Calendula officinalis (Asteraceae) as a radiosensitizer in radiotherapy of tumors

Толық мәтін

Календула лекарственная, или ноготки лекарственные (Calendula officinalis L.) – травянистое растение семейства Сложноцветные или Астровые (Asteraceae), традиционно используемое для лечения различных заболеваний кожи и слизистых. Изучение химического состава C. officinalis впервые начато в конце XIX в. с исследования красящих пигментов цветков C. officinalis, однако регулярными исследования метаболитов этого вида и рода стали только во второй половине ХХ в. К настоящему времени идентифицировано 529 соединений, выделенных из C. officinalis [1]. Наиболее часто в фармакологии и косметологии используют цветки C. officinalis, поэтому они являются наиболее изученной частью (определено 403 соединения); в листьях, корнях и семенах обнаружено 138 соединений.

В настоящее время C. officinalis применяется в составе косметических средств [2], ранозаживляющих средств наружного применения [3, 4], а также используется в качестве противовоспалительного [5] и противомикробного средства при простудных заболеваниях, гепато- и рено-протектора [6, 7]. Современные исследования подтверждают, что экстракт C. officinalis улучшает заживление острых ран, обеспечивая более быстрое разрешение фазы воспаления с увеличением образования грануляционной ткани в испытуемых группах, получавших препарат C. officinalis, а также ускорение эпителизации и образование более мягкого рубца по сравнению с контрольной группой [8, 9]. Имеются данные об успешном использовании экстракта C. officinalis для предотвращения острого постлучевого дерматита [10–12], а также для предотвращения метастазирования меланомы в опытах на мышах [13, 14]. Описание свойств C. officinalis привлекло к ней наше внимание как к возможному компоненту наружного средства для радиотерапии кожных новообразований, способствующему уменьшению радиационных ожогов и ускоряющему заживление [15, 16]. Исследование антиоксидантных свойств настойки C. officinalis позволяло предположить радиопротекторные свойства, однако изучение эффектов настойки C. officinalis на опухолевых клеточных культурах в сочетании с γ-излучением в терапевтических дозах показало хороший радиосенсибилизирующий эффект. Также радиосенсибилизирующий эффект подтвердился in vivo на перевиваемой меланоме мыши B16 (ФИД = 0.57).

В данном исследовании впервые изучен экстракт C. officinalis как потенциальный радиосенсибилизатор для терапии злокачественных опухолей, что, в сочетании с регенеративным и ранозаживляющим потенциалом препарата, может повысить эффективность радиотерапии и снизить риск побочных эффектов – лучевых ожогов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали следующие линии клеток: А375 (меланома человека), HCT116 (аденокарцинома толстой кишки человека), HCT116p53KO (изогенная сублиния с делецией гена TP53, кодирующего проапоптотический белок p53), HCT116p21KO (изогенная сублиния с делецией гена CDKN1A, кодирующего проапоптотический белок p21). Источник клеточных линий – ATCC, Манассас, США. Реактивы приобретены в фирме “ПанЭко”, Россия (кроме особо оговоренных случаев). Клетки культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L–глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО₂ в увлажненной атмосфере. В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста. Для профилактики микоплазменного заражения использовался препарат Plasmacin (Invitrogen, Франция).

Было исследовано несколько настоек C. officinalis от разных производителей. Все настойки произведены стандартизованно, из 100 г растительного сырья на 1 л настойки на 70% этаноле. Между настойками разных производителей не выявлено значимой разницы в биологических эффектах (данные сравнения настоек не приведены).

Измерение антиоксидантной активности проводили в этилбензоле при 60°С. Эта система требует отсутствия следов воды, поэтому для исследования к 27 мг вещества было добавлено 0.3 мл этанола. Это не привело к полному растворению, но часть вещества перешла в раствор, что позволило провести оценку наличия антиоксидантов в настойке. Максимальный объем спиртовой пробы составил 0.05 мл на общий объем реакционной смеси, равный 4.5 мл (реакционная смесь). Ингибирующее действие содержащихся в настойке C. officinalis веществ изучали волюмометрическим методом в модельной реакции окисления этилбензола (333 К), инициированного динитрилом азаизомасляной кислоты, скорость инициирования составляла W_i = 5 × 10^–8 моль/л с.

