GRIP1 is involved in the interaction of vimentin filaments with focal adhesions in endothelial cells

全文:

Сокращения: GRIP – белок, взаимодействующий с рецептором глутамата (Glutamate Receptor Interacting Protein); ВФ – виментиновые филаменты; ФК – фокальные контакты; GBD – GRIP-связывающий домен (GRIP-Binding Domain); PDZ – общий структурный домен из 80–90 аминокислотных остатков, обнаруженный в сигнальных белках бактерий, дрожжей, растений, вирусов и животных (Postsynaptic density-95/Discs large/Zona occludens-1); AMPA – α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота.

Введение

Виментиновые промежуточные филаменты – динамичные цитоскелетные структуры, положение и перемещение которых в цитоплазме зависит от микротрубочек и моторного белка кинезина-1 (далее просто кинезин) [1]. Деполимеризация микротрубочек [2], а также ингибирование кинезина [3] или нокаут генов его моторной тяжелой цепи [4] вызывают обратимую агрегацию виментиновых филаментов (ВФ) в околоядерной области, зависящую от АТР и актиновых филаментов [5]. Кинезин – универсальный моторный белок, который осуществляет транспорт разнообразных карго, а его активность в каждом отдельном случае определяется связанным с карго адаптерным (scaffolding) белком [6]. Адаптерный белок, опосредующий связывание кинезина с ВФ, неизвестен.

Детальное изучение процесса агрегации ВФ показало, что от основной массы агрегирующих филаментов отстают отдельные филаменты виментина, которые оказываются связанными с фокальными контактами (ФК) на периферии клетки [7]. Фокальные комплексы и более зрелые ФК играют важную роль в прикреплении и распластывании клетки и ее перемещении по субстрату. С участием интегринов устанавливается связь внеклеточного матрикса с цитоскелетом и рекрутируется комплекс сигнальных и адаптерных белков, чувствительный к внешним условиям [8]. Так, например, поток жидкости вдоль клеточной мембраны индуцирует реорганизацию ФК в клетках эндотелия [9]. Другим примером могут служить гладкомышечные клетки, в которых в ответ на механическое натяжение, имитирующее повышенное давление крови в сосуде, один из компонентов ФК, зиксин, мигрирует в ядро и выполняет там роль транскрипционного фактора [10].

Изменения в ФК передаются на элементы цитоскелета и корректируют поведение клетки, а воспринимающий сигналы цитоскелет, в свою очередь, влияет на структуру и функционирование ФК. Наиболее тесно с ФК связаны актомиозиновые стресс-фибриллы, вместе они обеспечивают чувствительность клетки к механическим воздействиям и согласованное направленное перемещение клетки в пространстве [11]. По микротрубочкам осуществляется транспорт различных карго к ФК, их функция необходима для обмена компонентов ФК и для внутриклеточной передачи сигналов [12]. Наконец, промежуточные филаменты, в частности ВФ, участвуют в стабилизации этих структур: ассоциация с ВФ замедляет обмен белков в ФК [13], а вызванный РНК-интерференцией нокдаун виментина, напротив, приводит к их частичной разборке [9].

Механизм влияния ВФ на ФК не установлен. Есть несколько кандидатов на роль посредника, обеспечивающего их взаимодействие. Прежде всего, сам виментин способен прямо связываться с β3-интегрином, и эта изоформа интегрина, по-видимому, удерживает ВФ на периферии, поскольку в отсутствие β3-интегрина они агрегируют [14]. Распределение ВФ контролируется также ассоциированным с ФК адаптерным белком Hic5, нокаут гена которого вызывает их коллапс [15]. Наконец, одна из изоформ цитолинкера плектина (P1f) локализуется на зрелых ФК в фибробластах и обеспечивает рекрутирование предшественников и сборку на них ВФ, обеспечивая тем самым их связь [16].

Как и повсюду в цитоплазме, точная доставка виментиновых полимеров к ФК зависит от микротрубочек и кинезина. Предполагается, что роль адаптера в этом процессе может играть белок GRIP1 (Glutamate Receptor Interacting Protein 1). Для такого предположения есть следующие основания: во-первых, GRIP1 напрямую связывается с тяжелой цепью кинезина [17]; во-вторых, GRIP1 участвует в доставке разнообразных карго; в-третьих, GRIP1 взаимодействует с некоторыми белками, входящими в состав фокальных комплексов – с зиксином [18] и тестином [19] (показано с использованием дигибридного анализа), а также с белком TRIP6 [20] и α-липринами [21], что продемонстрировано биохимическими методами.

В дополнение к этим данным в экспериментах на животных с инактивированным геном белка GRIP1 показано, что GRIP1 играет важную роль в прикреплении клеток к внеклеточному матриксу. Так, нокаут гена GRIP1 вызывал у мышей развитие синдрома Фрейзера, при котором нарушается связь между GRIP1 и Fras1 – белком внеклеточного матрикса, вовлеченным в регуляцию адгезии эпидермиса к базальной мембране [22]. Кроме того, из-за нарушения адгезии тромбоцитов к эндотелию у таких мышей задерживается образование кровяного сгустка [23].

