Inactivation of type 3 fimbriae Increases adhesion of Klebsiella oxytoca to lung epithelial cells

Texto integral

Сокращения: БСА – бычий сывороточный альбумин; ИМП – инфекция мочевыводящих путей; КАИМП – катетер-ассоциированная инфекция мочевыводящих путей; КОЕ – колониеобразующая единица; ЛБ – лизогенный бульон; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ФСБ – фосфатно-солевой буфер; COVID-19 – коронавирусная инфекция 2019 года; FRT-сайт – сайт узнавания Flp-рекомбиназой; SOC – супероптимальный бульон с подавлением катаболитов.

Введение

Порядок Enterobacterales включает множество абсолютно и условно патогенных бактерий. Факторы вирулентности абсолютных патогенов, таких как Yersinia spp., Salmonella enterica, Shigella spp. и др., изучены достаточно подробно, тогда как гораздо меньше известно о факторах вирулентности условных патогенов, таких как Klebsiella oxytoca. К. oxytoca представлена комплексом видов: К. oxytoca, К. michiganensis, К. pasteurii, К. grimontii, К. spallanzanii, К. huaxiensis и тремя новыми неназванными видами, дифференцируемыми по нуклеотидной последовательности гена bla_OXA, кодирующего β-лактамазу [1]. Фенотипически виды этого комплекса неотличимы друг от друга, поэтому в рутинной практике все бактериальные изоляты, как правило, определяют как вид К. oxytoca.

К. oxytoca – второй по клинической значимости вид внутри этого рода после К. pneumoniae [2]. Установлено, что пенициллинотерапия приводит к дисбиозу кишечной микробиоты и чрезмерному росту бактерий К. oxytoca [3], что, в свою очередь, может привести к развитию воспалительного заболевания кишечника – антибиотик-ассоциированного геморрагического колита [3], а также к развитию позднего неонатального сепсиса, менингита или некротизирующего энтероколита у недоношенных младенцев [4]. К. oxytoca является также возбудителем инфекций мочевыводящих путей (ИМП), в том числе катетер-ассоциированных (КАИМП), мягких тканей, ран, внутрибрюшных инфекций, бактериемии и внутрибольничной пневмонии [3, 5–8]. В частности, доля К. oxytoca в спектре уропатогенных возбудителей варьирует между 1 и 3.5%, однако среди беременных женщин это значение достигает 19–38% [9].

Недавно было показано, что у пациентов с COVID-19 микробиота легких насыщается К. oxytoca [10]. Кроме того, у находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ) пациентов, в том числе с COVID-19, часто развивается нозокомиальная пневмония, имеющая бактериальную природу [11]. По данным Национальной сети безопасности здравоохранения США за 2006–2007 гг. развитие ИВЛ-ассоциированной пневмонии в 2.2% случаев вызвано К. oxytoca [12]. Тем не менее, этиология ИВЛ-ассоциированной пневмонии зависит от многих факторов, включая демографические особенности, географическое положение и др. [11].

Изучение факторов вирулентности патогенов важно не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической: за последние десятилетия возрос интерес к разработке и применению новых лекарственных средств, действующих на факторы вирулентности возбудителей – вакцин и патоблокаторов [13, 14]. Вакцинация направляет иммунные реакции организма на ключевые этапы патогенеза, а патоблокаторы инактивируют структуры, обеспечивающие вирулентность бактерий, тем самым подавляя их способность вызывать заболевание [13, 14]. Таким образом, действие препаратов обоих типов направлено на факторы вирулентности патогенов, а главная роль в защите от них отводится собственным механизмам иммунитета хозяина.

Адгезия бактерий к поверхности является начальным и ключевым этапом развития инфекции [15]. Патогенные бактерии адгезируют к эпителию или имплантируемым медицинским изделиям (катетерам, трахеальным трубкам и др.) с помощью разнообразных поверхностных афимбриальных и фимбриальных белковых адгезинов. Афимбриальные адгезины расположены на поверхности клетки в виде отдельных молекул или многокомпонентных агрегатов. Однако более эффективную адгезию обеспечивают адгезины, расположенные на фимбриях – нитевидных полимерных структурах, присущих большинству грамотрицательных и ряду грамположительных бактерий [16, 17]. Важную роль в патогенезе инфекций играют шаперон-ашерные фимбрии, экспорт и сборка которых происходит с помощью собственного молекулярного аппарата, а не общей системы секреции [18]. Периплазматический шаперон формирует комплекс с каждой структурной субъединицей фимбрии, обеспечивая фолдинг и препятствуя преждевременной полимеризации, и переносит ее к белку-ашеру в наружной мембране, который производит сборку фимбрий на поверхности клетки.

К шаперон-ашерным фимбриям относятся фимбрии типа 1 и 3, характерные для вида К. pneumoniae, близкородственного К. oxytoca. Они обеспечивают адгезию бактерий к клеткам эпителия кишечника, мочевого пузыря и других органов, а также к поверхности медицинских изделий, что необходимо для формирования биопленок [18]. Фимбрии типа 1 и 3 хорошо охарактеризованы у К. pneumoniae, тогда как у К. oxytoca их функциональное значение подробно не изучено, а имеющиеся данные сводятся лишь к результатам скрининговых описательных исследований. Так, в ряде работ отмечена взаимосвязь продукции фимбрий типа 1 и 3 и способности клинических штаммов К. oxytoca к формированию биопленок [19, 20]. Продукция этих фимбрий описана также у штаммов К. oxytoca, способных к адгезии на эпителиальные клетки [21, 22]. В связи с этим, цель данной работы заключалась в том, чтобы охарактеризовать адгезивный потенциал К. oxytoca NK-1 и оценить вклад фимбрий типа 1 и 3.

Экспериментальная часть

Объект исследования и условия культивирования. Штамм К. oxytoca NK-1 выделен с поверхности мочеточникового стента пациентки с КАИМП. Бактерии культивировали при 37°C в лизогенном бульоне (ЛБ) [23], при необходимости добавляли антибиотики: гентамицин (7 мкг/мл), хлорамфеникол (20 мкг/мл) или канамицин (50 мкг/мл). Агаризированная среда содержала 2% агара. Бактерии для оценки их адгезивных свойств выращивали в условиях, оптимальных для продукции фимбрий (без аэрации в течение 48 ч при 37°C); для подавления продукции фимбрий бактерии выращивали в тех же условиях, но при 30°C [24]. Для восстановления жизнеспособности бактерий после трансформации использовали супероптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC) [23]; для получения ночной культуры бактерии культивировали с аэрацией в течение 16 ч.

Плазмиды и клеточные линии, использованные в работе, любезно предоставлены доктором Rafał Kolenda, сотрудником лаборатории многопараметрического анализа Бранденбургского технического университета Cottbus-Senftenberg (Германия). Плазмиды pKD4, pKD46-Gm и pCP20 [25, 26] использовали на разных этапах инактивации генов и оперонов. Линии клеток эпителия мочевого пузыря (5637), кишечника (Caco-2) и легких человека (H1299) использовали для определения адгезивности бактерий. Клеточные линии выращивали в коммерческих средах (“Merck”, Германия; 5637 в RPMI-1640, остальные линии в DMEM/F12), содержащих дополнительно 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 1% заменимых аминокислот (только для H1299) и антибиотики – пенициллин и стрептомицин (по 100 ЕД /мл). Клеточные линии культивировали при 37°C, повышенной влажности и 5% CO₂.

Характеристика адгезивных свойств бактерий. Фимбрии на поверхности штамма К. oxytoca NK-1 выявляли методом дрожжевой агглютинации [27]. Бактерии (ОП₆₀₀ = 1) и 2%-ные пекарские дрожжи, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), смешивали на предметном стекле в равном соотношении (по 15 мкл); для определения типа фимбрий к смеси добавляли 15 мкл 0.2 М маннозы. Степень агглютинации определяли визуально и оценивали по скорости образования хлопьев как слабую (+ – время образования более 20 с), умеренную (++ – время образования 5–20 с), высокую (+++ – до 5 с).

Адгезию исследовали на плоскодонных полистирольных планшетах Nunc (“Thermo Fisher Scientific”, США) разного формата. В качестве субстратов для адгезии использовали клеточные линии и адсорбированные белки – гликозилированные (РНКаза B) и негликозилированные (бычий сывороточный альбумин, БСА). Клеточные линии выращивали в 24-луночных планшетах с поверхностью Nunclon Delta (“Thermo Fisher Scientific”) до достижения 80–90% монослоя, промывали 2 раза в ФСБ и добавляли в лунки свежую среду без антибиотиков. В лунки 96-луночного планшета MaxiSorp добавляли РНКазу В (“Sigma-Aldrich”, США) или БСА (“Roth”, Германия) – 50 мкл в концентрации 5 мг/мл в 0.1 М Na₂CO₃ рН 9.6. После инкубации в течение 12 ч при 4°C лунки промывали 1%-ным БСА и высушивали на воздухе.

Бактериальную культуру центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Клетки промывали 3 раза в ФСБ и ресуспендировали в среде для культивирования клеточных линий без антибиотиков (для анализа адгезии к эукариотическим клеткам) или 1% БСА (для анализа адгезии к адсорбированным белкам). Лунки инфицировали бактериальной суспензией – 20 × 10⁶ бактерий (клеточные линии) или 5 × 10⁶ бактерий (белки). После 2 ч инкубации лунки 3 раза промывали ФСБ для удаления несвязавшихся бактерий. Клетки эукариот с адгезированными бактериями разрушали, добавляя в лунку 200 мкл 0.1%-го Тритона X-100 на 5 мин. Готовили серию десятикратных разведений, которые высевали на агаризованную среду ЛБ для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Результаты выражали как количество КОЕ на 1 мм² поверхности монослоя (площадь поверхности лунки 1.9 см²). Бактерии, связанные с белками, фиксировали в 4%-ном параформальдегиде, промывали в ФСБ, окрашивали иодидом пропидия и сканировали с помощью автоматизированной системы флуоресцентной микроскопии Aklides (“Medipan”, Германия); подсчет бактерий в 1 мм² проводили в программе Maxislider v.4.02. О влиянии инактивации на адгезивность мутанта судили по эффективности адгезии, выраженной как отношение уровня адгезии мутанта к уровню адгезии штамма дикого типа, принятого за 100%.

Для визуализации адгезированных бактерий клеточную линию 5637 выращивали на стерильных покровных стеклах в 24-луночном планшете. Инфицированные и промытые клетки фиксировали 1%-ным глутаровым альдегидом (“Sigma-Aldrich”) в течение 12 ч, промывали 2 раза в ФСБ и обезвоживали растворами этанола в восходящей концентрации (от 30 до 96%) по 2 раза в течение 30 мин. Анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа Merlin (“Carl Zeiss”, Германия) [28].

Поиск генов фимбрий в геноме штамма NK-1, секвенированном нами ранее [29], проводили с помощью программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Сравнительный анализ геномных локусов проводили с помощью программы Easyfig v. 2.2.3. Белковые мотивы в аминокислотных последовательностях предсказывали с помощью программы ScanProsite (https://prosite.expasy.org/scanprosite/).

Инактивацию генов и оперонов проводили с помощью системы рекомбинации фага λ Red по методу, описанному ранее [25], с модификациями для энтеробактерий [30]. Удаляли как гены адгезинов, так и полные опероны, чтобы исключить вклад других структурных субъединиц в адгезию.

На всех этапах генетический материал доставляли в клетки бактерий с помощью электропорации: 50 мкл электрокомпетентных клеток и 1 мкл плазмиды (40–50 нг) или 5 мкл ПЦР-продукта (1000 нг) помещали в холодную кювету с зазором 4 мм. Процедуру проводили с помощью прибора MicroPulser (“Bio-Rad”, США) при следующих параметрах: напряжение 2.5 кВ, емкость 25 мкФ, сопротивление 200 Ом. Сразу после воздействия электрического импульса к клеткам добавляли 900 мкл среды SOC.

Для получения электрокомпетентных клеток нативного штамма ночную культуру инокулировали в свежую среду в соотношении 1 : 100 и выращивали с аэрацией до ОП₆₀₀ = 0.5–0.6. Далее клетки инкубировали на льду = в течение 30 мин, осаждали (12 мин при 4500 g), 2 раза промывали холодной дистиллированной водой и концентрировали в ней же в 100 раз относительно первоначального объема культуры. Далее клетки трансформировали плазмидой pKD46-Gm, кодирующей рекомбиназу фага λ Red, и культивировали при 30°C с аэрацией в течение 1 ч.

Трансформанты культивировали на плотной среде ЛБ с гентамицином при 30°C и использовали для получения вторичных электрокомпетентных клеток. После достижения ОП₆₀₀ = 0.2–0.3 к культуре добавляли 0.2% арабинозы для индукции экспрессии гена рекомбиназы фага λ Red. После дальнейшего культивирования в течение 30–45 мин культуру инкубировали в течение 15 мин в водяной бане при 42°C и далее 15 мин во льду. После осаждения и промывания клетки трансформировали ПЦР-амплификатом гена устойчивости к канамицину kan, фланкированного прямыми повторами (FRT-сайтами). Благодаря использованию составных праймеров для инактивации (табл. 1), ген был фланкирован также участками удаляемого элемента, по которым ген kan, фланкированный FRT-сайтами, в ходе гомологичной рекомбинации встраивался в геном вместо удаляемого элемента с помощью накопленной в клетках рекомбиназы. После трансформации клетки культивировали при 37°C в течение 2 ч с аэрацией, а затем в течение 2 ч без аэрации. Скрининг мутантов проводили на плотной среде ЛБ с канамицином, используя праймеры для верификации (табл. 2). ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле [31], ДНК-маркер – GeneRuler 1 kb Plus (“Thermo Fisher Scientific”).

 

Таблица 1. Праймеры для инактивации, использованные в работе

Ген/оперон	Праймер	Нуклеотидная последовательность*	Т, °С
fimH	Ko.fH.ina f	aagaggaatgaaaaaaatagtcaccctgttgttaac GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	63.5
	Ko.fH.ina r	ttattcgtaaacaaaggttactccgataattgactg ATGGGAATTAGCCATGGTCC
mrkD (обе копии)	Ko.mD.ina f	agtcaggaaaaaacaaaggaaacgctatgtcgctaa GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	62.0
	Ko.mD.ina r	caattgtgctgaatcacgcatacccgcctcccgaat ATGGGAATTAGCCATGGTCC
fim	Ko.fim.ina f	atgaacaaattagccgttatcgttttttcagcactgttcctgagcgctacGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	64.5
	Ko.fim.ina r	ctacactgcgatgccggactgcggctccgcttcgcctgagagctccgccaATGGGAATTAGCCATGGTCC
mrk1 (первая копия)	Ko.mrk1.ina f	atgaaaaaggttcttctctctgctgcaatggcgactgcgttttttggtatGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	65.5
	Ko.mrk1.ina r	tcaattataaacaagttcccaggtcgcccagctggtcaacggaccgctggATGGGAATTAGCCATGGTCC
mrk2 (вторая копия)	Ko.mrk2.ina f	gcggcaaatgctgctgataccaatgtaggcggcggtcaggttaatttcttGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	66.0
	Ko.mrk2.ina r	tcgctttttccggcgctggcgtaacgtagccaatgtaataagtaaatatcATGGGAATTAGCCATGGTCC

^* Нижний регистр обозначает выступы целевого гена/оперона.

 

Полученные мутантные штаммы использовали для получения электрокомпетентных клеток, которые затем трансформировали плазмидой pCP20, кодирующей Flp-рекомбиназу. Эта рекомбиназа, узнающая FRT-сайты, вырезала ген kan из генома. Протокол приготовления электрокомпетентных клеток был таким же, как для нативного штамма. Трансформанты культивировали на плотной среде ЛБ с хлорамфениколом при 30°C.

Для элиминации плазмиды pCP20 из мутантных штаммов бактерии культивировали на плотной среде ЛБ без антибиотиков при 42°C. Колонии мутантов, утративших устойчивость ко всем трем антибиотикам, использовали для подтверждения инактивации с помощью ПЦР с праймерами для верификации (табл. 2).

 

Таблица 2. Праймеры для верификации мутантов, использованные в работе

Сайт амплификации	Праймер	Нуклеотидная последовательность	Т, °С
Фланкирующие праймеры
fimH	Ko.fH f	GGAACGATCCAGGCGGTGAT	56.0
	Ko.fH r	CGACAGGATGCAGTCGACCT	56.0
mrkD	Ko.mD f	GAAGGCCACGGTTAAGTGGA	54.0
	Ko.mD r	AGGGCCAGTTGAATGAGTCG	54.0
fim	Ko.fim f	AGCATTGCTTCAGGATTATT	50.0
	Ko.fim r	ATCCTTGATGAACTGATTGT	50.0
mrk1	Ko.mrk1 f	TGCTCATTGATACTTAATTC	51.0
	Ko.mrk1 r	ATTGTAACATTTGCGCAAGA	50.0
mrk2	Ko.mrk2 f	ATCCATAAAACAGTCTCAAT	52.0
	Ko.mrk2 r	TTAATGCAAAAAGATTCTGG	51.0
Внутренние праймеры
fimH/fim	Ko.inn.fH f	CGGTTCATTAATCGCGGTCC	54.0
mrkD	Ko.inn.mD f	ACGGCAATAACCCGATCCTC	54.0
mrk1/mrk2	Ko.inn.mrk f	TATTCTCGCCGGAAAGCGGC	56.0
kan	К2 f	CGGTGCCCTGAATGAACTGC	56.0
	К1 r	CAGTCATAGCCGAATAGCCT	52.0

 

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили 3–5 раз по три повторности в каждой серии. Данные представлены в виде среднего ± ошибка среднего. Статистическую обработку поводили с помощью программы PSPP-1.4.1-g79ad47. Данные сравнивали с использованием непарного двухвыборочного t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р <0.05.

Результаты и обсуждение

К. oxytoca NK-1 обладает способностью к адгезии к широкому кругу субстратов

Культура штамма NK-1, выращенная при 37°C, вызывала умеренную агглютинацию клеток дрожжей (++), которая подавлялась маннозой (+), что указывает на продукцию бактериями чувствительных и нечувствительных к маннозе фимбрий типов 1 и 3 соответственно. В то же время, культивирование бактерий при 30°C приводило к снижению агглютинации дрожжей (+), которая при этом не изменялась при добавлении маннозы, что указывало на наличие на поверхности бактерий, выращенных в данных условиях, лишь фимбрий типа 3. Таким образом, температура культивирования влияет на продукцию штаммом NK-1 фимбрий типа 1 и 3. Для дальнейшей характеристики адгезивных свойств бактерии культивировали при 37°C.

Адгезивный потенциал штамма был охарактеризован на разных биотических и абиотических поверхностях. С помощью сканирующей электронной микроскопии показано, что бактерии эффективно адгезируют как к линии клеток 5637 эпителия мочевого пузыря (рис. 1а), так и к стеклу (рис. 1б). Количественная оценка адгезии также подтвердила способность штамма адгезировать к биотическим и абиотическим поверхностям. Так, уровень адгезии штамма к клеткам эпителия кишечника Caco-2, легких H1299 и мочевого пузыря 5637 составлял 2100 ± 100, 1500 ± 100 и 450 ± 30 КОЕ/мм² соответственно. На разных абиотических субстратах адгезивность штамма была примерно одинаковой, составляя 23000 ± 3000 бактерий/мм² на РНКазе B, 17000 ± 3000 бактерий/мм² на БСА и столько же на полистироле без адсорбированных белков. Адгезия штамма к РНКазе B, богатой остатками маннозы, может объясняться продукцией фимбрий типа 1, адгезин которых (FimH) специфически связывает маннозилированные белки [32]. В свою очередь, фимбрии типа 3 участвуют в неспецифической адгезии и могут быть фактором эффективной адгезии штамма NK-1 к БСА и полистиролу [33, 34].

 

Рис. 1. Адгезивный потенциал К. oxytoca NK-1. С помощью сканирующей электронной микроскопии (увеличение 15000× и 2000×) показано, что бактерии способны адгезировать как к живым клеткам эпителия мочевого пузыря 5637 (а), так и к стеклу (б).

 

Геном К. oxytoca NK-1 кодирует фимбрии типа 1 и 3

С помощью BLAST-анализа в геноме К. oxytoca NK-1 обнаружены кластеры генов, участвующих в биогенезе фимбрий типа 1 и 3 (fim- и mrk-опероны соответственно) (рис. 2). Общими для этих оперонов являются следующие структурные гены:

• fimA и mrkA, кодирующие главную субъединицу тела фимбрий;
• fimC и mrkB, кодирующие шаперон, обеспечивающий фолдинг и транспорт субъединиц через периплазму;
• гены fimD и mrkC ашера, обеспечивающего сборку субъединиц на наружной мембране;
• гены fimH и mrkD адгезина, расположенного на дистальном конце тела фимбрии и обеспечивающего специфичное прикрепление бактерий.

Оперон фимбрий типа 1 (fim-оперон) представлен в геноме одной копией размером 8.05 т.п.н. Подобно fim-оперону К. pneumoniae, fim-оперон К. oxytoca NK-1 включает восемь генов: fimA, fimC, fimD, fimH и следующие минорные гены:

• fimI с неохарактеризованной функцией. Имеющиеся данные позволяют предположить, что продукт этого гена терминирует сборку фимбрии и закрепляет ее на наружной мембране;
• fimF и fimG – продукты этих генов закрепляют адгезин на теле фимбрии и контролируют ее длину;
• дополнительный ген fimK кодирует белок-репрессор экспрессии fim-оперона Klebsiella spp, отсутствующий у Escherichia coli [35, 36].

 

Рис. 2. Сравнительный анализ генных кластеров, ответственных за продукцию фимбрий типа 1 (а) или типа 3 (б), в геномах К. pneumoniae и К. oxytoca. Под генами представлены гипотетические генные продукты в аминокислотных остатках (а.о.). Цветная шкала – степень идентичности сравниваемых генов

 

В то же время, в отличие от К. pneumoniae, перед fim-опероном К. oxytoca NK-1 вместо генов рекомбиназ fimB и fimE, меняющих ориентацию промотора и тем самым регулирующих экспрессию оперона [36], расположен ген гипотетического белка. Согласно проведенному нами BLAST-анализу, гомологи этого гена характерны только для членов видового комплекса К. oxytoca. С помощью программы ScanProsite в продукте данного гена выявлен структурный мотив “спираль-поворот-спираль”, характерный для ДНК-связывающих регуляторных белков [37]. Можно предположить, что экспрессия fim-оперона в клетках К. oxytoca и других членов видового комплекса К. oxytoca контролируется продуктом этого гена.

Оперон фимбрий типа 3 (mrk-оперон) в геноме К. oxytoca NK-1 представлен двумя копиями размером 5.58 и 5.65 т.п.н. (рис. 2б), нуклеотидная последовательность которых идентична на 94%. Структурно обе копии состоят из пяти генов, они идентичны mrk-оперону К. pneumoniae и, помимо уже упомянутых генов mrkA, mrkB, mrkC, mrkD, включают также минорный ген mrkF, продукт которого участвует в сборке и стабилизации фимбрий [38]. Экспрессия mrk-оперона контролируется прилежащим и расположенным на обратной цепи кластером регуляторных генов, который организован аналогично в соответствующих геномных локусах обеих бактерий и состоит из следующих генов: mrkH (главный активатор), mrkI (репрессор) и mrkJ (минорный активатор). Вместе с тем, нуклеотидные последовательности этих генов различаются. Так, обе копии гена mrkJ К. oxytoca гомологичны соответствующему гену К. pneumoniae. Обе копии гена mrkI К. oxytoca NK-1 гомологичны гену mrkI К. pneumoniae на 70% только в пределах 25% длины последовательности. Интересно отметить, что копии гена mrkH К. oxytoca не гомологичны друг другу по всей длине, лишь одна копия гена mrkH гомологична гену mrkH К. pneumoniae на 74%.

С целью изучения вклада фимбрий типа 1 и 3 в адгезивный потенциал К. oxytoca NK-1 проведен нокаут генов адгезинов – fimH и mrkD соответственно. Чтобы исключить возможное влияние других структурных субъединиц фимбрий на адгезию и другие клеточные процессы, например, при накоплении в периплазме, мы инактивировали также целые опероны фимбрий типа 1 (fim) и типа 3 (mrk). Для полного нокаута фимбрий типа 3 инактивировали вторую копию гена mrkD или оперона mrk у мутантов по первым копиям. Чтобы получить мутантов по обоим типам фимбрий, инактивировали ген адгезина или оперон фимбрий типа 1 у полных мутантов по фимбриям типа 3. В геноме мутантов вместо удаленного элемента оставался так называемый “шрам” меньшего размера, что подтверждено с помощью ПЦР (рис. 3а). На рис. 3б показана линейка мутантов c нокаутом генов отдельных адгезинов фимбрий типа 1 (ΔfimH) или типа 3 (ΔmrkD1, ΔmrkD1,2), оперонов фимбрий типа 1 (Δfim) или типа 3 (Δmrk1, Δmrk1,2), а также генов адгезинов и оперонов фимбрий типа 1 и 3 одновременно (ΔfimH ΔmrkD1,2 и Δfim Δmrk1,2 соответственно).

 

Рис. 3. Верификация мутантных штаммов К. oxytoca NK-1 (а) и схематичное изображение генотипов полученных мутантов (б). Генетические детерминанты фимбрий типа 1 и 3, которые обеспечивают адгезию энтеробактерий к биотическим и абиотическим поверхностям, инактивированы. Элиминацию генов адгезинов или целых оперонов фимбрий подтверждали с помощью ПЦР, используя пары праймеров к удаляемым элементам генома: генам адгезинов fimH и mrkD, оперонам fim, mrk1 и mrk2. Размеры амплификатов (п.н.), определенные с помощью электрофореза в агарозном геле, указаны на электрофореграммах. М – ДНК-маркер, дт – дикий тип, kan – мутантный тип до элиминации гена устойчивости к канамицину, мт – мутантный тип.

 

Инактивация генов фимбрий типа 3 повышает адгезию К. oxytoca NK-1 к клеткам эпителия легких

Адгезивные свойства мутантных штаммов исследовали с помощью тех же клеточных линий, белков, адсорбированных на полистироле, и чистого полистирола. Согласно полученным результатам, инактивация генов адгезинов и оперонов обоих типов фимбрий не влияла на адгезию бактерий к абиотическим поверхностям (РНКазе B, БСА и полистиролу), а также к линиям клеток эпителия кишечника Caco-2 и мочевого пузыря 5637 (рис. 4а). Однако на клетках эпителия легких H1299 адгезия мутантов по генам фимбрий типа 3 неожиданно повышалась; и этот эффект усиливался при последующем удалении генов фимбрий типа 1 у данного мутанта. Необходимо отметить, что инактивация только генов фимбрий типа 1 не влияла на адгезию бактерий. При этом фенотип мутантов по генам адгезинов не отличался от фенотипа мутантов по целым оперонам, что позволяет сделать вывод о том, что наблюдаемый эффект действительно вызван отсутствием в геноме детерминант адгезинов фимбрий типа 3. Так, уровень адгезии мутантов по одной копии гена адгезина ΔmrkD1 или оперона Δmrk1 к клеткам линии H1299 повышался относительно дикого типа на 34 ± 10 и 30 ± 5%, соответственно, мутантов по обоим генам адгезина (ΔmrkD1,2) и оперонов (Δmrk1,2) – на 79 ± 7 и 87 ± 4%, а мутантов по фимбриям типа 1 и 3 одновременно, то есть по генам адгезинов ΔfimH ΔmrkD1,2 и оперонам Δfim Δmrk1,2 – на 129 ± 12 и 140 ± ± 13% соответственно (рис. 4а).

 

Рис. 4. Адгезивные фенотипы мутантов с инактивированными фимбриями типов 1 и/или 3. Чтобы оценить влияние инактивации фимбрий на адгезию К. oxytoca NK-1 к клеткам эпителия легких H1299 (а), эффективность адгезии (%) каждого мутантного штамма рассчитывали как соотношение уровней адгезии мутантного штамма и штамма дикого типа, принятого за 100%. Чтобы оценить влияние маннозы на адгезию штаммов дикого типа и мутантов (б), рассчитывали эффективность адгезии (%) каждого штамма – отношение уровня адгезии после обработки маннозой (опыт) к уровню адгезии до обработки, принятому за 100% (контроль). *p < 0.05.

 

Инактивация фимбрий типа 1 не влияет на адгезию К. oxytoca NK-1 к клеткам эпителия кишечника и легких, а инактивация фимбрий типа 3 не влияет на адгезию к клеткам эпителия кишечника и мочевого пузыря, что согласуется с данными, описывающими колонизирующую способность К. pneumoniae в модели инфекции у мышей [39]. Однако полученные нами данные об отсутствии эффекта инактивации фимбрий на адгезию К. oxytoca NK-1 к полистиролу и клеткам эпителия мочевого пузыря отличаются от данных для К. pneumoniae [39, 40]. Так, инактивация фимбрий типа 1 или 3 негативно влияла на способность К. pneumoniae колонизировать мочевой пузырь и катетер в мышиной модели КАИМП [40]. Кроме того, инактивация фимбрий типа 3 подавляла способность К. pneumoniae к формированию биопленок на абиотической поверхности – процессу, ключевым этапом которого является неспецифическое прикрепление бактерий [39]. В то же время, в отличие от показанной нами повышенной адгезии мутанта К. oxytoca по фимбриям типа 3 к клеткам эпителия легких, аналогичная мутация у К. pneumoniae никак не сказывалась на способности бактерий колонизировать легкие мышей [39].

Мы предполагаем, что отсутствие влияния инактивации фимбрий типа 1 или 3 на адгезию бактерий к определенным субстратам связано с тем, что их удаление меняет белковый профиль внешней мембраны и в свою очередь вызывает стресс клеточной оболочки, на который бактериальная клетка реагирует компенсаторной экспрессией генов других адгезинов, в частности, сверхэкспрессией адгезинов, тропных к клеточной линии H1299 эпителия легких. Установлено, что у грамотрицательных бактерий реакция клеточной оболочки на стресс обеспечивается двухкомпонентной сигнальной системой Cpx, которая контролирует экспрессию многих генов, в том числе оперонов фимбрий [41, 42].

Компенсаторная экспрессия фимбриальных генов осуществляется за счет механизмов координированной регуляции на уровне как локальных, так и глобальных регуляторов и направлена на предотвращение биогенеза одновременно нескольких типов фимбрий для снижения энергозатрат [43, 44]. Это показано, например, для S-, P-, F1C-фимбрий и фимбрий типа 1 E. coli [45]. В ходе BLAST-анализа мы обнаружили в геноме К. oxytoca NK-1 еще три гипотетических гомолога оперонов шаперон-ашерных фимбрий из 10, описанных у К. pneumoniae [46, 47]: Kpa, Kpg и Ecp. Таким образом, адгезивный профиль мутантных штаммов К. oxytoca может объясняться компенсаторной экспрессией данных оперонов или других генов адгезинов, еще не идентифицированных.

Возможно также, что функциональные особенности фимбрий типа 1 и 3 К. oxytoca не обеспечивают их специфичность, характерную для соответствующих фимбрий у К. pneumoniae, а именно, адгезию к клеткам эпителия мочевого пузыря, гликопротеинам, БСА и полистиролу.

Поскольку у К. pneumoniae экспрессия оперонов фимбрий типа 1 и 3 подвержена компенсаторной регуляции [48], мы предположили, что сверхадгезивность мутанта К. oxytoca NK-1 по фимбриям типа 3 может быть связана с гиперпродукцией фимбрий типа 1. Чтобы понять это, мы исследовали влияние маннозы на адгезивные свойства мутантных штаммов. Поскольку адгезивный фенотип мутантов по генам адгезинов не отличался от фенотипа мутантов по целым оперонам соответствующих фимбрий (рис. 4а), в данном эксперименте использовали только мутантов по генам адгезинов. Перед адгезией бактерии (дикого типа и мутантные) обрабатывали 0.2 М маннозой и рассчитывали эффективность адгезии каждого штамма как отношение адгезии обработанных бактерий к адгезии необработанных, принятой за 100% (контроль). Манноза положительно влияла на адгезивность мутантов с одновременно инактивированными генами адгезинов обоих типов фимбрий в отношении клеток эпителия легких (рис. 4б). Обработка штамма дикого типа маннозой незначительно снижала его адгезивность – остаточная адгезия составляла 79 ± 2% от контроля. Наблюдаемый эффект может быть связан с функционированием маннозачувствительных фимбрий типа 1. Интересно отметить, что манноза не влияла на адгезию мутанта по адгезинам фимбрий типа 3 (ΔmrkD1,2) и неожиданно повышала адгезию мутанта по адгезинам фимбрий обоих типов (ΔfimH ΔmrkD1,2) на 30 ± 3% относительно контроля.

Согласно одной из разновидностей механизма РНК-интерференции [49], трансляция мРНК генного кластера mrkHIJ, расположенного на противоположной цепи после оперона фимбрий типа 3 и кодирующего его регуляторы, в нативном состоянии может быть частично подавлена за счет гибридизации 5´-удлиненного конца его транскрипта с 3´-удлиненным концом транскрипта mrk-оперона. В случае инактивации промотора фимбриальных генов можно было бы допустить, что измененный фенотип мутантов по фимбриям типа 3 вызван частичной дерепрессией кластера mrkHIJ, обусловленной отсутствием mrk-транскрипта, и, как следствие, изменением экспрессии других гипотетических генов адгезинов, перекрестными регуляторами которых являются продукты mrkHIJ. Тем не менее, поскольку инактивация была направлена лишь на структурные гены оперона и не затрагивала промоторы и регуляторные гены, дерепрессия mrkHIJ-кластера возможна лишь у мутанта по целым mrk-оперонам (ввиду полного отсутствия транскрипта), но не у мутанта по генам адгезинов mrkD – в этом случае продолжалось бы частичное подавление. Поскольку адгезивные фенотипы мутантов по генам адгезинов mrkD и целым mrk-оперонам не различались, мы не можем однозначно говорить о вкладе генов-регуляторов mrk-оперона в экспрессию других адгезинов.

Согласно опубликованным данным, манноза усиливает экспрессию генов вирулентности энтеробактерии Edwardsiella piscicida, патогенной для рыб, за счет связывания и активации маннозазависимого активатора транскрипции [50]. В геноме К. oxytoca нами обнаружен ген, на 73% идентичный этому гену-активатору, что позволяет предположить возможность его экспрессии в рамках ответа оболочки К. oxytoca на стресс, связанный с удалением фимбрий типа 3 или одновременно типов 1 и 3. В присутствии экзогенной маннозы это усиливает экспрессию генов адгезинов, тропных к клеткам эпителия легких.

Заключение

Нами показано, что адгезивный аппарат К. oxytoca NK-1 характеризуется многообразием компонентов, которые обеспечивают адгезию к широкому кругу субстратов и способны заменять друг друга. Это осуществляется благодаря перекрестной регуляции экспрессии соответствующих генов и обеспечивает быструю и эффективную адаптацию бактерий к разным экологическим нишам. В частности, высокий природный потенциал штамма К. oxytoca NK-1 к адгезии на клетках эпителия легких повышается при инактивации фимбрий типа 3, и этот эффект усиливается при одновременном отсутствии фимбрий типов 1 и 3, а также в присутствии экзогенной маннозы. Это радикально отличается от эффекта, наблюдаемого после аналогичных манипуляций с фимбриальными генами у близкородственного вида – К. pneumoniae, что может свидетельствовать об отличиях в регуляции механизмов адгезии у К. oxytoca. Учитывая возрастающую клиническую значимость К. oxytoca, важной представляется роль факторов, контролирующих функционирование фимбрий типа 3, которые обладают потенциальной способностью индуцировать компенсаторную сверхэкспрессию генов других адгезинов. Чтобы понять, как это может сказаться на патогенезе инфекций и, в первую очередь, пневмонии, необходимо дальнейшее изучение способности мутантов колонизировать легочный эпителий на животной модели, поскольку адгезины, обеспечивающие повышенную адгезию бактерий in vitro, могут служить антигенами для развития иммунного ответа in vivo в богатой фагоцитами легочной среде и тем самым ускорять элиминацию патогенов. Кроме того, для идентификации структур, обеспечивающих повышенную адгезию мутантов, требуется проведение транскриптомного и протеомного анализа. Таким образом, полученные нами данные поднимают вопросы о механизмах адгезии условно-патогенных бактерий К. oxytoca и приоткрывают новые перспективы в дальнейшем поиске мишеней для патоблокаторов и вакцин, контроля инфекций, вызванных этими возбудителями.

Мы благодарим доктора Rafał Kolenda, сотрудника лаборатории многопараметрического анализа Бранденбургского технического университета Cottbus-Senftenberg (Германия), за предоставление плазмид, использованных в работе.

Работа выполнена за счет средств Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета.

Настоящая работа выполнена без привлечения людей и животных в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

A. Giliazeva

Kazan Federal University

Autor responsável pela correspondência
Email: adeliyagilyazeva@gmail.com

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Rússia, Kazan, 420008

A. Mardanova

Kazan Federal University

Email: adeliyagilyazeva@gmail.com

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Rússia, Kazan, 420008

Bibliografia

Arquivos suplementares