ооцитах Xenopus или в клеточных линиях млекопитающих [21]. В то же время установлено, что у млекопитающих и человека хлоридные каналы участвуют в процессе эндоцитоза белка в проксимальных канальцах. От функционирования ClC-3 и ClC-5 зависит величина pH в эндоцитозных везикулах и эффективность гидролиза белка в лизосомах [21–23]. У мышей с нокаутом гена канала ClC-5, а также у пациентов с болезнью Дента, обусловленной мутацией этого гена, происходит ингибирование эндоцитоза белка в проксимальных канальцах [24].

Существующие у амфибий механизмы осморегуляции позволяют этим животным успешно адаптироваться к повышению солёности среды, при этом в крови существенно возрастает концентрация Na⁺, Cl^– и мочевины [25–27]. Имеются также данные о повышении осмоляльности крови и мочи у амфибий при парентеральном введении гипертонического раствора NaCl [26, 28–30]. В наших недавних исследованиях установлено, что у озерных лягушек в ответ на введение 0.75 M NaCl не только увеличивается осмоляльность крови и концентрации в ней Na⁺ и Cl^–, но также повышаются диурез, осмоляльность мочи и экскреция Na⁺ и Cl^– почками [31]. Таким образом, несмотря на отсутствие в нефронах амфибий петель Генле и, соответственно, механизма осмотического концентрирования мочи, продемонстрировано усиление осмо- и ионорегулирующей функции почек после инъекций NaCl. Одновременно методом иммунофлуоресцентной микроскопии установлено увеличение количества ClC-5, локализованного в эпителиоцитах проксимальных канальцев [31].

Исходя из сопряженности процессов реабсорбции белка в проксимальных канальцах и транспорта ионов в этом отделе нефрона, а также роли хлоридных каналов на разных этапах эндоцитоза, возникает вопрос о связи канальцевой реабсорбции белка с повышением концентрации в крови осмотически активных веществ. Целью исследования явилось изучение реабсорбции белка в почках лягушек в физиологической модели изменений водно-солевого баланса. В задачи работы входила оценка эффекта инъекций гипертонического раствора NaCl на реабсорбцию различных белков в почках озерных лягушек, а также динамики белкового транспорта в процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза в эпителиоцитах проксимальных канальцев методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Озерные лягушки, Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771), были отловлены в Астраханской области и в периоде гибернации содержались в холодильной камере ЭБК ИЭФБ РАН при температуре 4 °C, в пластиковых контейнерах с водой. Опыты проводили с декабря до середины апреля. Перед экспериментами, животных помещали в индивидуальные контейнеры, заполненные водой до уровня 1–2 см, адаптировали к комнатной температуре в течение 1 ч и взвешивали. Масса тела лягушек, преимущественно самцов (64 %), составляла 96 ± 4 г (n = 28) при отсутствии достоверных различий между самцами и самками, а также лягушками контрольных и опытных серий. Все инъекции лягушкам осуществляли подкожно, в спинной лимфатический мешок. Изотонический 0.01 М фосфатно-солевой буфер (PBS) использовали для растворения вводимых веществ (осмоляльность 200 мОсм/кг H₂O, pH 7.4). Для моделирования гипернатриемии животным инъецировали 0.75 М NaCl в дозе 100 мкл/30 г массы тела, контрольным лягушкам вводили PBS в таком же объеме. Через 1 ч в контроле и опыте вводили маркерные белки в дозе 18 мкг/100 мкл/30 г массы тела для тестирования реабсорбции в проксимальных канальцах. В разных сериях использовали зеленый или желтый флуоресцентные белки (GFP, YFP, Институт белка, РАН, Пущино-на-Оке, Россия), а также лизоцим (Sigma Aldrich Inc., США). Через 20 мин после введения белка лягушек обездвиживали, разрушая спинной мозг с помощью препаровальной иглы, быстро извлекали почки для дальнейшей препаровки и фиксации образцов и проводили эвтаназию путем декапитации.