Этилбензол химически чистый перегоняли над металлическим натрием. Реакционную смесь этилбензола с инициатором предварительно термостатировали, затем вводили добавку антиоксиданта (АО). Из кинетической кривой поглощения кислорода определяли величину периода индукции (τ) по методу модельной цепной реакции [17, 18] и начальную скорость поглощения кислорода (W).

При расчете принимали, что на одной молекуле антиоксиданта обрывается один свободный радикал, т.е. это параметр f [АО], где f – стехиометрический коэффициент ингибирования, показывающий сколько радикалов гибнет на одной молекуле антиоксиданта, [АО] – концентрация антиоксиданта. Из величины периода индукции определяли содержание антиоксиданта в реакционной смеси, используя уравнение:

$f \left[AO\right] = \tau \times Wᵢ$,

где τ – величина периода индукции, Wᵢ – скорость инициирования свободных радикалов.

Значение константы скорости взаимодействия антиоксиданта с пероксильными радикалами этилбензола k₇ рассчитывали по уравнению:

$\frac{W_{О}}{W} -\frac{ W}{W_O} =\frac{ f k_7{ \left[АО\right]}_{ О}}{{(k_6 Wᵢ) }^{0.5}},$

где W_O и W – скорости окисления в отсутствие и присутствии добавок АО соответственно, k₆ – константа скорости квадратичной рекомбинации радикалов RО₂^•, равная 1.9 × 10⁷ моль/л с [19].

Анализ цитотоксичности препарата проводился при помощи стандартного МТТтеста в 96 луночных планшетах, с контролем в виде серийных разведений 70%-го этанола, соответствующих серийным разведениям исследуемого препарата. Окраску регистрировали с помощью спектрофотометра Multiskan FC (Thermofisher Scientific, США) при длине волны 540 нм.

Для облучения клетки рассеивали в логарифмической фазе в культуральные флаконы площадью 25 см² и оставляли на сутки для прикрепления и распластывания. Через сутки в часть флаконов вносили C. officinalis в выбранных разведениях. Для удобства конечную концентрацию C. officinalis в эксперименте определяли через пересчет разведения на сухое вещество, полученное после вакуумного удаления растворителя. Через 24 часа после внесения клетки облучали рентгеновским излучением на установке РУСТ М–1 (Диагностика–М, Россия) с максимальной энергией фотонов в спектре 200 кэВ в дозах 1–4 Гр, с мощностью дозы 0.85 Гр/c.

Выживаемость клеток после облучения, в том числе в присутствии C. officinalis, исследовали методом клоногенного анализа. Облученные клетки подсчитывали и методом последовательных разведений рассаживали на чашки Петри диаметром 9 см в количестве 500 клеток на чашку, при объеме среды 20 мл на чашку. Чашки с клетками инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в увлажненной атмосфере 14 дней. После этого среду аккуратно убирали, клетки фиксировали ледяным метанолом (5 мл на чашку) и инкубировали в метаноле при температуре +4°С в течении 10 мин. Затем убирали метанол, фиксированные колонии в течении 10 мин окрашивали 0.5%-ным раствором кристаллического фиолетового (5 мл на чашку), трижды промывали водой очищенной для уменьшения фона красителя и подсчитывали окрашенные колонии визуально. Число колоний в контрольных чашках, не подвергавшихся облучению, принимали за 100%, относительно него вычисляли процент колониеобразования в остальных чашках эксперимента.

Фактор изменения дозы (ФИД) – критерий, используемый при количественной оценке эффекта, обусловленного применением радиомодификаторов (протекторов или сенсибилизаторов) [19]. ФИД вычисляется по формуле ФИД = Д_оп / Д_к, где Д_оп и Д_к – дозы, вызывающие одинаковые по величине эффекты в опыте (то есть с применением радиомодификатора) и в контроле (без применения радиомодификатора). В случае определения ФИД по биологической активности величиной эффекта выбран процент выживших колоний в клоногенном анализе при различных воздействиях по отношению к контролю без воздействий. Оценку производили при помощи кривых выживания, построенных на основе результатов клоногенного анализа.

Для исследований in vivo использовали мышей самок линии С57Bl/6, массой тела 18–20 грамм, полученных из питомника “Столбовая”. Все животные были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества о состоянии здоровья. Мышей содержали в специальных, просторных клетках по 7 особей при температуре воздуха 20°–23°С и относительной влажности 60–65% в условиях естественного освещения и принудительной вентиляции на подстилке из древесных стружек, стерилизованных в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовали стандартный промышленный и сертифицированный брикетированный корм для грызунов с установленным сроком годности. Доступ к корму не ограничивался. Сырую питьевую воду, помещенную в закрытые поилки, мыши получали в неограниченном количестве. Для питья использовали поилки на 250 мл с конической пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре.

В качестве модельной опухоли была взята перевиваемая меланома мышей B16. Штамм поддерживается на мышах линии C57BL/6 подкожной перевивкой опухолевой взвеси на 16–20 сутки роста опухоли. В эксперименте использовали перевивку путем подкожного введения 0.3 мл взвеси опухолевой ткани 5 × 10⁵ клеток в растворе Хенкса. Перевиваемость опухоли составляла 100%.

Лечение начинали при уверенной пальпации опухоли на бедре, при диаметре опухоли не менее 5 мм. Для введения использовали препарат C. officinalis, высушенный и ресуспензированный в стерильном 0.9%-ном растворе хлорида натрия. Препарат вводили подкожно в холку за полчаса до облучения. Мышей фиксировали в специальных защищенных ячейках, в которых проводили локальное облучение опухоли на рентгеновской установке РУСТ М-1 (Диагностика-М, Россия). Напряжение на лучевой трубке составляло 200 кВ, мощность дозы 0.2 Гр/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наиболее распространенные лекарственные формы C. officinalis, не содержащие дополнительных действующих веществ – водно-спиртовая настойка и сухое лекарственное сырье. Для изучения нами выбрана водно-спиртовая настойка, т.к. ее производство стандартизировано, к тому же она не нуждается в дополнительной обработке и стерилизации, в отличие от сухого лекарственного сырья.

При удалении растворителя из настойки с помощью вакуумного насоса было установлено, что во всех исследованных образцах содержится 27 мг/мл “сухого” вещества C. officinalis. Из полученного “сухого” вещества растворяется в спирте 15.8 мг/мл, для полного обратного растворения необходимо снова добавлять воду до исходной концентрации.

Добавление раствора C. officinalis в этиловом спирте замедляет процесс окисления, т.е. растворимое в спирте вещество содержит антиоксиданты [16]. Из сравнения кинетических кривых (рис. 1) в отсутствие (контроль) и в присутствии C. officinalis вычислили величину τ, и далее с использованием уравнения f[АО] = τWᵢ рассчитали количество содержащегося в растворе антиоксиданта, которое составило 2.4 × 10^–5 ммоль/мл, что в пересчете на исходную настойку при f = 1 составляет 8 × 10^–5 ммоль/мл. В том случае, если f = 2 (что наиболее характерно для антиоксидантов класса фенолов), [АО] составит 4 × 10^–5 ммоль/мл.

 

Рис. 1. Кинетические кривые поглощения кислорода в отсутствие (1) и в присутствии спиртовой вытяжки Calendula officinalis (2). Этилбензол, 333 К, Wᵢ = 5 × 10 – 8 моль/л с. По горизонтали – минуты, по вертикали – V, относительные единицы.

Fig. 1. Kinetic oxygen absorption curves in absence (1) and in presence of Calendula officinalis alcoholic extract (2). Ethylbenzene, 333 K, Wᵢ = 5 × 10 – 8 mol/l s. X-axis – minutes, y-axis – V, relative units.

 

Из начальной скорости окисления в присутствии добавки настойки C. officinalis была проведена оценка величины константы скорости взаимодействия антиоксиданта с пероксильными радикалами этилбензола, которая составила k₇ = 1.1 × 10⁵ л/моль с, что сопоставимо с аналогичными константами алкилзамещенных фенолов и флавоноидов (кверцетина и дигидрокверцетина).

Ранее антирадикальную и антиоксидантную активность липидов из цветков C. officinalis, выделенных экстракцией хлороформом, изучали на моделях инициированного и автоокисления метилолеата [17]. Концентрацию АО в хлороформном липидном экстракте определили равной 4.35 × 10^–5 моль/л, что сравнимо с результатом для водно-спиртовой настойки.

 

Рис. 2. Определение цитотоксичности Calendula officinalis по отношению к четырем линиям опухолевых клеток. По горизонтали – концентрация Calendula officinalis в культуральной среде в пересчете с разведения водно-спиртовой настойки на сухое вещество, мг/мл. По вертикали – выживаемость клеток в % от контроля.

Fig. 2. Determination of Calendula officinalis cytotoxicity against four tumor cell lines. X-axis – concentration of Calendula officinalis in the culture medium, calculated with reference to dry substance, mg/ml. Y-axis – cell survival as a percentage of control.

 

В результате исследования цитотоксичности C. officinalis на четырех линиях клеток показано, что опухолевые клетки различного генеза при низких концентрациях экстракта в среде отвечают на воздействие практически одинаково (рис. 2). При концентрациях экстракта в среде более 1.2 мг/мл клетки с делецией CDKN1A приобретают преимущество в выживании, что может быть связано с отсутствием остановки клеточного цикла в ответ на воздействие. Делеция TP53 при сохранении функции CDKN1A не влияет на выживаемость клеток при воздействии экстракта C. officinalis, что указывает на р53-независимый и одновременно р21-зависимый путь гибели клеток.

 

Таблица 1. Определение радиосенсибилизирующей эффективности экстракта Calendula officinalis в различных концентрациях

Table 1. Determination of radiosensitizing effectiveness of Calendula officinalis extract in different concentrations

Концентрация вещества Substance concentration	Дозы облучения Radiation doses
	Без облучения No irradiation	1 Гр, 0,85 Гр/мин 1 Gy, 0.85 Gy/min
Без препарата Without substance	100 ± 2	96 ± 5
C. officinalis 127 мкг/мл C. officinalis 127 μg/ml	99 ± 2	49 ± 6
C. officinalis 264 мкг/мл C. officinalis 264 μg/ml	92 ± 2	47 ± 6

Примечание. Клоногенный анализ линии НСТ116 при воздействии облучения в дозе 1 Гр с предварительной обработкой в течение 24 часов экстрактом Calendula оfficinalis в двух концентрациях. Показано процентное соотношение выживших колоний к количеству колоний в контроле без воздействий (100%).

Notes. Clonogenic analysis of the HCT116 line when exposed to radiation dose 1 Gy and pretreated for 24 hours with two concentrations of Calendula officinalis. The table represents the percentage of surviving colonies to the number of colonies in the untreated control group (100%).

 

Для линии НСТ116 был проведен клоногенный анализ после облучения клеток дозой γ-излучения 1 Гр в присутствии двух различных концентраций экстракта C. officinalis, начиная с минимального нетоксичного разведения. При этом разница между сенсибилизирующими эффектами концентраций C. officinalis 127 мкг/мл и 264 мкг/мл оказалась незначительной (табл. 1), что может указывать на механизм насыщения либо пороговый эффект, при котором после преодоления порога значительное увеличение воздействия незначительно влияет на результат. Для исследования радиомодифицирующих свойств было выбрано разведение C. officinalis, не снижающее выживаемость клеток в клоногенном анализе при отсутствии облучения – 127 мкг/мл в пересчете на сухое вещество.

 

Рис. 3. Клоногенный анализ линии НСТ116 при воздействии облучения в дозе 1, 2 и 4 Гр с предварительной обработкой в течение 24 ч 127 мкг/мл Calendula officinalis. Количество колоний в контроле без воздействий взято за 100%. По горизонтали – доза облучения, по вертикали – колониеобразование, %. Синий – контроль; красный – с предварительной обработкой C. officinalis.

Fig. 3. Clonogenic assay of HCT116 line when exposed to radiation doses of 1, 2 and 4 Gy with pre-treatment for 24 hours with 127 μg/ml Calendula officinalis. The number of colonies in untreated control sample was set as 100%. X-axis – total radiation dose, y-axis – clonogenicity, %. Blue – control; red – with C. officinalis pretreatment.

 

Для выбранной концентрации был проведен клоногенный анализ на линии НСТ116 при сочетанном воздействии разных доз радиации и 127 мкг/мл C. officinalis (рис. 3). Для γ-облучения в дозе 1 Гр выживаемость колоний через 2 недели составила 96%, для γ-облучения в дозе 1 Гр в присутствии C. officinalis – 49%. Для γ-облучения в дозе 2 Гр выживаемость колоний составила 37%, в присутствии C. officinalis – 2%. Таким образом, при более высокой дозе облучения количество колоний снизилось в 18 раз. ФИД для линии клеток НСТ116 составило 0.57 (что соответствует уменьшению необходимой дозы в 1.75 раз).

Также клоногенный анализ был проведен для линий НСТ116 с делециями генов, кодирующих ключевые белки, запускающие программируемую клеточную гибель – p53 (рис. 4, 5) и p21 (рис. 6).

р53 – один из основных белков апоптотического каскада. Он активируется в ответ на повреждение ДНК и приводит к остановке пролиферации клеток или апоптозу. То есть, у поврежденных клеток появляется возможность репарировать поврежденную ДНК, либо они удаляются из популяции. Установлено, что р53 необходим для апоптоза при повреждении клетки ионизирующим излучением, однако при апоптозе, вызванном глюкокортикоидами, и при старении он не требуется. p53 выполняет функцию супрессора образования злокачественных опухолей, поэтому в клинической практике его делеция часто связана с плохими прогнозами. При этом мутации TP53 (гена, кодирующего белок p53) в зависимости от вида опухоли могут встречаться в диапазоне от 5 до 90% случаев [20]. Преодоление устойчивости опухолей к терапии, вызванной нефункционирующим p53, является одной из важных задач поиска лекарственных средств.

 

Рис. 4. Клоногенный анализ линии НСТ116p53KO при воздействии облучения в дозе 1, 2 и 4 Гр с предварительной обработкой в течение 24 ч 127 мкг/мл Calendula officinalis. Количество колоний в контроле без воздействий взято за 100%. По горизонтали – доза облучения, по вертикали – колониеобразование, %. Синий – контроль; красный – с предварительной обработкой C. officinalis.

Fig. 4. Clonogenic assay of HCT116p53KO line exposed to radiation doses of 1, 2 and 4 Gy with pre-treatment for 24 hours with 127 μg/ml Calendula officinalis. The number of colonies in untreated control sample was set as 100%. X-axis – total radiation dose, y-axis – clonogenicity, %. Blue – control; red – with C. officinalis pretreatment.

 

Рис. 5. Фото колоний линии НСТ116p53KO. 1 – образец без воздействий, 2 – облучение в дозе 1 Гр, 3 – 2 Гр, 4 – 4 Гр, 5 – с предварительной обработкой в течение 24 ч 127 мкг/мл Calendula officinalis, 6 – 127 мкг/мл Calendula officinalis + облучение в дозе 1 Гр, 7 – 127 мкг/мл Calendula officinalis + облучение в дозе 2 Гр, 8 – 127 мкг/мл Calendula officinalis + облучение в дозе 4 Гр.

Fig. 5. Photos of colonies of HCT116p53KO cell line. 1 – a sample without exposure, 2 – irradiation at a dose of 1 Gy, 3 – 2 Gy, 4 – 4 Gy, 5 – with pretreatment for 24 hours 127 μg/ml Calendula officinalis, 6 – 127 μg/ml Calendula officinalis + irradiation at a dose of 1 Gy, 7 – 127 μg/ml Calendula officinalis + irradiation at a dose of 2 Gy, 8 – 127 μg/ml Calendula officinalis + irradiation at a dose of 4 Gy.

 

Для культуры с делецией TP53 (рис. 4, 5) ФИД составил 0.32 (что соответствует уменьшению необходимой дозы в 3,1 раза). Относительно культуры с p53 дикого типа, чувствительность культуры с делецией TP53 выше в 1,7 раза, что делает C. officinalis перспективным компонентом радиотерапии опухолей независимо от их р53-статуса.

р21 – ингибитор клеточного цикла, реагирующий на повреждение ДНК и останавливающий клеточный цикл, как в G1, так и в G2 фазах, чтобы клетка могла репарировать ДНК. Активация p21 является важным ответом клетки на радиационные повреждения, при этом данные о функционале p21 противоречивы и сильно зависят от типа клеток [21], субклеточной локализации p21, его посттрансляционных изменений. Например, накопление р21 в цитоплазме опухолевых клеток способствует метастазированию и ухудшает клинический прогноз. р21 является одним из основных медиаторов остановки клеточного цикла, вызванной активацией р53, однако активация p21 в ответ на γ-облучение может происходить как по p53-зависимому, так и по p53-независимому пути – например, через NF-κB. Также р21 участвует в клеточном старении. В нашем исследовании ФИД по отношению к культуре опухолевых клеток с делецией CDKN1A (рис. 6) составляет 4 для дозы Гр и 2 для дозы 4 Гр, что указывает на p21 как на ключевой фактор гибели клеток в случае сочетанного действия γ-излучения и настойки C. officinalis. Клетки карциномы толстой кишки с делецией CDKN1A показали большую чувствительность к γ-излучению, чем клетки дикого типа и клетки с делецией TP53, однако настойка C. officinalis именно по отношению к этой линии клеток проявила себя как радиопротектор. Вероятно, C. officinalis активирует гибель клеток после облучения через p21-зависимый путь, а при неактивном p21 на первый план выходят антиоксидантные свойства настойки. Конкретный путь воздействия C. officinalis на раковые клетки, как самого по себе, так и в сочетании с γ-излучением, требует дальнейшего уточнения.

 

Рис. 6. Клоногенный анализ линии НСТ116p21KO при воздействии облучения в дозе 1, 2 и 4 Гр с предварительной обработкой в течение 24 ч 127 мкг/мл Calendula officinalis. Количество колоний в контроле без воздействий взято за 100%. По горизонтали – доза облучения, по вертикали – колониеобразование, %. Синий – контроль; красный – с предварительной обработкой C. officinalis.

Fig. 6. Clonogenic assay of HCT116p21KO line exposed to radiation doses of 1, 2, and 4 Gy with pretreatment for 24 hours with 127 μg/ml Calendula officinalis. The number of colonies in untreated control sample was set as 100%. X-axis – total radiation dose, y-axis – clonogenicity, %. Blue – control; red – with C. officinalis pretreatment.

 

В эксперименте in vivo C. officinalis вводили в дозе 20 мг/кг подкожно в холку с последующим облучением. В предварительных экспериментах было использовано как подкожное, так и интратуморальное введение препарата (данные не приведены). Однако поскольку интратуморальное введение приводит к нарушению целостности опухоли и менее перспективно с точки зрения терапии, остановились на подкожном введении препарата.

Для фракционирования была использована локально подводимая суммарная доза γ-облучения 20 Гр с фракционированием по 4 Гр ежедневно.

Для этого эксперимента использовали 4 группы по 12 мышей; контрольная группа с интактным ростом опухоли, группа с препаратом без облучения, группа с облучением без препарата, группа с комбинированным воздействием препарата и облучения.

Эксперимент был начат, когда опухоли достигли среднего диаметра 0.8 см и устойчиво определялись пальпированием. Введение препарата проводили перед каждым облучением, между введением и облучением проходило не менее получаса.

Объем опухоли измеряли ежедневно и определяли торможение роста опухоли (ТРО) в процентах от объема опухоли контрольной группы. По итогам эксперимента определена средняя продолжительность жизни (СПЖ).

СПЖ для контрольной группы составила 23 дня, для группы с облучением 21 день, для группы с препаратом 21 день, с облучением и препаратом 30 дней. СПЖ для группы с облучением и препаратом статистически значимо (на уровне 0.05) отличалась от всех остальных, все остальные группы по СПЖ между собой статистически значимо (на том же уровне 0.05) не различались.

 

Рис. 7. Торможение роста перевиваемой меланомы мыши B16 при различных воздействиях. По горизонтали – дни от перевивки, по вертикали – объем опухоли, см 3. Слева направо: первая строка – контроль; вторая – календула лекарственная; третья – C. officinalis + 20 Гр; далее – 20 Гр.

Fig. 7. Inhibition of the growth of transplantable murine melanoma B16 under different conditions. X-axis – days after grafting, y-axis – tumor volume, cm3. Left to right: first line – control; second – Calendula officinalis; third – C. officinalis + 20 Gy; forth – 20 Gy.

 

Максимальное ТРО наблюдалось через 5 дней после последнего облучения и составляло 57% в эксперименте с препаратом и 98% – для комбинации препарата и облучения (рис. 7). Мыши, у которых наблюдалась полная видимая редукция опухоли (4 мыши из 12 в группе), на 22 день после облучения были умерщвлены и препарированы. В легких и на месте прививки при препарировании и осмотре видимых очагов меланомы обнаружено не было (рис. 8).

 

Рис. 8. А – контрольная опухоль на 18 день после перевивки, Б – через 31 день после перевивки, 22 дня после воздействия 20 Гр γ-излучения в сочетании с Calendula officinalis, В – место прививки опухоли через 22 дня после облучения в сочетании с Calendula officinalis.

Fig. 8. A – control tumor on day 18 after grafting, Б – 31 days after grafting, 22 days after exposure to 20 Gy of γ-radiation in combination with Calendula officinalis pre-treatment, В – site of tumor inoculation 22 days after irradiation in combination with Calendula officinalis pre-treatment.

 

ВЫВОДЫ

Впервые изучен водно-спиртовой настой календулы лекарственной Calendula officinalis L. (Asteraceae) как потенциальный радиосенсибилизатор для терапии злокачественных опухолей.

Показано:

1. C. officinalis является радиосенсибилизатором.
2. Водно-спиртовая настойка C. officinalis повышает эффективность облучения по отношению к линии клеток карциномы толстой кишки человека на 35–47%, что позволит снизить терапевтическую дозу в 1.7 раза.
3. Отсутствие значимой разницы в цитотоксичности по отношению к HCT116р53KO, по сравнению с HCT116 дикого типа, указывает на р53-независимый путь клеточной гибели при действии C. officinalis. Преимущества в выживании у клеток HCT116p21–/– при сохранном p53 указывают на p21-зависимый путь клеточной гибели. В присутствии C. officinalis значительно увеличивается ответ HCT116р53KO на радиационные повреждения, и снижается ответ HCT116p21–/–, что также указывает на p21 как на ключевой элемент, решающий судьбу клетки. Радиосенсибилизационные свойства C. officinalis и механизмы клеточной гибели, задействованные в этом процессе, требуют дальнейшего изучения.

C. officinalis хорошо показала себя по отношению к линии опухолевых клеток с деактивацией p53, являющейся одним из факторов устойчивости опухолей к терапии, а также на модели меланомы мышей in vivo. Поскольку C. officinalis является ранозаживляющим средством и средством, предупреждающим лучевые дерматиты, может быть целесообразно сочетать предобработку препаратом C. officinalis со стандартными схемами лечения опухолей при помощи радиотерапии, особенно в случае опухолей поверхностного расположения.

Авторлар туралы

S. Koldman

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical Biological Agency

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: epistularum@yandex.ru
Ресей, Moscow

V. Koldman

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical Biological Agency; Burnazyan Federal Medical Biophysical Center of the Federal Medical Biological Agency

Email: epistularum@yandex.ru
Ресей, Moscow; Moscow

A. Belousov

Burnazyan Federal Medical Biophysical Center of the Federal Medical Biological Agency

Email: epistularum@yandex.ru
Ресей, Moscow

L. Mazaletskaya

Emanuel Institute of Biochemical Physics of Russian Academy of Sciences

Email: epistularum@yandex.ru
Ресей, Moscow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар