Bioactive compounds from the bark of Juniperus communis (Cupressaceae)

Full Text

Растущая потребность в лекарственных и биологически активных препаратах свидетельствует о необходимости поиска новых источников сырья или более подробном изучении ранее известных. Флора Северо-Западного региона России имеет свои характерные особенности по составу и разнообразию, что представляет интерес для получения ценных продуктов, обладающих высокой антирадикальной и антибактериальной активностью. Одним из растений, которое уже на протяжении долгого времени привлекает внимание исследователей, является можжевельник обыкновенный Juniperus communis L. (Cupressaceae). Известно, что компоненты растительной ткани растений, произрастающих в экстремальных условиях, могут обладать особыми физикохимическими и биологическими свойствами.

Результаты изучения фармацевтического рынка фитопрепаратов свидетельствуют о присутствии лекарственных средств из можжевельника. Согласно литературным данным, активному изучению подвергались древесная зелень, древесина и шишкоягоды можжевельника обыкновенного [1–6], в то время как работы по изучению свойств коры отсутствуют. Разнообразный компонентный состав, широкий спектр фармакологических свойств, широкий ареал произрастания можжевельника свидетельствуют об актуальности продолжения таких исследований.

При переработке древесины образуются отходы окорки, которые пока не имеют рационального применения. Вследствие этого основные направления переработки коры все еще ограничены ее утилизацией как органического материала в качестве топлива, в сельском хозяйстве и т.п. Редкие примеры использования коры отдельных древесных пород для выделения дубильных веществ, производства пробки, получения дегтя (из бересты березы) и выделения из коры растущих деревьев пихты пихтового бальзама не улучшают, к сожалению, общую картину неэффективного использования содержащихся в коре ценных органических соединений. Обладая уникальным компонентным составом, кора может быть использована в качестве сырья для получения широкого спектра продуктов, поэтому для разработки технологий более квалифицированного использования названных отходов необходимы сведения о составе древесной коры.

Особенности компонентного состава древесины и древесной зелени можжевельника обыкновенного рассмотрены нами ранее [3, 4, 6]. Цель данного исследования – изучение особенностей компонентного состава коры Juniperus communis, произрастающего на территории Архангельской обл.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Отбор проб коры Juniperus communis проводили с растущих экземпляров на высоте 1 м в 2021–2022 гг. в Приморском р-не Архангельской обл. (на ранее выбранных тестовых площадках) [3, 4]. Каждый образец содержал усредненную пробу с 5 здоровых (без признаков ослабления) особей можжевельника разного диаметра.

Образцы коры высушивали на воздухе, измельчали на лабораторной мельнице ЛМ 201 с водяным охлаждением, усредняли (размер фракции, взятой на исследование составил 1–2 мм) и определяли влажность. Схема анализа образцов коры J. communis приведена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема анализа коры Juniperus communis.

Fig. 1. Scheme of Juniperus communis bark analysis.

 

Компонентный состав коры определяли по общепринятым в химии древесины методикам [7]. Определение содержания целлюлозы осуществляли удалением нецеллюлозных компонентов азотно-спиртовой смесью, лигнина – методом Класона в модификации Комарова по данным четырех параллельных определений. Дубильные вещества определяли по методу Левенталя в модификации Л.А. Курсанова. Метод предусматривает определение суммарного содержания всех фенольных соединений, но использование пересчетного коэффициента Нейбауэра позволяет установить содержание дубильных веществ [8].

Выделение экстрактивных веществ осуществляли методом дефлегмации в аппарате Сокслета (экстрагенты: 96%-й этиловый спирт, изопропиловый спирт, гексан и петролейный эфир) при постоянном кипении в течение 5 ч. Определение в полученных экстрактах сухого остатка проводили по ГФ XI ОФС “Экстракты” [9].

Эфирное масло из коры можжевельника выделяли по методу Клевенджера, который основан на гидродистилляции эфирного масла из сырья в градуированный приемник [9]. Содержание эфирного масла (%) в абсолютно сухом сырье вычисляли по формуле:

$\omega =\frac{0.95\cdot V}{m_c}\cdot 100\%$

где V – объем эфирного масла, см³; 0.95 – плотность эфирного масла, г/см³; m_c – масса сухого сырья, г

Идентификацию индивидуальных соединений спиртового и петролейного экстрактов коры проводили методом хромато-масс-спектрометрии с использованием газового хромато-масс-спектрометра GC-MS QP-2010 Ultra (Shimadzu, Япония). При подготовке проб к хромато-масс-спектрометрическому анализу предварительно проводили их дериватизацию силилирующим агентом BSTFA. Условия хроматографического анализа: колонка Rxi-5 Sil MS (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм), изотермический режим при 50°C в течение трех минут, затем программированный подъем температуры со скоростью 10°C/мин до 320°C с выдержкой при конечной температуре 20 мин. Температура испарителя 230°C, температура ионизационной камеры 230°C, энергия ионизации 70 эВ. Идентификацию соединений осуществляли по библиотекам массспектров NIST 2011 и Wiley 2010 со степенью достоверности выше 80%.

Для определения антирадикальной активности (АРА) использовали метод на основе реакции компонентов водно-спиртового экстракта со стабильным предварительно генерированным радикальным катионом 2.2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS) [10]. Оптическую плотность определяли на сканирующем спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) при длине волны 734 нм. Реакцию проводили в кварцевых кюветах с плотно закрывающимися крышками при комнатной температуре путем приливания к раствору катион-радикала ABTS рабочего раствора. В качестве контрольного образца использовали раствор ABTS, в качестве раствора сравнения – цитратный буферный раствор, содержащий этанол.

Антирадикальную активность (% ингибирования ABTS) вычисляли по формуле:

$\%ингибирования=$$\frac{D_{контр}-D_x}{D_{контр}}\cdot 100\%$

где D_x – оптическая плотность исследуемого раствора, D_контр – оптическая плотность контрольного раствора

Каждое определение проводили трижды, причем различия в полученных значениях АРА составляли не более 0.5% от определяемой величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате изучения компонентного состава коры Juniperus communis обнаружено, что он представляет собой комплекс соединений, основную долю которых составляют целлюлоза, лигнин и широкий спектр экстрактивных веществ (табл. 1). Следует отметить, что компонентный состав коры J. communis заметно отличается от состава древесины. Это отличие обусловлено разным анатомическим строением и разной ролью в жизнедеятельности особи коры и древесины.

 

Таблица 1. Компонентный состав коры можжевельника обыкновенного, произрастающего на территории Архангельской области

Table 1. The component composition of Juniperus communis bark from the Arkhangelsk region

Показатель Index	Значение Value
	Кора Bark	Древесина [3, 6] Wood	Древесная зелень [4] Young shoots
Целлюлоза, % Cellulose, %	29.4–33.3	36.4–47.0	0.19–0.20
Лигнин Класона, % Klason Lignin, %	29.5–36.6	28.6–31.5	32.9–33.3
Гемицеллюлозы, % Hemicelluloses, %	2.6–2.7	7.0–6.1	–
Экстрактивные вещества, % Extractive substances, % – экстрагируемые горячей водой extracted with hot water – экстрагируемые этанолом extracted with ethanol – экстрагируемые паром (эфирное масло) extracted by steam (essential oil) – дубильные вещества tannins	8.9–12.0 9.0–14.3 0.5–0.7 13.7–14.1	2.14 3.88 0.12 [11] –	14.5–32.3 14.4–25.7 2.7–4.7 2.0–7.6 [12]

 

Количество целлюлозы в коре J. communis колеблется от 29.4 до 33.3%, гемицеллюлоз от 2.6–2.7%, что значительно меньше, чем в древесине. С другой стороны, кора можжевельника содержит большее количество лигнина – до 36.6% по сравнению с древесиной (29.8%), что соответствует данным, представленным в литературе [3, 13].

Характерной особенностью компонентного состава коры является высокое содержание экстрактивных веществ (до 15%) и наличие биологически активных веществ. Среди экстрактивных веществ коры особого внимания заслуживают фенольные и смолистые компоненты. Содержание фенольных веществ зависит от физиологической активности, интенсивности ростовых процессов [14], а также от физико-химических особенностей коры. Большая часть фенольных соединений коры, включая конденсированные дубильные вещества, являются водорастворимыми, их содержание, например, в коре сосны составляет 9–11% [15], лиственницы – 9–13% [16]. Как показывают полученные результаты, содержание дубильных веществ в коре можжевельника обыкновенного составляет 13.9%. С одной стороны, это свидетельствует о большей интенсивности окислительных процессов, происходящих в коре. С другой стороны, повышенное содержание дубильных веществ в коре можжевельника позволяет рассматривать ее как сырье для практического применения в качестве ингибиторов растений.

Экстрактивные вещества, содержащиеся в большом количестве в коре, представляют особый интерес. В ряде случаев комплекс биологически активных соединений в составе экстракта оказывает более разностороннее действие, чем отдельные его компоненты. Какие действующие и сопутствующие вещества перейдут в экстракт при извлечении, зависит от метода экстракции и применяемого растворителя. Поэтому для оценки содержания биологически активных веществ в коре можжевельника определяли содержание экстрактивных веществ, извлекаемых паром и растворителями различной степени полярности. При экстракции полярными растворителями (этиловый спирт, изопропиловый спирт, вода) из коры преимущественно извлекаются флавоноиды, фенольные соединения. Неполярными растворителями (петролейный эфир, бензин, гексан) извлекается большая группа веществ, обладающих биологической активностью и имеющих практическое применение. Эти вещества представлены смоляными, жирными и нейтральными соединениями (алканы, сложные эфиры, жирные спирты и стерины).

Сравнительный анализ данных, полученных различными методами экстракции, показал, что выход эфирного масла из коры составляет 0.6%, что в 3–4 раза меньше, чем из древесной зелени можжевельника (табл. 1). Наибольшее количество смолистых веществ из коры можжевельника извлекается этиловым и изопропиловым спиртами – 14.3 и 13.4% соответственно, тогда как петролейным эфиром и гексаном извлекается соответственно 4.0 и 4.2%.

Для идентификации и количественного определения содержания индивидуальных компонентов в полученных спиртовом и петролейном экстрактах применяли метод хромато-масс-спектрометрии. На рис. 2 и 3 приведены хроматограммы спиртового и петролейного экстрактов. В табл. 2 и 3 указано содержание основных компонентов спиртового и петролейного экстрактов коры, идентифицированных с достаточно высокой степенью вероятности, относительное содержание которых выше 1%.

 

Таблица 2. Основные компоненты летучей части спиртового экстракта коры Juniperus communis

Table 2. Major volatile compounds of Juniperus communis bark alcoholic extract

Наименование компонента Identified compound	Время удерживания, мин* Retention time, min	Относительное  содержание, % Relative content, %
Пинитол Pinitol	19.963	16.59
Сахароза Sucrose	27.342	14.41
Пимаровая кислота Pimaric acid	24.624	10.87
Изомер пимаровой кислоты Isomer of pimaric acid	24.939	7.70
Тагатопираноза Tagatopyranose	19.724	7.32
Глюкопираноза Glucopyranose	21.408	5.06
Изомер глюкопиранозы β-D-glucopyranose	20.535	4.62
Катехин Сatechin	29.172	3.56
Фруктофураноза Fructofuranose	19.641	2.58
Изомер сахарозы α-D-glucopyranose	33.260	1.91
Катехин Сatechin	29.013	1.55

* – Время удерживания, мин соответствует времени удерживания ТМС-производных перечисленных соединений.

* – Retention time corresponds to the retention time of TMS derivatives of the listed compounds.

 

Таблица 3. Основные компоненты летучей части петролейного экстракта коры Juniperus communis

Table 3. Major volatile compounds of Juniperus communis bark petroleum extract

Наименование компонента Identified compound	Время удерживания, мин* Retention time, min*	Относительное содержание, % Relative content, %
Пимаровая кислота Pimaric acid	24.632	33.03
Изомер пимаровой кислоты Isomer of pimaric acid	24.943	21.70
Стигмастерол Stigmasterol	33.228	4.09
Изомер пимаровой кислоты Isomer of pimaric acid	25.005	3.19
Изомер пимаровой кислоты Isomer of pimaric acid	24.254	2.93
Линолевая кислота Linoleic acid	23.792	2.40
5,8,11 – Эйкозатриеновая кислота 5,8,11 – Eicosatrienoic acid	25.363	1.86
Изомер пимаровой кислоты Isomer of pimaric acid	27.085	1.67
Олеиновая кислота Oleic acid	23.844	1.53

* – Время удерживания, мин соответствует времени удерживания ТМС-производных перечисленных соединений.

* – Retention time corresponds to the retention time of TMS derivatives of the listed compounds.

 

Анализ данных, приведенных в табл. 2 и 3, показал, что изученный компонентный состав спиртового и петролейного экстрактов отличается не только в качественном, но и в количественном отношении. В спиртовом экстракте коры можжевельника было обнаружено 43 компонента, из них идентифицировано 33 компонента. В петролейном экстракте был обнаружен 41 компонент, из которых идентифицировано 23 компонента. В петролейном экстракте, например, на долю смоляных кислот приходится более 62% от общего содержания веществ, а в спиртовом экстракте – чуть больше 18%. Кроме того, в составе спиртового экстракта присутствуют сахара, которые отсутствуют в составе петролейного экстракта.

 

Рис. 2. Хроматограмма спиртового экстракта коры Juniperus communis.

Fig. 2. Chromatogram of the Juniperus communis bark alcohol extract.

 

Согласно литературным данным, выделенный комплекс экстрактивных веществ спиртового экстракта обладает выраженной антиоксидантной активностью. Так, пинитол, обнаруженный в спиртовом экстракте, подавляет процессы образования свободных радикалов и перекисное окисление липидов; катехины – органические вещества из группы флавоноидов, являются сильными антиоксидантами [17–19]. Это подтверждают и полученные нами экспериментальные данные по антирадикальной активности (АРА), которая является оценкой биохимической активности экстрактов. Степень ингибирования радикала ABTS для спиртового экстракта коры составила 85.8–86.6%, что почти в 2 раза выше, чем для спиртового экстракта хвои можжевельника (46.8–48.0% ингибирования).

 

Рис. 3. Хроматограмма петролейного экстракта коры Juniperus communis.

Fig. 3. Chromatogram of the Juniperus communis bark petroleum extract.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, исследования компонентного состава коры можжевельника обыкновенного Juniperus communis L. (Cupressaceae), произрастающего на территории Архангельской обл., показали, что он значительно отличается от состава древесины этого вида. По сравнению с древесиной кора J. communis содержит в 3.5 раза больше экстрактивных веществ. Методом хромато-масс-спектрометрии было выявлено, что основную часть компонентов спиртового экстракта составляют моносахариды, дисахариды и смоляные кислоты; петролейного экстракта – смоляные и жирные кислоты, стерины. Установлено, что выделенный комплекс экстрактивных веществ спиртового экстракта обладает выраженной антирадикальной активностью. На основании проведенных исследований можно заключить, что кора можжевельника обыкновенного является важным источником биологически активных веществ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования проведены в рамках государственного задания ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН 2022–2024 гг. “Физико-химические основы селективных методов выделения, характеристики и применение биологически активных комплексов растительных объектов высоких широт для решения задач экологического контроля и здоровьесбережения” (№ 122011700252-1) с использованием оборудования ЦКП КТ РФ-Арктика (ФИЦКИА УрО РАН).

ACKNOWLEDGMENTS

The research was carried out within the framework of the state assignment of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research (FECIAR) of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences for 2022–2024. “Physics and chemistry of selective methods for isolating, characterizing and using biologically active complexes of plant objects of high latitudes to solve problems of environmental control and health protection” (No. 122011700252-1) using the the instrumentation of the Core Facility Center “Arktika” of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research.

About the authors

N. V. Selivanova

Federal Research Center for Comprehensive Study of the Arctic Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: snatalia-arh@yandex.ru
Russian Federation, Arkhangelsk

M. A. Pustynnaya

Federal Research Center for Comprehensive Study of the Arctic Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: snatalia-arh@yandex.ru
Russian Federation, Arkhangelsk

M. A. Gusakova

Federal Research Center for Comprehensive Study of the Arctic Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: snatalia-arh@yandex.ru
Russian Federation, Arkhangelsk

K. G. Bogolitsyn

Federal Research Center for Comprehensive Study of the Arctic Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: snatalia-arh@yandex.ru
Russian Federation, Arkhangelsk

References

Supplementary files