Образцы ткани почек фиксировали в 4 % растворе параформальдегида и обрабатывали, как описано ранее [13]. Срезы (толщиной 5–7 мкм) из разных частей почки получали в криостате CM 1510 (Leica Microsystems, Germany). В иммуногистохимических исследованиях применяли кроличьи поликлональные антитела к лизоциму (Abcam, США) в разведении 1:200 и мышиные моноклональные антитела к мегалину/LRP2 (MyBioSourse, США; Acris, Origene Technologies, США) в разведении 1:1000, а также флуоресцентные конъюгаты козьих антикроличьих и обезьяньих антимышиных иммуноглобулинов (IgGs) c Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 568 в разведении 1:500 (Invitrogen, Molucular Probes, США), согласно описанному ранее протоколу [11]. Срезы монтировали на предметные стекла, заключали в мовиол и изучали в конфокальном микроскопе DMI 6000 с лазерной приставкой Leica SP II (Leica Microsystems, Германия), используя объектив 40x. В режиме лазерного сканирования использовали спектры возбуждения с длинами волн 488, 513 и 568 нм, регистрируя в различных частях спектра свечение Alexa Fluor 488 и GFP (500–520 нм), YFP (515–550 нм) и Alexa Fluor 568 (590–650 нм), соответственно. Последовательное сканирование в этих каналах и проходящем свете осуществляли при одних и тех же настройках микроскопа.

Изображения анализировали, пользуясь программой ImageJ (http://rsb.info.nih.gov). В надгломерулярной зоне почек подсчитывали относительное число профилей проксимальных канальцев со свечением GFP, YFP или иммунофлуоресценцией лизоцима (% к общему числу мегалин-позитивных проксимальных канальцев), используя 20 изображений для каждой лягушки. В отдельных канальцах, выбранных случайным образом (30 проксимальных канальцев для каждой особи), определяли интенсивность флуоресцентного сигнала (оптическую плотность, в условных единицах (усл. ед.)) в надъядерной области клеток эпителиального слоя, включая апикальную и субапикальную цитоплазму. На совмещенных изображениях визуализировали свечение белка (зеленое), рецептора (красное), а также колокализованное свечение (желто-оранжевое). Для количественной оценки соотношения этих сигналов использовали плагин (http://sibarov.ru/index.php?slab=software) для программы ImageJ. Для каждой пары изображений, полученных в красной и зеленой спектральной области, создавали точечные диаграммы, на которых значения интенсивности пикселей на первом изображении отложены по оси X, а значения соответствующих пикселей на втором изображении – по оси Y. Автоматически рассчитывали количество пикселей со свечением в красной и зеленой области спектра, а также пикселей с перекрытием сигналов относительно общего числа светящихся пикселей с интенсивностью сигнала выше эмпирически установленного порога (75 усл. ед.). Используя 20 пар изображений для каждой лягушки, определяли общее количество пикселей со свечением абсорбированного белка и процентное соотношение колокализованного и неколокализованного белка. Данные предварительно проверяли на соответствие закону нормального распределения (тест Шапиро–Уилка). Основные показатели представляли как медиану с верхним и нижним квартилем [Me (Q1; Q3)], в отдельных случаях – в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± SEM). Для сравнения независимых групп данных использовали T-критерий Манна–Уитни, различия считали статистически значимыми при p < 0.05. Для расчетов и статистической обработки данных пользовались программами ImageJ и Microsoft Office Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На совмещенных изображениях представлен паттерн реабсорбции GFP, YFP или лизоцима в эпителии проксимальных канальцев почек через 20 мин после инъекции (рис. 1). Введенные белки были визуализированы в многочисленных мегалин-позитивных проксимальных канальцах (рис. 1a–c). В почках отдельных контрольных лягушек относительное количество канальцев со свечением флуоресцентных белков было в пределах 60–90 % для GFP и 71–81 % для YFP, а метка к лизоциму присутствовала в 88–94 % канальцев. Мегалин выявлялся в апикальной зоне эпителиоцитов, где частично был колокализован с поступившим в клетки белком, а не связанный с рецептором белок присутствовал в апикальной цитоплазме и более удаленных от люминальной мембраны областях (рис. 1). Значительное число эндоцитозных везикул, содержащих GFP или лизоцим хорошо видно при большем увеличении (рис. 1d, e). Зона колокализации белка с рецептором наиболее отчетливо выявлялась после введения лизоцима (рис. 1c, e, f). Метка к лизоциму, преимущественно везикулярная в контроле (рис. 1д), после инъекции 0.75 М NaCl была в значительной мере диффузной и часто присутствовала в щеточной каемке эпителиоцитов (рис. 1f). Предварительное введение 0.75 М NaCl привело к снижению процента профилей канальцев с меткой к лизоциму и не повлияло на распределение GFP и YFP в проксимальных канальцах (табл. 1).

 

Рис. 1. Реабсорбция GFP, YFP и лизоцима (Lysosyme) в иммунопозитивных к мегалину (megalin) проксимальных канальцах почек у озерных лягушек. (a–f) – профили проксимальных канальцев в контроле (a–e) и после предварительного введения NaCl (f). Сигналы: мегалин-Alexa 568 – красный, GFP, YFP и лизоцим-Alexa 488 – зелёный и колокализованное свечение – желто-оранжевый. Видно присутствие белков в большинстве мегалин-позитивных канальцев (a–c), образование многочисленных GFP-содержащих везикул (d), везикулярное и диффузное свечение лизоцима (e, f) и аккумуляция лизоцима в щёточной каемке эпителиоцитов (f). Конфокальная микроскопия, совмещённые изображения. Калибровка: 50 мкм.

 

Таблица 1. Реабсорбция различных белков в проксимальных канальцах почек у озерных лягушек

Введенный белок	Число канальцев с реабсорбированным белком через 20 мин после инъекции (в % к мегалин-позитивным канальцам)
	Контроль		Опыт
	Me (Q1; Q3)	n	Me (Q1; Q3)	n
GFP	74.9 (67.3; 75.2)	7/140/2209	78.5 (70.1; 81.9)	6/120/1776
YFP	73.7 (72.3; 77.5)	3/60/759	71.9 (71.3; 73.3)	4/80/1078
Лизоцим	89.5 (88.9; 90.8)	4/80/1210	80.7 (78.7; 82.7)*	4/80/1442

Примечание: изотонический PBS (в контроле) и 0.75 М NaCl (в опыте) введены за 1 ч до инъекции белка. Достоверность различий по сравнению с контролем: ^* – p < 0.05 (Т-критерий Манна–Уитни); n – количество лягушек/изображений/канальцев.

 

При определении интенсивности флуоресценции GFP, YFP или лизоцима в апикальной зоне эпителиоцитов проксимальных канальцев у лягушек контрольных и опытных серий установлено достоверное снижение оптической плотности сигналов для каждого из введенных белков после предварительной инъекции NaCl (рис. 2).

 

Рис. 2. Снижение реабсорбции GFP, YFP и лизоцима (Lysozyme) в проксимальных канальцах почек лягушек после предварительного введения NaCl. По оси ординат: интенсивность флуоресценции у отдельных лягушек (усл. ед.), слева – GFP (кружки) и YFP (треугольники), справа – лизоцима (ромбы); светлые значки – контроль (Control), темные значки – после инъекции 0.75 М NaCl; черная черта – медиана. Достоверность различий по сравнению с контролем: ^* – p < 0.05, ^** – p < 0.01 (Т-критерий Манна–Уитни).

 