GRIP1 – это белок с молекулярной массой около 130 кДа, содержащий семь PDZ-доменов (рис. 1а), благодаря которым он способен одновременно связываться с разными партнерами и организовывать многокомпонентные комплексы. Главным компонентом этих комплексов, помимо самого GRIP1, является моторный белок кинезин, который обеспечивает транспорт по микротрубочкам. Интересно, что GRIP1 взаимодействует не только с кинезином, но и с другим моторным белком – миозином VI [20]. Оба моторных белка связываются с участком LR2 GRIP1 (рис. 1а), и это связывание регулируется фосфорилированием Trp-956 в белке GRIP1. Фосфорилированный GRIP1 освобождается из комплекса с моторным белком посредством какого-либо члена семейства 14-3-3, который вытесняет кинезин или миозин VI из транспортного комплекса [20, 24].

Рис. 1. Характеристика анти-GRIP1-антител с использованием иммуноблотинга и иммунофлуоресцентного окрашивания. а – Схема строения молекулы GRIP1. б – Результат иммуноблотинга гомогената фибробластов крысы REF52 с анти-GRIP1-антителами. в – Клетки REF52, обработанные одновременно анти-GRIP1 и анти-виментиновыми антителами. г – Такое же окрашивание клеток REF52, предварительно обработанных колцемидом до полной деполимеризации микротрубочек. Масштаб 10 мкм на всех изображениях.

Ген белка GRIP1 экспрессируется в разных клетках и тканях, многие культивируемые линии клеток млекопитающих содержат заметное количество GRIP1. мРНК GRIP1 подвергается альтернативному сплайсингу, в результате которого образуются множественные варианты белка [25], различающиеся свойствами и функциями [26, 27]. Например, один из вариабельных N-концевых участков определяет, будет ли изоформа модифицирована остатком пальмитиновой кислоты и направлена в дендритные шипики, в то время как немодифицированный белок останется в теле нейрона [28].

Исходно GRIP1 был обнаружен в головном мозге как партнер субъединиц AMPA-рецепторов – трансмембранных белковых комплексов, обеспечивающих передачу нейромедиатора глутаминовой кислоты между возбуждающими нейронами в центральной нервной системе, что нашло отражение в его названии: Glutamate Receptor Interacting Protein [29]. Позже оказалось, что GRIP1 способен по отдельности связывать целый ряд белков, вовлеченных в функционирование АМРА-рецепторов на разных его этапах [30–37]. В этом процессе участвует и миозин VI, вовлеченный в эндоцитоз AMPA-рецепторов и их транспорт по актиновым филаментам в дендритах [38]. Помимо AMPA-рецепторов и ассоциированных с ними белков, GRIP1 участвует в доставке многих других карго, выполняя ряд важных функций в нейронах. В контексте этого исследования наиболее интересны такие партнеры GRIP1, как уже упоминавшиеся адаптерные (scaffolding) белки α-липрины, известные партнеры тирозинфосфатаз семейства LAR, которые играют важную роль в организации синапсов [22, 39]. Однако обнаружено также, что α-липрины локализуются в области ФК [40] и регулируют процесс их разборки [41].

Представленные в этой работе данные позволяют предположить, что GRIP1 может играть роль адаптера кинезина для ВФ и участвовать в их перемещении по микротрубочкам, по крайней мере, в эндотелиальных клетках. Предполагается, что GRIP1 нужен для доставки ВФ на периферию клетки и обеспечения тесного контакта виментина и ФК для их совместной стабилизации.

Экспериментальная часть

Плазмиды. Клетки человека с нокаутом гена GRIP1 получены по технологии CRISPR-Cas9 с использованием вектора pLentiV2, содержащего последовательность 5´-CTCCCGATACCGTCAGACCC гидовой РНК (вектор любезно предоставили Ameli Robert и Владимир Гельфанд, Northwestern University, Chicago, США). Для получения нокаута гена GRIP1 в клетках мыши олигонуклеотиды 5´-CACCCAGTGTTATGTTCCGAACTG и 5´-AAACCAGTTCGGAACATAACACTG объединили в дуплекс, который фосфорилировали и лигировали в вектор pSpCas9(BB)-2a-puro, разрезанный по сайту рестрикции Bbs1.

Вектор pCR-Blunt II-TOPO-GRIP1, содержащий инвертированную последовательность кДНК изоформы 3 GRIP1 человека (NCBI gene ID 23426; accession number 021150.4), получен от компании “Open Biosystems” (США). Для получения полноразмерного GRIP1, слитого с Myc6-тагом на N-конце, последовательность, кодирующую GRIP1, перенесли из исходного вектора в вектор pCS2-MT по KpnI и XbaI-сайтам рестрикции. ДНК, кодирующая N-концевую область GRIP1, слитую с His6-тагом на N-конце, получена путем ПЦР на матрице pCS2-MT-GRIP1 со следующими праймерами: 5´-ATGGATCCATAGCTGTCTCTTTTAAATGC, содержит сайт рестрикции BamH1, и 5´-ATAAGCTTCTGGTCAGTGGTGTTGGCCAG, содержит HindIII-сайт, и лигирования в вектор pQE80L по этим сайтам. Вектор, кодирующий тот же N-концевой участок GRIP1, но слитый на N-конце с GST, получен с помощью ПЦР на матрице pCS2-MT-GRIP1 с праймерами: 5´-ATCTCGAGATAGCTGTCTCTTTTAAATGC, включает сайт рестрикции XhoI, и 5´-CGCCACATCTGTCTGCAATAC. Продукт был лигирован в вектор pGEX4T-1, обработанный NotI, фрагментом Кленова и XhoI.

Вектор pcDNA3-hKHC, кодирующий тяжелую цепь кинезина-1, любезно предоставил Richard Wubbolts (Utrecht University, Нидерланды). Конструкцию, кодирующую GFP-GBD, клонировали, используя вектор pcDNA3-hKHC в качестве матрицы для ПЦР со следующими праймерами: 5´-AAGGTACCGCTACAAGAGTTAAAAAG с Kpn1-сайтом, и 5´-AAGGATCCAGTTGGAGAAGCTGCTGG с BamH1-сайтом. Продукт лигировали в вектор pEGFP-C1 по таким же сайтам рестрикции. Для получения GFP-GBDshort использовали такой же путь клонирования, но обратным праймером был 5´-AAGGATCCTTCTTTCAGTGCTGATTC.

Все конструкции ДНК проверяли секвенированием.

Плазмида, кодирующая зиксин человека, слитый с mKate-FP, получена от компании “Евроген” (Москва, Россия).

Антитела. Антитела кролика к белку GRIP1 получены и очищены в нашей лаборатории. Для этого векторную ДНК, кодирующую N-концевую часть GRIP1 (аминокислотные остатки 1–330 изоформы 3), слитую с His6-тагом на N-конце (His6-GRIP1-N), ввели в E. сoli штамм BL21(DE3). Бактерии растили в среде LB, собирали центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука. Лизат осветляли центрифугированием, рекомбинантный белок очищали хроматографией на Ni-NTA-агарозе (“Quigen”, США). Препарат белка был диализом переведен в PBS и использован для иммунизации двух кроликов. Для приготовления аффинной колонки тот же фрагмент GRIP1, слитый на N-конце с GST, синтезировали в клетках E. сoli (штамм BL21(DE3)), очищали на глутатион-агарозе (“Sigma-Aldrich”, США) и “привязывали” к BrCN-агарозе (“Sigma-Aldrich”). Для очистки антител фракцию иммуноглобулинов выделяли из сыворотки преципитацией в 50%-ном сульфате аммония, затем очищали антитела из этой фракции с помощью аффинной хроматографии.

В работе использовали следующие коммерческие антитела: антитела мыши к виментину V9 (“Sigma-Aldrich”); антитела мыши к винкулину hVin1 (“Novus Biologicals”, США); антитела мыши к белку нейрофиламентов NF-L 200/160 (“Sigma-Aldrich”). Антитела кролика к виментину мыши, обозначенные 3с8, получены предварительно в нашей лаборатории.

Иммуноблотинг. Для тестирования антител к GRIP1 клетки на чашках промывали 3 раза 0.25 М раствором сахарозы, лизировали в буфере Laemmli для образцов и прогревали при 98°С в течение 10 мин. Образцы подвергали электрофорезу в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ), переносили на нитроцеллюлозные фильтры (“Amersham Biosciences”, Великобритания) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре сначала с первичными, а затем с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (“Jackson ImmunoResearch Laboratories”, Великобритания). Все инкубации проводили в буфере PBS с 0.05% Tween 20 и 0.05% неиммунной сыворотки крупного рогатого скота, после каждой инкубации фильтры промывали тем же буфером без сыворотки. Сигнал выявляли с помощью цветной реакции с диаминобензидином (“Sigma-Aldrich”).

Культивирование клеток и трансфекция. Клетки млекопитающих REF52 и EA.hy926 инкубировали в среде DMEM (“Панэко”, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (“Sigma-Aldrich”), в атмосфере 5% CO₂ при 37°C. Клетки CAD поддерживали в таких же условиях, но в среде DMEM/F-12 (“Панэко”). Для индукции роста нейритов клетки CAD переносили в среду без сыворотки.

Для трансфекции клеток использовали реагент GenJector-U (“Молекта”, Россия). Через 4 ч после введения ДНК клетки снимали с подложки, обрабатывая раствором трипсина, переносили на покровные стекла и инкубировали в стандартной среде в течение следующих 24–48 ч.

Для нокаута гена белка GRIP1 клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей Cas9 и гидовую РНК и содержащей ген устойчивости к пуромицину. Через 4 ч после введения ДНК клетки обрабатывали раствором трипсина и переносили в 10 см чашки Петри, через 2 дня среду в чашках заменяли свежей, содержащей пуромицин (“Sigma-Aldrich”) в определенной заранее концентрации – минимальной концентрации, вызывающей гибель 100% клеток исходной культуры: 1.2 мкг/мл – в случае клеток CAD и 0.6 мкг/мл – в случае EA.hy926. Выделяли клетки, выжившие и образовавшие колонии, методом иммуноблотинга определяли в них присутствие белка GRIP1.

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки на покровных стеклах фиксировали 3%-ным параформальдегидом в PBS (10 мин при комнатной температуре) или метанолом при –20°С в течение 6 мин. Клетки инкубировали с антителами в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере в буфере PBS с 1% BSA и 0.1% Тритоном X-100: сначала с первичными антителами, затем со вторичными, конъюгированными с флуорохромами FITC или TRITC (“Sigma-Aldrich”). По окончании инкубации стекла монтировали на предметные стекла и изучали под микроскопом Zeiss Axiovert M200 (“Carl Zeiss”, ФРГ), оборудованным камерой Zeiss AxioCam MRm.

Иммунопреципитация. Опыт по иммунопреципитации проводили на клетках REF52. Клетки, выращенные на 12 чашках Петри диаметром 10 см, промывали 3 раза 0.25 M раствором сахарозы и лизировали на льду в буфере, содержавшем 20 мM HEPES, 1% Тритона X-100, 150 мM NaCl, 0.1 мM EGTA, pH 7.4, с добавлением ингибиторов протеаз (“Sigma-Aldrich”): 1 мл буфера на чашку. Лизат гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и осветляли центрифугированием при 40 000 g в течение 10 мин при 4°С. Экстракт был разделен на две части, которые параллельно инкубировали с 10 мкг антител против GRIP1, присоединенных к 4%-ной агарозе с белком А (“Sigma-Aldrich”). В качестве контроля использовали такую же порцию агарозы без добавления антител. Инкубацию проводили в течение 2 ч при 4°C. По окончании инкубации обе порции носителя промывали тем же буфером для лизиса клеток, суспендировали в 50 мкл буфера для образцов Laemmli, инкубировали при 95°С в течение 10 мин и подвергали электрофорезу и иммуноблотингу.

Результаты и обсуждение

GRIP1 связывается с виментиновыми филаментами

С целью изучения функций белка GRIP1 в клетках, отличных от нервных, были получены антитела к N-концевой области одной из изоформ белка GRIP1 человека, содержавшей первые три PDZ-домена (рис. 1а). Как показало сравнение изоформ GRIP1 человека, мыши и крысы, эти три PDZ-домена являются наиболее консервативными, хотя предшествующие первому PDZ-домену N-концевые последовательности могут различаться. С другой стороны, анализ первичной структуры с помощью программы Protein BLAST (National Center for Biotechnology Information) не обнаружил, помимо GRIP1, каких-либо других белков со значительным уровнем гомологии с белком GRIP1. Поэтому результат тестирования полученных антител методом иммуноблотинга гомогенатов культивируемых клеток оказался неожиданным. Антитела к такому рекомбинантному белку из сывороток двух разных животных выявляли, помимо компонента с молекулярной массой около 130 кДа, соответствовавшего белку GRIP1, еще несколько иммунореактивных компонентов (рис. 1б), разных в гомогенатах разных клеточных линий (см. также другие рисунки). Такой результат нельзя объяснить присутствием в образцах нескольких изоформ GRIP1, поскольку в соответствии с базой данных NCBI предсказанные молекулярные массы вариантов GRIP1 варьируют в пределах 111–129 кДа. По-видимому, этот результат обусловлен протеолизом GRIP1, тем более что в нескольких работах показана регулируемая деградация GRIP1 [42, 43]. Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемых клеток млекопитающих выявило сложный паттерн: анти-GRIP1-антитела декорировали некие везикулярные структуры, а также филаменты. Определить везикулы, вводя в клетки плазмиды, кодирующие те или иные маркеры различных органелл, и анализируя их колокализацию со структурами, окрашенными антителами к GRIP1, не удалось. Филаменты же были идентифицированы как виментиновые, поскольку окрашивались антителами V9 к виментину (рис. 1в). На рис. 1 для примера приведены фибробласты REF52, содержащие густую сеть ВФ; однако сходный паттерн наблюдался и в клетках других линий (см. далее).

Чтобы различить ВФ и микротрубочки, паттерны распределения которых часто совпадают, клетки инкубировали с колцемидом до полной деполимеризации микротрубочек и последующей агрегации ВФ в околоядерной области. В таких клетках агрегировавшие ВФ по-прежнему декорировались анти-GRIP1-антителами, и картина в мелких деталях совпадала с картиной окрашивания антителами к виментину (рис. 1в).

Как показал иммуноблотинг, сам виментин не связывал анти-GRIP1-антитела (рис. 2а), то есть их ассоциация с ВФ не была обусловлена прямым взаимодействием с виментином. Эта связь, по всей вероятности, обусловлена взаимодействием виментина с GRIP1, поскольку при использовании анти-GRIP1-антител для иммунопреципитации GRIP1 и связанных с ним белков из клеточного экстракта, виментин обнаруживался в иммунопреципитате (рис. 2б).

Рис. 2. Антитела к GRIP1 не взаимодействуют с виментином, но преципитируют его из клеточного экстракта. а – Два одинаковых иммуноблота с гомогенатом клеток CAD, параллельно обработанных антителами к GRIP1 и виментину. б – GRIP1 преципитирован из экстракта (1) клеток REF52; анти-GRIP1-преципитат (2) содержал виментин, в отличие от контрольного (3), полученного инкубацией такой же порции клеточного экстракта с чистыми агарозными гранулами с привязанным белком A.

Ингибирование связывания GRIP1 и кинезина нарушает распределение виментиновых филаментов

До сих пор функции GRIP1 изучали в основном на нейронах, поэтому имело смысл проверить, контролирует ли GRIP1 положение ВФ в линии клеток CAD мыши, которые сохранили в культуре многие свойства нейронов, в частности, способность выпускать длинные отростки [44]. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами к виментину показало, что при дифференцировке, которая начиналась при переносе клеток в бессывороточную среду, ВФ сначала концентрировались в местах формирования будущих нейритов, а затем пучки филаментов заполняли длинные отростки, то есть подвергались транспорту в направлении, характерном для кинезина – к плюс-концам микротрубочек [1], которые обращены к концам отростков.

Важность взаимодействия белка GRIP1 и кинезина для продвижения ВФ по отросткам, проверяли прежде всего с использованием уже известного способа его доминантно-негативного ингибирования. В предыдущих исследованиях функций GRIP1 в нейронах в качестве такого ингибитора использовали GRIP1-Binding Domain (GBD), представлявший собой участок тяжелой цепи кинезина, ответственный за связывание GRIP1 (аминокислотные остатки 808–935 тяжелой цепи кинезина (KIF5B) человека) [17] (рис. 3а). Экспрессия плазмиды, кодирующей GFP-GBD (но не GFP, служащий контролем), индуцировала агрегацию ВФ внутри тела клетки и предотвращала вход виментина в отростки (рис. 3б). Как видно на рис. 3б, эффект GFP-GBD проявлялся уже в довольно низкой (по сравнению с контрольными клетками) концентрации; высокая же концентрация GFP-GBD приводила к гибели клеток.

Рис. 3. Доминантно-негативное ингибирование взаимодействия GRIP1 с кинезином влияет на вход промежуточных филаментов (ВФ) в нейриты клеток CAD. а – Схема положения GBD (GRIP1 Binding Domain) на тяжелой цепи кинезина. б – Эффект присутствия GBD на распределение ВФ в клетках CAD. Клетки в полной среде трансфицированы плазмидой, кодирующей GFP-GBD, GFP (в качестве контроля) или GFP-GBD-short и через 20–24 ч перенесены в бессывороточную среду для индукции формирования отростков в течение последующих 48 ч. Затем клетки фиксировали и подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию: антителами 3c8 к виментину мыши (б), антителами к GRIP1 (в, изображения инвертированы для наглядности), антителами к α-тубулину DM1α (г) и антителами N2912 к белку NF-M нейрофиламентов (д). Масштабная линейка 10 мкм на всех изображениях.

В клетках CAD, инкубированных в полной среде, анти-GRIP1-антитела также выявляли два типа структур: везикулы и филаменты, которые в этих клетках были очень бледными (рис. 4б). Окрашивание клеток CAD, синтезировавших GFP-GBD, антителами к GRIP1, выявило преимущественную локализацию обоих белков в теле клетки (для визуализации отростков на рис. 3в, представлены инвертированные изображения). Совмещение двух изображений позволяет предположить колокализацию белков, однако из-за того, что тела клеток CAD, сформировавших отростки, плохо распластываются на субстрате, различить детали было невозможно, за исключением везикул, которые окрашивались антителами к GRIP1, но очевидно не связывали GFP-GBD (рис. 3в). Вместе с тем, окрашивание клеток, содержавших GFP-GBD, антителами к α-тубулину выявляло нормальное распределение микротрубочек (рис. 3г), поэтому эффект GFP-GBD можно было интерпретировать как затруднение в перемещении ВФ в направлении плюс-концов микротрубочек, то есть как нарушение работы кинезина.

Рис. 4. Нокаут гена белка GRIP1 меняет адгезивные свойства клеток CAD, но не препятствует заполнению отростков виментином. a – Иммуноблотинг с анти-GRIP1-антителами гомогенатов клеток CAD – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1. б – Сравнение иммунофлуоресцентного окрашивания клеток CAD – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1, анти-GRIP1-антителами. в – Фазово-контрастное изображение клеток CAD – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1, в полной и бессывороточной среде. г – Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к виментину клеток CAD (контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1), инкубированных в бессывороточной среде. Части б и г – масштаб 10 мкм.

Чтобы убедиться, что этот эффект специфичен в отношении ВФ, с которыми связан GRIP1, проверено влияние GFP-GBD на распределение в клетках CAD нейрофиламентов – еще одного типа филаментов, транспортируемых в нейронах кинезином [45]. Как можно видеть на рис. 3д, присутствие GFP-GBD аналогичным образом влияло и на вход в отростки нейрофиламентов. Следовательно, эффект этого доминантно-негативного ингибитора не был специфичным в отношении ВФ и GRIP1.

Причиной ингибирования транспорта промежуточных филаментов в отростки клеток CAD могло быть следующее обстоятельство: полипептид GBD содержит два важных для активности кинезина участка: первый (аминокислотные остатки 883–937) является сайтом связывания с микротрубочками [46], а второй (остатки 903–933) – это сайт автоингибирования [47] (рис. 3а). Поэтому нельзя было исключить, что эффект GFP-GBD обусловлен его связыванием с микротрубочками или моторным доменом кинезина, что должно препятствовать транспорту даже при нормальной системе микротрубочек. Чтобы проверить, критичен ли этот участок тяжелой цепи для GBD-индуцированного ингибирования кинезина, из плазмиды удалили последовательность, кодирующую аминокислотные остатки 883–935. Из рис. 3б видно, что белковый продукт GBD-short никак не влиял на распределение ВФ в клетках CAD.

GRIP1 вовлечен в формирование фокальных контактов

Поскольку доминантно-негативное ингибирование не дало однозначного результата, для истощения клеток CAD по белку GRIP1 применили метод CRISPR-Cas9. Как показал иммуноблотинг с анти-GRIP1-антителами, в результате использования такого подхода из клеток CAD-GRIP1-KO исчез компонент с молекулярной массой около 130 кДа, который соответствовал белку GRIP1, но все остальные иммунореактивные компоненты сохранились (рис. 4а).

При окрашивании клеток CAD с нокаутом гена GRIP1 анти-GRIP1-антителами везикулы были по-прежнему видны, однако декорирования ВФ уже не наблюдалось (рис. 4б). Этот результат позволил заключить, что ассоциация анти-GRIP1-антител с ВФ обусловлена присутствием полноразмерного белка GRIP1, а окрашивание везикул, по-видимому, определялось каким-то другим иммунореактивным компонентом, который пока не удалось идентифицировать.

Нокаут гена GRIP1 не лишил клетки CAD-GRIP1-KO способности формировать отростки, причем не только в бессывороточной, но даже в полной среде. Однако оказалось, что произошло снижение адгезии клеток CAD к стеклу или пластику: в отсутствие сыворотки они образовывали большие, плавающие в среде агрегаты, окруженные множеством длинных тонких нейритов (рис. 4в). Иммунофлуоресцентное окрашивание редких прикрепившихся клеток показало, что отростки клеток с нокаутом содержали виментин и никаких признаков коллапса ВФ в телах клеток не наблюдалось (рис. 4г). Нельзя исключить, однако, что в клетках, потерявших способность к адгезии и объединившихся в плавающие агрегаты, ВФ претерпели коллапс. К сожалению, проверить это предположение оказалось технически невозможным. Таким образом, пока не ясно, нужен ли GRIP1 для формирования отростков и транспорта в них ВФ, но он явно важен для обеспечения адгезии.

Поскольку адгезия зависит от силы ФК, можно предположить, что в клетках, истощенных по белку GRIP1, нарушено функционирование ФК. Однако из-за снижения адгезии к стеклу иммунофлуоресцентное окрашивание ФК в клетках CAD с нокаутом оказалось технически невозможным. Поэтому тот же метод CRISPR-Cas9 был применен к другой линии клеток – эндотелиальным клеткам человека EA.hy926, которые часто служат моделью при исследовании фокальных и других клеточных контактов.

Иммуноблотинг с анти-GRIP1-антителами показал, что из эндотелиальных клеток с нокаутом гена белка GRIP1 исчез также компонент с молекулярной массой 130 кДа, то есть полноразмерный GRIP1 (рис. 5а), при этом в клетках с нокаутом не наблюдалось декорирования виментиновых филаментов (рис. 5б).

Рис. 5. Нокаут гена GRIP1 в эндотелиальных клетках EA.hy926. а – Сравнение гомогенатов клеток EA.hy926 – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1, в иммуноблотинге с анти-GRIP1-антителами. б – Сравнение клеток EA.hy926 – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1 – по двойному иммунофлуоресцентному окрашиванию анти-GRIP1-антителами и антителами к виментину.

Поведение эндотелиальных клеток EA.hy926 тоже заметно изменялось после нокаута гена GRIP1. Они начинали объединяться в “островки” (рис. 6б), а их адгезия к субстрату заметно снижалась, так что их было гораздо легче снять с пластика обработкой трипсином. Более того, иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к маркеру ФК винкулину показало отсутствие выраженных ФК в клетках с нокаутом (рис. 6в).

Рис. 6. В истощенных по белку GRIP1 эндотелиальных клетках EA.hy926 отсутствуют ФК и меняется расположение ВФ. а – Фазово-контрастное изображение клеток EA.hy926 – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1. б – Распределение виментина (антитела V9) в клетках EA.hy926 – контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1, на простом стекле и стекле, покрытом поли-L-лизином. в – Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток EA.hy926 (контрольных и с нокаутом гена белка GRIP1) антителами к винкулину, маркеру ФК. Стрелками указаны ФК. Части б и в масштаб 10 мкм, а – 50 мкм.

В клетках EA.hy926–GRIP1-KO, как и в клетках CAD с нокаутом, не было заметно классического коллапса ВФ, однако наблюдалось очевидное перераспределение виментина: появлялись плотные пучки филаментов, особенно в краевых клетках “островков” (рис. 6б). По-видимому, эти виментиновые пучки оставались связанными с интегринами [14], так как на поверхности, покрытой поли-L-лизином, который препятствует связыванию интегринов с субстратом [48], пучки филаментов выглядели более рыхлыми (рис. 6б).

Попытка восстановить ФК в эндотелиальных клетках с нокаутом гена белка GRIP1 путем введения плазмиды, кодирующей изоформу 3 белка GRIP1 человека, не привела к успеху. По-видимому, с ФК связана некая другая изоформа белка.

Феномены разборки ФК в клетках эндотелия с нокаутом гена GRIP1 и резкого изменения адгезивных свойств клеток требуют дальнейшего изучения. На данном этапе можно лишь предположить, что GRIP1 неким образом способствует стабилизации ФК, например, через доставку к ним ВФ, которые, как уже показано, оказывают на ФК стабилизирующее действие [9, 13]. Интересно, что микротрубочки и происходящий по ним транспорт в таком случае играют двоякую роль, поскольку они необходимы и для противоположного процесса естественной разборки ФК и обмена их компонентов [49]. Так, деполимеризация микротрубочек вызывает рост ФК [48], который можно объяснить сдвигом равновесия в сторону их сборки и стабилизации, тем более что ВФ еще некоторое время остаются связанными с ФК [7]. На рис. 7 представлен результат одновременной визуализации ФК и филаментов, декорированных анти-GRIP1-антителами, выявляющий их колокализацию на периферии фибробласта.

Рис. 7. GRIP1 и фокальные контакты (ФК) колокализуются на периферии фибробласта. Взаимное расположение филаментов, декорированных анти-GRIP1-антителами (а), и ФК (б) в фибробласте REF52. ФК визуализированы по экспрессии плазмиды, кодирующей зиксин человека, слитый с флуоресцирующим белком mKate. Последнее изображение (г) является увеличенным участком, выделенным на совмещенном изображении (в).

Взаимодействие GRIP1 с кинезином и ключевая роль кинезина в транспорте ВФ в направлении плюс-концов микротрубочек давно установлены [6, 18]. Если GRIP1 это действительно адаптер, соединяющий кинезин с ВФ для их транспорта, то ингибирование их взаимодействия должно вызывать агрегацию ВФ, как это происходит при микроинъекции ингибирующих антител против кинезина [3] или при деполимеризации микротрубочек [2]. Причиной того, что в клетках CAD и EA.hy926, лишенных GRIP1, ВФ не агрегировали в околоядерной области, вероятно, может быть присутствие другого, отличного от GRIP1, адаптерного белка, который отвечает за поддержание распределения ВФ по всей цитоплазме и в отростках нейронов. В нейронах, моделью которых служат клетки CAD, ФК важны главным образом для направленного роста аксона, который происходит благодаря тому, что конус роста обладает механочувствительностью [50]. Вносит ли GRIP1 вклад в этот процесс, пока непонятно. Насколько прочно связывались концы отростков с субстратом и сохранились ли ФК в конусах роста при истощении клеток CAD по белку GRIP1, осталось неясным из-за технических трудностей. Что касается клеток эндотелия, то участие GRIP1 в качестве специального адаптера в поддержании связи ФК с ВФ может объясняться тем, что эндотелиальные клетки нуждаются в надежном контакте с субстратом для успешной пролиферации, а потеря связи с внеклеточным матриксом вызывает в них апоптоз [51].

Таким образом, в данной работе обнаружена, с одной стороны, ассоциация уже известного белка-адаптера кинезина GRIP1 с уже известным видом карго, транспортируемого кинезином – ВФ, с другой стороны, выявлена роль GRIP1 в поддержании адгезивных свойств у по крайней мере двух типов клеток и организации ФК в клетках эндотелия. Поскольку роль ВФ в стабилизации ФК убедительно показана, можно предположить, что для выполнения этой функции ВФ должны располагаться в непосредственной близости к ФК, то есть должны доставляться на периферию клетки посредством активного транспорта с помощью кинезина, и связь кинезина с ВФ осуществляет адаптерный белок GRIP1. Можно предположить также, что белок GRIP1 играет роль посредника, взаимодействующего с ВФ и неким компонентом ФК.

Выражаю глубокую благодарность моим коллегам: Владимиру Родионову (University of Connecticut Health Center, Farmington, США) – за помощь в приобретении плазмиды, кодирующей GRIP1, Ольге Плетюшкиной (МГУ, Москва, Россия) – за культуру клеток EA.hy926, Ameli Robert и Владимиру Гельфанду(Northwestern University, Chicago, США) – за культуру клеток CAD и CRISPR vector, а также за ценные критические замечания, Александру Минину (Институт белка РАН, Пущино, Россия) – за активное обсуждение работы, Наталии Мининой (Институт белка РАН, Пущино, Россия) – за техническую помощь и советы.

Эта работа поддержана Российским научным фондом (проект 23-74-00036).

Работа выполнена без привлечения животных и людей в качестве объектов исследования.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

F. Gyoeva

编辑信件的主要联系方式.
Email: fgyoeva@gmail.com
俄罗斯联邦, Pouschino, Moscow Region, 142290

参考

补充文件

附件文件

动作

1. JATS XML

下载

2. Fig. 1. Characterization of anti-GRIP1 antibodies using immunoblotting and immunofluorescence staining. a – Schematic diagram of the GRIP1 molecule structure. б – Result of immunoblotting of REF52 rat fibroblast homogenate with anti-GRIP1 antibodies. в – REF52 cells treated simultaneously with anti-GRIP1 and anti-vimentin antibodies. г – The same staining of REF52 cells pre-treated with colcemid until complete depolymerization of microtubules. Scale bar is 10 μm in all images.

下载 (406KB)

索引源数据

3. Fig. 2. Antibodies to GRIP1 do not interact with vimentin, but precipitate it from the cell extract. a – Two identical immunoblots with a homogenate of CAD cells treated in parallel with antibodies to GRIP1 and vimentin. б – GRIP1 was precipitated from the extract (1) of REF52 cells; the anti-GRIP1 precipitate (2) contained vimentin, in contrast to the control (3) obtained by incubating the same portion of the cell extract with pure agarose beads with bound protein A.

下载 (123KB)

索引源数据

4. Fig. 3. Dominant-negative inhibition of GRIP1 interaction with kinesin affects the entry of intermediate filaments (IF) into CAD cell neurites. a – Schematic representation of the position of GBD (GRIP1 Binding Domain) on the kinesin heavy chain. б – Effect of the presence of GBD on IF distribution in CAD cells. Cells in complete medium were transfected with a plasmid encoding GFP-GBD, GFP (as a control), or GFP-GBD-short and after 20–24 h were transferred to serum-free medium to induce process formation for the next 48 h. Cells were then fixed and subjected to immunofluorescence staining with anti-mouse vimentin 3c8 (б), anti-GRIP1 (в, images inverted for clarity), anti-α-tubulin DM1α (г), and anti-neurofilament protein NF-M N2912 (д). Scale bar is 10 μm in all images.

下载 (385KB)

索引源数据

5. Fig. 4. Knockout of the GRIP1 gene alters the adhesive properties of CAD cells but does not prevent the filling of processes with vimentin. a – Immunoblotting of control and GRIP1 knockout CAD cell homogenates with anti-GRIP1 antibodies. б – Comparison of immunofluorescence staining of control and GRIP1 knockout CAD cells with anti-GRIP1 antibodies. в – Phase-contrast image of control and GRIP1 knockout CAD cells in complete and serum-free medium. г – Immunofluorescence staining of control and GRIP1 knockout CAD cells incubated in serum-free medium with anti-vimentin antibodies. Panels б and г – scale bar 10 μm.

下载 (283KB)

索引源数据

6. Fig. 5. Knockout of the GRIP1 gene in EA.hy926 endothelial cells. a – Comparison of homogenates of EA.hy926 cells – control and with knockout of the GRIP1 protein gene, in immunoblotting with anti-GRIP1 antibodies. б – Comparison of EA.hy926 cells – control and with knockout of the GRIP1 protein gene – by double immunofluorescence staining with anti-GRIP1 antibodies and antibodies to vimentin.

下载 (129KB)

索引源数据

7. Fig. 6. GRIP1-depleted EA.hy926 endothelial cells lack FC and have altered HF locations. a – Phase-contrast image of EA.hy926 cells – control and with GRIP1 gene knockout. б – Distribution of vimentin (V9 antibody) in EA.hy926 cells – control and with GRIP1 gene knockout, on plain glass and glass coated with poly-L-lysine. в – Immunofluorescence staining of EA.hy926 cells (control and with GRIP1 gene knockout) with antibodies to vinculin, a FC marker. FC are indicated by arrows. Scale bars (б and в) are 10 μm, (a) – 50 μm.

下载 (589KB)

索引源数据

8. Fig. 7. GRIP1 and focal adhesions (FA) colocalize at the fibroblast periphery. Relative positions of filaments decorated with anti-GRIP1 antibodies (a) and FA (б) in REF52 fibroblast. FA are visualized by the expression of a plasmid encoding human zyxin fused with the fluorescent protein mKate. The last image (г) is an enlarged region highlighted in the merged image (в).

下载 (392KB)

索引源数据