Автоматизированный анализ изображений позволил сопоставить процент колокализации сигналов белка и мегалина в контроле и на фоне инъекций NaCl. В качестве примера приведен результат оценки эндоцитоза GFP (рис. 3). На совмещенном изображении (рис. 3а) видно преобладание в контроле зеленого сигнала GFP, а желто-оранжевого свечения (колокализованных сигналов GFP и мегалина) мало. На точечной диаграмме, представляющей распределение светящихся пикселей (рис. 3b), видно, что желто-оранжевых точек, соответствующих колокализации белка и рецептора, значительно меньше по сравнению с зелеными (в данном случае – 7 % и 54 % соответственно, относительно общего числа светящихся пикселей). После предварительного введения NaCl колокализованного свечения становится значительно больше, что видно на изображении (рис. 3c), и на точечной диаграмме (рис. 3d) преобладают пиксели с перекрытием сигналов по сравнению с сигналом только GFP (18 % и 6 % соответственно). Заметим, что абсолютное количество точек каждого цвета значения не имело, поскольку зависело от конкретного числа присутствующих на изображениях профилей проксимальных канальцев со свечением белка и мегалина. Для нас представляло интерес соотношение числа пикселей со свечением только белка и белка, колокализованного с рецептором. Если суммарное количество пикселей со свечением GFP принять за 100 %, то получается, что на первом изображении (рис. 3a) количество колокализованного белка составляет всего 12 %, а на втором (рис. 3c) – 74 %. Подобный расчет был применен ко всем сериям опытов с введением GFP, YFP и лизоцима. Установлено, что процент колокализации каждого из абсорбированных белков с мегалином достоверно увеличился под влиянием NaCl (рис. 4a). Соответственно, существенно изменилось соотношение колокализованного и неколокализованного белка в пользу первого (рис. 4b).

 

Рис. 3. Примеры автоматизированной количественной оценки и визуализации колокализованных флуоресцентных сигналов. (a) – GFP (зеленый), мегалин (красный) и колокализация сигналов (желто-оранжевый) в эпителии проксимальных канальцев в контроле. Конфокальная микроскопия, совмещенные изображения. Калибровка: 50 мкм. (b) – точечная диаграмма для изображения, представленного на (a). По оси абсцисс и ординат: интенсивность флуоресценции пикселей в красной и зеленой областях спектра, соответственно (в усл. ед.). Пиксели с перекрытием сигналов окрашены в желто-оранжевый цвет; пунктирные линии – пороги, отделяющие видимую флуоресценцию от темных пикселей. (c) и (d) – то же, что (a) и (b) для варианта с введением 0.75 М NaCl. Видно увеличение колокализации обоих сигналов по сравнению с контролем.

 

Рис. 4. Влияние инъекций 0.75 M NaCl на реабсорбцию и внутриклеточный транспорт GFP, YFP и лизоцима (Lysozyme) в проксимальных канальцах почек озерных лягушек. (а) – оценка колокализации введенных белков с мегалином в эпителии канальцев. По оси ординат: колокализованный белок (в % к общему количеству реабсорбированного белка) у отдельных лягушек (кружки) в контроле (Control) и после инъекции 0.75 M NaCl. Черная линия – медиана. (b) – соотношение колокализованного белка (темные столбцы) и неколокализованного белка (светлые столбцы) в тех же экспериментах. Данные представлены в виде M ± SEM. Достоверность различий на (а) и (b): * – p < 0.05, ** – p < 0.01 по сравнению с контролем (T-тест Манна–Уитни).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В контрольных экспериментах паттерны мегалина, GFP, YFP и лизоцима в проксимальных канальцах почек не отличались от детально изученных ранее у амфибий [11–13] и были аналогичны таковым в эпителии проксимальных канальцев млекопитающих [32, 33]. Ранее было установлено, что введение 0.75 М NaCl озерным лягушкам приводит к гипернатриемии [31]. Как показало настоящее исследование, паттерн реабсорбции белков в проксимальных канальцах в этих условиях существенно не отличался от такового в контроле, за исключением снижения числа профилей канальцев, иммунопозитивных к лизоциму. В то же время установлено достоверное снижение интенсивности сигналов GFP, YFP и лизоцима, т. е. количества реабсорбированных белков. Наряду с этим изменялась динамика внутриклеточного транспорта в процессе эндоцитоза. После инъекции NaCl существенно возрастал процент колокализация белка с мегалином и снижалось относительное количество неколокализованного белка, т. е. белка в составе везикул (эндосом/лизосом), образовавшихся после распада белок-рецепторного комплекса и переместившихся из апикальной цитоплазмы в надъядерную и перинуклеарную зоны. Эти данные свидетельствуют о замедлении внутриклеточного транспорта белков. Эффект NaCl был установлен как для флуоресцентных белков, так и для лизоцима. Более того, установленный процент неколокализованного лизоцима можно считать даже заниженным, т. к. в его автоматизированный расчет попадала флуоресценция белка, не успевшего поступить в эпителиоциты и задержавшегося в зоне щеточной каемки. Как известно, процессы распада белок-рецепторного комплекса, рециклинга рецепторов и дальнейшего поступления белка в поздние эндосомы являются необходимыми этапами белкового трафика. От скорости этих процессов зависят аккумуляция и гидролиз белка в лизосомах с последующим использованием продуктов распада для пластического обмена и, таким образом, клиренс белка в организме. Выявленное на фоне гипернатриемии замедление эндоцитозного транспорта рассматривается нами как один из существенных факторов снижения абсорбционной способности клеток канальцев.

Имеются основания полагать, что наблюдаемое снижение реабсорбции белков является следствием существенных изменений водно-солевого баланса и тока ионов в составе канальцевой жидкости. Об этом свидетельствуют опубликованные ранее результаты инъекции 0.75 M NaCl на ионо- и осморегулирующую функции почек у озерных лягушек [31], которые соответствовали характерным лабораторным признакам гипертонической гипергидратации у человека. Так, через 60–80 мин после этого воздействия достоверно увеличивались осмоляльность сыворотки крови и содержание в ней Na⁺ и Cl^– по сравнению с контролем, и аналогичные изменения наблюдались в моче. При этом отмечено усиление диуреза, скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и экскреции Na⁺, К⁺ и Cl^–. Реабсорбция в почках профильтровавшейся жидкости и растворенных в ней веществ имеет большое значение для поддержания водно-солевого гомеостаза. Согласно представлениям о гломеруло-тубулярном балансе, существует прямая, почти линейная зависимость между изменением СКФ и реабсорбцией веществ в проксимальном канальце [34]. При умеренном повышении прохождения белков через клубочковый фильтр повышается как экскреция белков с мочой, так и канальцевая реабсорбция [35–37]. В то же время щелевые диафрагмы могут оказывать существенное сопротивление чрезмерному увеличению СКФ, что снижает поступление белка в ультрафильтрат, в отличие от потока жидкости [38]. Кроме того, предлагаемые модели зависимости реабсорбции белка от СКФ и тока жидкости в канальцах касаются, главным образом, альбумина, но не низкомолекулярных белков, а четких представлений о зависимости реабсорбции белка в проксимальных канальцах от гидродинамики канальцевой жидкости не имеется.

Ранее нами было продемонстрировано снижение захвата свободно фильтруемых GFP и лизоцима в проксимальных канальцах почек травяных и озерных лягушек под влиянием аргинин-вазотоцина, способного снижать СКФ, действуя опосредованно через V1-подобные рецепторы прегломерулярных сосудов [39]. В настоящей работе выявлено уменьшение реабсорбции введенных белков в совершенно иных условиях, поскольку предварительно было показано, что инъекции 0.75 М NaCl приводят к увеличению СКФ [31]. Таким образом, нет ясности в механизмах, лежащих в основе выявленных нами изменений в захвате и внутриклеточном транспорте введенных белков. Имеются данные о том, что в норме эндоцитоз белка и контроль апикальной экспрессии аквапорина 1 в почках у мышей зависят от сопряженного функционирования мегалина и ClC-5 [40].

В наших исследованиях введение NaCl лягушкам повышало иммунофлуоресценцию ClC-5 в эпителии проксимальных канальцев без изменений паттерна и величины сигнала мегалина [31]. Известно, что белки семейства CLC представляют собой потенциал-зависимые хлоридные каналы плазматической мембраны и везикулярные Cl^–/H⁺-обменники [21]. В эпителиальных тканях эти белки вовлечены в различные процессы, включая эпителиальный транспорт, эндоцитоз, поддержание кислотно- щелочного баланса и регуляцию объема клеток [20, 21]. Полагают, что в клетках проксимальных канальцев ClC-5 обеспечивает электрическое шунтирование, необходимое для подкисления эндосом и разобщения лиганд-рецепторного комплекса, и нарушением этого процесса объясняют протеинурию при болезни Дента [41].

В эпителиоцитах проксимальных канальцев ClC-5 присутствует непосредственно под апикальной мембраной, преимущественно в ранних эндосомах, где он колокализуется с абсорбированными белками и протонным насосом [22, 42, 43]. Возможно, в меньшем количестве ClC-5 присутствует в мембране микроворсинок [42]. В наших исследованиях на озерных лягушках ClC-5 был выявлен в везикулах апикальной и субапикальной цитоплазмы клеток проксимальных канальцев [31], и можно допустить, что у амфибий ClC-5 в эндоцитозных везикулах действует так же, как у млекопитающих. Инъекции 0.75 М NaCl приводили к появлению сигнала ClC-5 в виде яркой узкой полосы флуоресценции непосредственно под щеточной каемкой эпителиоцитов [31]. Возможно, рецепторный захват белка является триггером транспорта ClC-5 из везикулярного компартмента субапикальной цитоплазмы и надъядерной области эпителиоцитов в зону апикальной мембраны. Таким образом, у лягушек в условиях гипернатриемии можно констатировать повышение количества ClC-5 и его аккумуляцию вблизи цитоплазматической мембраны эпителиальных клеток. С другой стороны, в настоящем исследовании гипернатриемия приводила к снижению реабсорбции и замедлению транспорта белка, значительная часть которого задерживалась в апикальных эндосомах вместе с мегалином. Можно полагать, что участие ClC-5 в процессе эндоцитоза белка в условиях гипернатриемии снижается, несмотря на установленное увеличение его количества в эпителиоцитах, стимулом к которому могло быть повышение содержания Na⁺ и Cl^– в просвете канальцев.

К сожалению, пока неизвестно, как в условиях гипернатриемии изменяется транспорт Na⁺, Cl^– и воды в люминальной мембране, что может влиять на характер функционирования ClC-5. Установлено, что ClC-5 является везикулярным 2Cl^–/H⁺-обменником [21], но до конца не понятно, как этот антипорт способен нейтрализовать протонный насос, поскольку обеспечивает отток Н⁺ во время АТФ-зависимого подкисления эндосом. Существует мнение о том, что функции ClC-5 гораздо шире простого шунтирования протонного насоса, и ClC-5 может участвовать в механизмах модуляции проницаемости и электрического заряда мембран везикул [21, 44]. Предполагается, что нарушение эндоцитоза при болезни Дента является результатом не только снижения подкисления эндосом [22], оно может быть связано с “разобщением” градиентов Cl^– и H⁺ в цитозоле и везикулах [45].

Согласно представленным результатам и изученным ранее эффектам введения гипертонического раствора NaCl на содержание в крови Na⁺ и Cl^–, а также на ионо- и осморегулирующую функции почек у лягушек [31] мы считаем, что проявлением адаптивной реакции организма лягушек на уровне проксимальных канальцев почек прежде всего будут изменения транспорта воды и ионов в эпителиоцитах. Можно полагать, что в условиях гипернатриемии включаются механизмы гомеостатической регуляции, противодействующие внутриклеточной дегидратации и направленные на восстановление осмотического равновесия и объема клеток, а процесс реабсорбции белков приобретает второстепенное значение, что проявляется в снижении захвата и замедлении везикулярного транспорта белков.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея, планирование и дизайн экспериментов (Н.П.П., Е.В.С.), проведение опытов и сбор первичных данных (Н.П.П., Е.В.С.), иммуногистохимические исследования и конфокальная микроскопия (Е.В.С.), конфокальная микроскопия, анализ изображений и статистическая обработка данных, подготовка иллюстраций (Н.П.П.), написание и редактирование текста рукописи (Н.П.П., Е.В.С.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утверждённым правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и одобрены комиссией по биоэтике ИЭФБ РАН (протокол № 11-1/2022 от 24.11.2022).

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках государственного задания № 075-00264-24-00 на базе Центра коллективного пользования ИЭФБ РАН (ЦКП ИЭФБ РАН).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны Д.А. Сибарову за консультативную помощь в использовании программного модуля для обработки изображений.

Авторлар туралы

N. Prutskova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry RAS

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: natprut@yandex.ru
Ресей, St.-Petersburg

E. Seliverstova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry RAS

Email: natprut@yandex.ru
Ресей, St.-Petersburg

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар