Development of biological microchips on an aluminum support with cells made of brush polymers

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Анализ нуклеиновых кислот, занимающий важное место в клинико-диагностических исследованиях, включает как прямое определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК методом секвенирования, так и методы, основанные на взаимодействии исследуемой молекулы ДНК с другими молекулами ДНК с заданными характеристиками.

Анализ связывания нуклеиновых кислот с матрицей иммобилизованных на твердой подложке ДНК-зондов был предложен одновременно несколькими исследовательскими группами, в том числе и группой российских ученых под руководством А.Д. Мирзабекова, и получил название метода биочипов [1], или “microarray” в англоязычном варианте. Амплификация минимального количества анализируемого генетического материала методом ПЦР с одновременным флуоресцентным маркированием, последующий гибридизационный анализ продуктов ПЦР на микроматрицах олигонуклеотидных зондов и микроскопическая флуоресцентная цифровая регистрация результатов гибридизационного анализа стали мощным инструментом молекулярной биологии и медицины [2, 3]. Предварительная амплификация ДНК в отдельной пробирке с последующим гибридизационным анализом на биочипе потенциально опасны перекрестной контаминацией, что осложняет выполнение анализа и препятствует широкому практическому использованию метода. Ведутся активные исследования и разработки в области аналитических систем на основе микрочипов, связанные с переводом методологии ПЦР, особенно ПЦР в реальном времени, в формат микрочипов. Поиску решений для реализации мультиплексной ПЦР на биочипе посвящен ряд публикаций [4–7].

Ранее нами был продемонстрирован вариант твердофазной ПЦР с праймерами, иммобилизованными в ячейках биочипа с регистрацией результатов удлинения праймеров (primer extention) по встраиванию флуоресцентно меченных нуклеотидов [8–10].

Иммобилизация праймеров в перекрестно-сшитых гидрогелевых ячейках затрудняет диффузию ДНК-полимеразы и анализируемой ДНК-мишени к иммобилизованным праймерам. Низкая теплопроводность стеклянной подложки ограничивает использование мультиплексной ПЦР, проводимой в гидрогелевых ячейках на предметном стекле.

Для эффективной амплификации ДНК подложка чипа должна обладать высокой теплопроводностью и малой теплоемкостью. Чувствительность и специфичность ПЦР на чипе зависят от концентрации праймеров, иммобилизованных в ячейках чипа, сохранности их свойств и пространственной доступности для взаимодействия с компонентами реакционной ПЦР-смеси. При этом иммобилизованные олигонуклеотиды должны быть устойчивы в кипящей воде и не утрачивать гибридизационную активность.

В настоящей работе описывается изготовление бичипов с ячейками из гидрофильных щеточных полимеров, закрепленных одним концом на поверхности подложки. Ячейки из щеточных полимеров получали фотоиндуцированной радикальной полимеризацией “от поверхности” подложки при УФ-облучении через фотомаску методом фотолитографии. Подложкой служит алюминиевая фольга с поверхностью, герметизированной прочным полимерным покрытием. В ячейках биочипа ковалентно иммобилизовали олигонуклеотидные зонды. Работоспособность биочипа показана в гибридизационном анализе с синтетической ДНК-мишенью, представляющей собой участок экзона 7 гена ABO человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. В работе использовали фольгу из алюминиевого сплава марки АД (ГОСТ 618–2014) толщиной 100 мкм с неполированной поверхностью (Россия). Содержание алюминия в сплаве не менее 99.45%. Лист фольги нарезали на части размером 25 × 75 мм и использовали поштучно.

Поливинилацетат (ПВАц) марки M=100, ТУ 2215-001-98514529-2007, Россия. Моющее средство Ultrasonol, 11-Alkalisch (“Carl Roth” Art. 5354.1, Германия). 20 × SSPE-буфер (“Sigma” Art. S2015, США). ТЕ-буфер pH 8.0 (“Thermo Fisher Scientific”, Art. AM9849, США).

Все растворители и исходные реагенты аналитического качества получены из коммерческих источников и использовались без дополнительной очистки.

Оборудование. Ультразвукововая баня Elmasonic S30 (Германия), мульти-ротатор Multi Bio RS-24 (“Biosan”, Латвия), cушильный шкаф СНОЛ-3 (“ТермИКС”, Россия), шейкер с нагревом Heating thermoshaker MHR13 (“Hettich”, Германия), робот-манипулятор QArray (“Genetix”|, Великобритания), микроскоп Levenhuk Discovery Artisan 32 (Россия), аспиратор FTA-1 (“Biosan”).

Двухканальный портативный анализатоp флуоресцентного изображения [11]: канал флуоресценции красителя Cy5 с лазерным возбуждением при 650 нм, запирающим фильтром 690 ± 40 нм (“Semrock”, США); канал флуоресценции красителя Cy3 с лазерным возбуждением при 535 нм, запирающим фильтром 580 ± 27 нм (“Semrock”) и цифровой ПЗС камерой (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Pоccия).

Флуоресцентные изображения анализиpовали c помощью пpогpаммы ImaGeWare “БИОЧИП-ИМБ”.

Подготовка поверхности алюминиевых подложек. Поверхность подложки для удаления возможных загрязнений последовательно промывали: ацетоном в ультразвуковой бане в течение 10 мин (1); струей деионизированной воды в течение 1 мин (2); 2%-ным раствором моющего средства в деионизированной воде в течение 1 ч (3); промывали струей деионизированной воды в течение 1 мин (4); ацетоном в ультразвуковой бане в течение 10 мин (5). Подготовленные подложки сушили на открытом воздухе в течение 30 мин и хранили в эксикаторе до использования.

Модификация поверхности алюминиевых подложек 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС). Поверхности алюминиевых подложек поштучно обрабатывали в закрытой пробирке из полипропилена, содержащей 40 мл раствора АПТЭС. Предварительно вымытые подложки погружали в 16%-ный (об/об) раствор АПТЭС в толуоле и выдерживали в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем подложки промывали толуолом в ультразвуковой бане в течение 10 мин, ацетоном в ультразвуковой бане в течение 10 мин, сушили на открытом воздухе в течение 30 мин, хранили в эксикаторе до использования.

Активный флуоресцентный краситель. Краситель Cy5, его активное производное, пара-нитрофениловый эфир красителя Cy5-pNP, и аминосодержащий краситель Cy5-NH₂ синтезировали согласно [12].

Флуоресцентное маркирование аминогрупп на алюминиевой подложке по связыванию с красителем Cy5. Наличие активных групп на подложке проверяли, используя окрашивание красителем Су5. С этой целью на подложке формировали разборную камеру объемом 35 мкл с площадью подложки в камере 50 мм². В камеру вносили 35 мкл раствора активированного красителя Cy5-pNP с концентрацией 1 нмоль/мкл и диизопропилэтиламина (DIPEA) с концентрацией 60 нмоль/мкл в диметилсульфоксиде (DMSO) и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 ч. После окончания реакции раствор удаляли, камеру разбирали, подложки промывали струей деионизированной воды, 50%-ным раствором ацетонитрила в 50 мм триэтиламмонийгидрокарбонате (рН 7.5) в ультразвуковой бане (10 мин), струей деионизированной воды, сушили струей воздуха при комнатной температуре. Хранили в холодильнике при 5^°С до использования.

Приготовление растворов поливинилацетата. В пробирку с раствором бензофенона в метилэтилкетоне добавляли ПВАц М-100, пробирку закрывали и помещали в мультиротатор. Смесь перемешивали при 30–40 об/мин в течение 3 ч при комнатной температуре. Все работы с бензофеноном проводили с защитой от прямого солнечного света. Хранили при комнатной температуре.

Первое полимерное покрытие поверхности подложек. Подложки с аминированной поверхностью (Al-NH₂) покрывали раствором 2%-ного ПВАц и 1%-ного бензофенона в метилэтилкетоне при вращении (2400 об/мин, 2 мин) и сушили на воздухе в течение 1 ч. Для покрытия поверхности подложки раствором полимера при вращении использовали установку на основе мини-центрифуги с дисковым ротором, снабженным зажимами для подложек, который вращался в закрытом кожухе. Полимерное покрытие закрепляли прогревом при 100^°С в сушильном шкафу в течение 1 ч, затем облучали УФ-светом с λ = 254 нм в течение 1 ч. Облучение проводили бактерицидными лампами Philips TUV TL-D15W SLV с максимумом излучения 254 нм. Расстояние от колбы лампы до подложки 5 см. Получали алюминиевую подложку с поливинилацетатным покрытием (Al-ПВАц).

Модификация поверхности алюминиевой подложки, получение ячеек из щеточных полимеров. Подложку с Al-ПВАц покрывали вторым слоем раствора 1%-ного ПВАц и 0.5%-ного бензофенона в метилэтилкетоне при вращении со скоростью 2400 об/мин в течение 2 мин, сушили на открытом воздухе в течение 10 мин. Затем подложку помещали горизонтально в держатель, сверху на рабочую область помещали рамку, вырезанную из тетрафторэтилена толщиной 10 мкм, внутрь рамки вносили раствор акриловой кислоты и акриламида в деионизированной воде, сверху накладывали фотомаску и плотно зажимали в держателе. Рамка из тетрафторэтилена является кольцевым спейсером, определяющим расстояние от подложки до фотомаски, и формирует камеру высотой 10 мкм. Количество раствора, вносимого внутрь рамки, и накрывание сверху фотомаской обеспечивают отсутствие пузырей воздуха в камере. Фотомаска накладывается рабочей поверхностью вниз, чтобы препятствовать аберрации света при облучении. Фотомаска изготовлена на кварцевом стекле размером 25 × 75 мм и толщиной 1 мм со светонепроницаемым хромовым покрытием с прозрачными квадратными ячейками размером 200 × 200 мкм с шагом 600 мкм.

Камеру с раствором мономеров через фотомаску облучали УФ-светом с помощью осветителя ОИ-18А с кварцевой ртутной лампой ДРК-120 в течение 10 мин. Расстояние от осветителя до фотомаски составляло 10 см. После окончания облучения камеру разбирали, подложки поочередно промывали струей деионизированной воды в течение 1 мин, промывали на шейкере при комнатной температуре ацетоном в течение 10 мин и при 65°C деионизированной водой в течение 3 ч. Сушили струей воздуха при комнатной температуре.

Активация карбоксильных групп ячеек со щеточными полимерами. На подложке формировали разборную камеру объемом 35 мкл, площадь подложки в камере 50 мм². Готовили активирующий раствор N-гидроксисукцинимида (0.1 М) и EDC [1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорид] (0.2 М) в 0.1 М буферном растворе MES [(2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота] рН 5.0 при охлаждении на льду. В камеру вносили 35 мкл свежеприготовленного активирующего раствора. Реакцию вели в термостате при 37°C в течение 5 ч. После окончания реакции камеру разбирали, подложки промывали струей буфера MES рН 5.0, затем фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) рН 7.2, содержащим 1% Твин 20, в течение 10 мин. Подложки сушили струей воздуха при комнатной температуре. Хранили в холодильнике при температуре 5^°С до использования.

Флуоресцентное маркирование карбоксильных групп в ячейках из щеточных полимеров на алюминиевой подложке красителем Cy5. На подложке с ячейками из щеточных полимеров с активированными карбоксильными группами формировали разборную камеру объемом 35 мкл, площадь подложки в камере 50 мм². Площадь разборной камеры ограничивает только часть площади матрицы полученных ранее ячеек. Камеру позиционировали на подложке с неизменными заданными координатами относительно границ подложки с помощью держателя. В камеру вносили 35 мкл раствора аминосодержащего красителя Cy5-NH₂ с концентрацией 1 нмоль/мкл и DIPEA с концентрацией 60 нмоль/мкл в DMSO и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 ч. После окончания реакции раствор удаляли, камеру разбирали, подложки промывали струей деионизированной воды, 50%-ным раствором ацетонитрила в 50 мм триэтиламмонийгидрокарбонате (рН 7.5) на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре, струей деионизированной воды, сушили струей воздуха при комнатной температуре.

Синтез ДНК-зондов и синтетической ДНК-мишени. В качестве модели использовали синтетическую ДНК-мишень, соответствующую участку последовательности экзона 7 гена ABO человека (GenBank: NM_020469.3), который детерминирует серологический фенотип группы крови ABO. ДНК-зонды и синтетическую ДНК-мишень синтезировали по стандартной фосфорамидитной технологии с реагентами “Glen Research” (США) и последующей очисткой ВЭЖХ. Зонды № 268 (5'-NH₂-GCG ACC ACG TGG GC–Cy3–3') и № 269 (5'-NH₂-GCG ACC ATG TGG GC–Cy3–3') содержали на 5'-конце С6-аминомодификатор, а на 3'-конце краситель Cy3. Синтетическая модельная ДНК-мишень № 273: (5'-GCC CAC GTG GTC GC–Cy5–3') содержала на 3'-конце краситель Cy5. ДНК-мишень № 273 образует совершенный дуплекс с зондом № 268, а с зондом № 269 несовершенный, с заменой одного нуклеотида (подчеркнуты). Структура красителя Cy3 и его активного производного Cy3-pNP представлена на рис. 2.

Иммобилизация олигонуклеотидных зондов, маркированных красителем Cy3, в ячейках из щеточных полимеров на алюминиевой подложке (рис. 5г). Растворы ДНК-зондов с С6-аминомодификатором на 5'-конце с концентрацией 1 нмоль/мкл в 0.1 М карбонатном буфере (рН 9.0), содержащем 10% формамида и 5% глицерина, наносили роботом-манипулятором с иглой диаметром 200 мкм в ячейки с активированными карбоксильными группами по заданной раскладке чипа. Затем подложки инкубировали в герметичной камере с повышенной влажностью в течение 12 ч при 4°C и дополнительно 4 ч при 25°C. Влажность в камере поддерживали смесью вода/глицерин в соотношении 1/7. После окончания реакции подложки промывали струей деионизированной воды, дистиллированной водой, промывали в 50%-ным ацетонитрилом в 0.05 М триэтиламмонийгидрокарбонате (рН 8.0) в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере при 300 об/мин и деионизированной водой. Затем подложки выдерживали в 0.1 М растворе этаноламина в течение 1 ч при комнатной температуре для блокирования остаточных активных карбоксильных групп, многократно промывали деионизированной водой, капли жидкости с поверхности удаляли струей воздуха, сушили при комнатной температуре в течение 4 ч.

Гибридизация ДНК-мишени в ячейках из щеточных полимеров (рис. 5д). На подложке формировали разборную камеру объемом 35 мкл, площадь подложки в камере 50 мм². Готовили раствор ДНК-мишени в буфере SSPE с формамидом. Состав гибридизационного раствора: синтетическая ДНК-мишень 2 пмоль/мкл – 2 мкл; формамид 10 мкл; 20 × SSPE – 12 мкл; MgCl₂ 50 мМ – 0.8 мкл; вода без нуклеаз – 15.2 мкл. В камеру вносили 35 мкл раствора ДНК-мишени в гибридизационном растворе. Гибридизацию проводили в течение 16 ч при 37°C. После окончания реакции раствор удаляли аспиратором, в камеру вносили, а затем удаляли аспиратором 6 × SSPE (3 раза по 35 мкл). Камеру разбирали, подложку промывали 6 × SSPE, сушили струей воздуха при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы сообщали о разработке биочипа с ячейками из щеточных полимеров на подложке из пленочного полиэтилентерефталата (ПЭТ). Ячейки получали фотоинициируемой радикальной полимеризацией с переносом атомов, идущей “от поверхности” подложки. Для анализа ДНК методом гибридизации с иммобилизованными в ячейках ДНК-зондами вполне подходят подложки из ПЭТ [14]. Полимерные подложки, в том числе и из ПЭТ, плохо подходят для проведения мультиплексной ПЦР на чипе. Полимерные материалы обладают низкой теплопроводностью и высокой теплоемкостью, что ограничивает скорость термоциклирования и может приводить к неравномерному распределению температур в камере чипа с матрицей ячеек на подложке и, соответственно, будет негативно влиять на результаты ПЦР.

Для ПЦР на чипе хорошо подходят подложки из кремния [15]. Кремний обладает высокой теплопроводностью и низкой теплоемкостью. Получение якорных групп для иммобилизации молекулярных зондов на кремниевых подложках хорошо отработано. Но кремний дорог для одноразового использования, а многоразовое использование чипов в ПЦР-приложениях осложняется возможной перекрестной контаминацией.

Металлические подложки, прежде всего из алюминия, хорошо подходят по параметрам высокой теплопроводности и низкой теплоемкости. У алюминия теплопроводность даже выше, чем у кремния, а теплоемкость лишь незначительно уступает кремнию.

Но при контакте с алюминиевой поверхностью компоненты ПЦР сорбируются, ДНК начинает разлагаться, а полимераза дезактивируется. Поверхность алюминиевой подложки, на которой будет проводиться анализ ДНК, нужно герметизировать, чтобы исключить контакт компонентов ПЦР с алюминиевой поверхностью. Поверхность нужно покрыть тонкой герметичной полимерной пленкой. Полимерные материалы не сорбируют и не разлагают компоненты ПЦР, не ингибируют полимеразы. Полимерные покрытия толщиной в несколько сотен нанометров не влияют на теплоемкость и теплопроводность алюминиевой подложки.

Для прочного связывания с полимерным покрытием на поверхность алюминия нужно привить якорные химические группы. Поверхность алюминия в атмосферных условиях всегда покрыта оксидом алюминия. Оксид алюминия – это неорганический полимер, в котором атомы алюминия соединены кислородными мостиками, и имеются гидроксильные группы, связанные с атомами алюминия. Химические свойства гидроксильных групп оксида алюминия на поверхности металлического алюминия близки свойствам на поверхности стекла. Поэтому, используя химические методы модификации поверхности силикатных материалов, можно получить на поверхности алюминия якорные группы для дальнейшей модификации подложки. Модификация поверхности кремния, кварца, стекла, полисилоксанов реакцией с АПТЕС является ключевой стартовой реакцией для последующей функционализации этих материалов. Эту же реакцию используют и для модификации оксида алюминия на поверхности металлического алюминия. Так, для увеличения реактивности оксида алюминия поверхность алюминия обрабатывали кислородной плазмой [16], а также предварительно электрохимически анодировали, а затем прививали аминогруппы реакцией с АПТЕС [17].

 

Рис. 1. Схема аминирования и флуоресцентного маркирования поверхности алюминиевой подложки.

 

В нашей работе стояла задача получения на поверхности якорных аминогрупп для связывания с массивом полимерного покрытия, высокая плотность аминогрупп при этом не обязательна. На поверхности алюминиевой подложки свежий оксид алюминия с гидроксильными группами получали методом травления водным слабощелочным (рН 11) раствором моющего средства. В результате получали алюминиевые подложки с легким матовым налетом оксида алюминия (рис. 1 (Al-OH)). Затем подложки обрабатывали раствором АПТЕС в толуоле методом погружения в раствор. Получали подложки с аминированной поверхностью, рис. 1 (Al-NH₂).

 

Рис. 2. Структуры флуоресцентных красителей Cy5-pNP, Cy5-NH₂ и Cy3-pNP.

 

Наличие привитых аминогрупп, их концентрацию и распределение по поверхности алюминиевой подложки анализировали по связыванию с активным пара-нитрофениловым эфиром индодикарбоцианинового красителя Cy5-pNP (рис. 1). Структура красителя представлена на рис. 2.

Для измерения флуоресцентных сигналов использовали метод цифровой флуоресцентной микроскопии с регистрацией интенсивности сигналов в свете флуоресценции красителя Cy5. Флуоресцентная картина представлена на рис. 3.

 

Рис. 3. Микрофотография алюминиевой подложки в свете флуоресценции красителя Cy5 при выдержке 100 мс после модификации поверхности 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и маркирования флуоресцентным красителем Cy5. Показан график распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении.

 

Для количественной оценки концентрации молекул красителя, связавшихся с поверхностью подложки, был изготовлен калибровочный чип с ячейками, содержащими краситель Cy5 с пошаговой убывающей концентрацией молекул красителя на единицу поверхности. Измерения интенсивности флуоресценции подложек c ячейками, содержащими известную концентрацию красителя на единицу поверхности, показали, что флуоресцентный сигнал в 10 000 относительных единиц (о. е.) при выдержке 100 мс соответствует концентрации Су5 8.44 пмоль/см².

Флуоресцентные сигналы при выдержке 100 мс вдоль проведенной линии на рис. 3 колеблются от 3000 до 4300 о. е. С учетом темнового тока, сорбции красителя на поверхности и нулевой линии детектора изображения вычисленная концентрация красителя на поверхности алюминиевой подложки колеблется от 2.3 пмоль/см² в центре до 1.2 пмоль/см² по краям зоны регистрации при среднем значении 1.85 пмоль/см². Снижение интенсивности флуоресценции по краям зоны регистрации связано с неравномерностью освещения поля зрения регистрирующего прибора.

Молекулы красителя связываются с химически доступными аминогруппами в стехиометрическом соотношении 1 : 1. Концентрацию аминогрупп на поверхности алюминиевой подложки принимали равной концентрации красителя, связавшегося с аминогруппами. Погрешность, связанную с концентрационным тушением флуоресценции красителя, в данном случае не учитывали.

Влияние концентрации АПТЕС на концентрацию аминогрупп на поверхности алюминиевой подложки. При постоянном времени реакции АПТЕС с алюминиевой подложкой, равном 16 ч, концентрация аминогрупп на поверхности алюминия увеличивается с пошаговым увеличением концентрации АПТЕС и достигает максимального значения 2.3 пмоль/см² в присутствии 16% АПТЕС. Дальнейшее пошаговое увеличение концентрации АПТЕС вплоть до 32% не приводит к изменению содержания аминогрупп на поверхности алюминия.

Полимерное покрытие. Полимерное покрытие поверхности подложки должно быть плотным и водонепроницаемым, прочно держаться на алюминиевой поверхности со слоем оксида алюминия. При этом химические свойства покрытия должны позволять ковалентную иммобилизацию ДНК-зондов. Описаны методы покрытия поверхности квантовых точек, магнитных частиц и других наночастиц гидрофильными полимерами для придания им биосовместимости и устойчивости в коллоидном состоянии [19]. Гидрофильные покрытия не обеспечивают герметизацию покрываемой поверхности.

Мы использовали покрытие из умеренно гидрофобного водонерастворимого полимера, ПВАц. Бензофенон использовали в качестве фотоинициатора радикальной полимеризации мономеров и реагента, сшивающего полимерные макромолекулы ПВАц в трехмерную сетку при УФ-облучении [20, 21].

Покрытие делали двухслойным, первый слой предназначен для герметизации поверхности алюминия, второй – для прививки к поверхности щеточных полимеров.

Для первого слоя поверхность подложек покрывали тонким ровным слоем раствора, содержащим 2% ПВАц и 1% бензофенона в метилэтилкетоне, методом “покрытия при вращении” (spin coating). После испарения растворителя на поверхности подложки остается тонкий слой ПВАц. Полимерное покрытие закрепляли на подложке прогреванием с последующим УФ-облучением. При УФ-облучении “массива” ПВАц происходит перекрестное сшивание молекул ПВАц в трехмерную сетку и связывание с аминогруппами на поверхности подложки. Получали подложки с покрытием, которое не растворяется в органических растворителях, не отслаивается в воде при 100^°С и практически не флуоресцирует в оптическом диапазоне красителей Cy3 и Cy5.

Получение на алюминиевой подложке ячеек из щеточных полимеров. Для получения второго слоя поверхность подложек покрывали тонким слоем раствора, содержащего 1% ПВАц и 0.5% бензофенона в метилэтилкетоне, методом покрытия при вращении. Второй слой сушили только на воздухе. Назначение второго покрытия – прививка щеточных полимеров [22]. Подложки с двухслойным нанесением ПВАц использовали для получения ячеек из щеточных полимеров методом фотоиндуцированной радикальной полимеризации “от поверхности” подложки.

 

Рис. 4. Схема расположения ячеек на подложке биочипа после УФ-полимеризации через фотомаску.

 

В нашей работе для получения ячеек из щеточных полимеров на подложке с помощью кольцевого спейсера и крышки формировали реакционную камеру. Крышкой в данном случае была поверхность фотомаски. В камеру вносили раствор акриловой кислоты и акриламида в деионизированной воде. Облучали УФ-светом через фотомаску в течение 10 мин. После отмывки от несвязавшихся компонентов получали матрицу ячеек из щеточных полимеров (рис. 4, 5a).

 

Рис. 5. Схема получения ячеек из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки (а), активации карбоксильных групп (б), флуоресцентного маркирования карбоксильных групп (в), иммобилизации олигонуклеотидных зондов (г) и гибридизации с ДНК-мишенью (д).

 

При микроскопическом контроле на поверхности подложки в отраженном видимом свете видны светлые ячейки на темном фоне (рис. 6). При смачивании подложки водой с последующим удалением капель воды центрифугированием видно, что на гидрофобной подложке находятся гидрофильные ячейки одинакового размера с четко очерченными краями с координатами, соответствующими ячейкам фотомаски.

Полимерное покрытие и ячейки не растворяются и не отслаиваются от подложки при нагревании в деионизированной воде и в ТЕ (Трис-EDТА)-буфере (рН 8.0, 95°C) в течение 2 ч.

Активация карбоксильных групп ячеек со щеточными полимерами. Карбоксильные группы щеточных полимеров переводили в активные N-гидроксисукцинимидные эфиры. Реакцию проводили с N-гидроксисукцинимидом и водорастворимым карбодиимидом EDC в MES-буфере при рН 5.0 (рис. 5б). Получали подложки с ячейками из щеточных полимеров с активированными карбоксильными группами (рис. 5б).

Флуоресцентное маркирование карбоксильных групп в ячейках из щеточных полимеров на алюминиевой подложке красителем Cy5 (рис. 5в). Условия получения ячеек со щеточными полимерами и активацию карбоксильных групп оптимизировали по связыванию с красителем Cy5-NH₂. При микроскопическом контроле в отраженном видимом свете видно, что все ячейки сохраняются на своих местах, картина аналогична представленной на рис. 6.

 

Рис. 6. Микроскопическое изображение ячеек из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки в отраженном видимом свете. Ячейки размером 200 × 200 мкм с шагом 600 мкм.

 

На рис. 7 показаны ячейки из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки в свете флуоресценции красителя Cy5 после активации карбоксильных групп и присоединения красителя Cy5-NH₂. Показан график распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении. Видно, что ячейки на чипе достаточно однородные. Однородность ячеек сохраняется также от чипа к чипу.

 

Рис. 7. Картина флуоресценции ячеек из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки в свете флуоресценции красителя Cy5 при выдержке 10 мс после активации карбоксильных групп и присоединения красителя Cy5-NH₂. Показан график распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении.

 

На выдержке 10 мс среднее значение флуоресцентного сигнала после вычета фона составляет 20600 о. е., фоновое значение 1400 о. е. Отношение сигнал/фон (контрастность) равно 15.7. Этому значению при данной выдержке соответствует концентрация карбоксильных групп 170 пмоль/см². Ранее на поверхности полиэтилентерефталатных ПЭТ-подложек методом щелочного травления удалось получить карбоксильные группы с концентрацией только 8 пмоль/см² [23].

Подбор условий иммобилизации ДНК-зондов в ячейках из щеточных полимеров. Мы использовали двухэтапное изготовление матрицы ДНК-зондов. Первый этап включает получение гидрофильных ячеек одного размера с четкими границами, регулярно расположенными на гидрофобной поверхности подложки с высокой емкостью ковалентного связывания ДНК-зондов. При этом между ячейками имеется гидрофобная поверхность с низкой неспецифической сорбцией нуклеиновых кислот. Второй этап включает микрокапельное нанесение индивидуальных ДНК-зондов в заранее сформированные ячейки, по координатам ячеек, с раскладкой ДНК-зондов по заданной программе.

 

Рис. 8. Картина флуоресценции ячеек чипа на канале Cy3 с иммобилизованными ДНК-зондами при микрокапельном нанесении растворов, содержащих различные хаотропные реагенты. Выдержка 100 мс. Буфер карбонатный, рН 9.0, 5% глицерина. 1 – 10% формамида; 2 – 20% формамида; 3 – 10% DМSO; 4 – 20% DMSO; 5 – 0.01% Твин 20; 6 – 0.1% Твин 20; 7 – без добавок.

 

Для точного позиционирования микрокапельного нанесения робот-манипулятор дополнительно оснастили видеокамерой и управляющим программным обеспечением. Игла робота-манипулятора забирает из емкости микрокаплю раствора ДНК-зонда и переносит ее в ячейку. Раствор всасывается гидрофильной ячейкой и не растекается по гидрофобной поверхности. Для предотвращения высыхания в раствор добавляли глицерин. В растворах ДНК-зонды могут образовывать внутримолекулярные и межмолекулярные структуры, которые влияют на их химические свойства. Добавление в раствор хаотропных реагентов и поверхностно активных веществ снижает такое взаимодействие. На рис. 8 и 9 представлено изображение ячеек микрочипа в свете флуоресценции красителей Cy3, связанных с ДНК-зондами, иммобилизованными при микрокапельном нанесении растворов, содержащих различные хаотропные реагенты (рис. 8), или растворов, содержащих различные концентрации глицерина (рис. 9). Видно, что иммобилизация ДНК-зондов в ячейках из щеточных полимеров существенно зависит от состава раствора.

 

Рис. 9. Картина флуоресценции ячеек чипа на канале Cy3 с иммобилизованными ДНК-зондами при микрокапельном нанесении растворов, содержащих различные концентрации глицерина. Выдержка 100 мс. Буфер карбонатный, рН 9.0, 10% формамида. 1 – пустые ячейки; 2 – 5% глицерина; 3 – 10% глицерина; 4 – 20% глицерина.

 

Флуоресцентный контроль результатов иммобилизации ДНК-зондов в ячейках чипа позволил оптимизировать рН, температуру, время реакции, а также влажность камеры, в которой идет инкубация. Оптимальный состав раствора для нанесения ДНК-зондов в ячейки и ковалентной иммобилизации в ней: карбонатный буфер (рН 9.0), содержащий 5% глицерина и 10% формамида. При инкубации в сухой атмосфере ячейки высыхают, в избыточно влажной – происходит конденсация влаги в ячейках, и раствор растекается. Оптимальной является инкубация в атмосфере с влажностью, поддерживаемой смесью вода/глицерин в соотношении 1/7.

Иммобилизация ДНК-зондов в ячейках из щеточных полимеров (рис. 5г). Растворы ДНК-зондов № 268 и № 269 с помощью робота-манипулятора капельно наносили на активированные ячейки из щеточных полимеров на алюминиевых подложках, инкубировали, отмывали от несвязавшихся компонентов. При микроскопическом контроле биочипов после нанесения ДНК-зондов в отраженном видимом свете видно, что все ячейки сохраняются на своих местах, картина аналогична представленной на рис. 6.

На рис. 10 представлено изображение ячеек биочипа в спектральных условиях, специфичных для красителя Cy3 после иммобилизации олигонуклеотидных зондов, меченных Cy3. Показан график распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении ряда 2 для зонда № 269. Снижение интенсивности флуоресценции по краям зоны регистрации связано с неравномерностью освещения поля зрения регистрирующего прибора.

 

Рис. 10. Картина флуоресценции ячеек чипа на канале Cy3 после иммобилизации олигонуклеотидных зондов, меченных Cy3. Показан график распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении ряда 2 для зонда № 269.

 

Как следует из данных, представленных на рис. 10, края ячеек четко очерчены, ДНК-зонды не выявлены вне границ ячеек. Распределение сигналов в повторяющихся ячейках демонстрирует одинаковую дозировку растворов, нанесенных на заранее сформированную матрицу гидрофильных ячеек, расположенных на гидрофобной поверхности подложки. Гидрофобная поверхность вне границ гидрофильных ячеек является одним из ключевых факторов, приводящим к одинаковой дозировке растворов при их микрокапельном внесении в ячейки биочипа.

 

Рис. 11. Картина флуоресценции на канале Cy5 ячеек из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки после гибридизации с мишенью, маркированной красителем Cy5. Показаны графики распределения сигналов вдоль проведенной линии на флуоресцентном изображении ряда 1 зонда № 268 и ряда 2 зонда № 269.

 

Среднее значение сигналов для рядов 1 и 3 зонда № 268 на канале Cy3 после вычета фона составляет 22650 о. е. Для зонда № 269 среднее значение сигналов для рядов 2 и 4 на канале Cy3 после вычета фона составляет 23150 о. е. Это означает, что количество зондов, иммобилизованных в ячейках, различается. Причины могут быть различными. В том числе, разной может быть степень доступности аминогрупп на С6-аминомодификаторе из-за разницы в образовании внутримолекулярных и межмолекулярные структур ДНК-зондами.

Как следует из полученных данных, ячейки каждого зонда на чипе достаточно однородные как внутри ряда, так и между рядами. Внутри ячеек из щеточных полимеров сигнал распределен равномерно, что свидетельствует о равномерном распределении ДНК-зондов. От чипа к чипу однородность ячеек также сохраняется. Незначительное снижение интенсивности флуоресценции по краям зоны регистрации связано с неравномерностью освещения поля зрения регистрирующего прибора.

Гибридизация ДНК-мишени в щеточных ячейках. Раствор синтетической ДНК-мишени № 273 с красителем Cy5 на 3'-конце гибридизовали с иммобилизованными в ячейках ДНК-зондами, маркированными красителем Cy5 (рис. 5д).

При микроскопическом контроле в отраженном видимом свете видно, что все ячейки сохраняются на своих местах, полученная картина аналогична картине, представленной на рис. 6.

Изображение ячеек биочипа в свете их флуоресценции в спектральной области, специфичной для Cy3, после гибридизации ДНК-мишени идентично изображению, представленному на рис. 10, с полным сохранением интенсивности сигналов в индивидуальных ячейках биочипов. На рис. 11 в спектральной области, специфичной для красителя Cy5, показаны ячейки из щеточных полимеров на поверхности алюминиевой подложки после гибридизации с синтетической ДНК-мишенью № 273, маркированной красителем Cy5.

Среднее значение сигналов в рядах 1 и 3 зонда № 268 на канале Сy5 после вычета фона составляет 14900 о. е. В случае зонда № 269 среднее значение сигналов в рядах 2 и 4 на канале Сy5 после вычета фона составляет 8900 о. е. Дискриминационное отношение сигналов совершенных дуплексов к сигналам несовершенных дуплексов (зонд № 268/2699) на канале Cy5 после вычета фона составляет (14900/8900) 1.67.

Гибридизационный сигнал зависит не только от нуклеотидной последовательности ДНК-зондов, но и от их количества в ячейке. Зонды в ячейках иммобилизованы сайт-специфично с аминогруппой С6-аминомодификатора, не затрагивая экзоциклические аминогруппы нуклеотидов. Иммобилизованные таким методом ДНК-зонды полностью сохраняют способность к комплементарному взаимодействию с ДНК-мишенями. Поэтому можно вычислить гибридизационный сигнал, приходящийся на единицу иммобилизованного в ячейке зонда, т. е. нормировать гибридизационный сигнал на сигнал иммобилизованного зонда. Дискриминационное отношение нормированных сигналов более точно определяет разницу между сигналами совершенных и несовершенных дуплексов. Нормированный сигнал для зонда № 268 составляет (14900/22650) 0.658. Нормированный сигнал для зонда № 269 составляет (8900/23150) 0.384. Дискриминационное отношение нормированных сигналов совершенных дуплексов (зонд № 268) к нормированному сигналу несовершенных дуплексов (зонд № 269) составляет (0.658/0.384) 1.71.

Полученные значения дискриминационных отношений позволяют дискриминировать зонды, различающиеся заменой одного нуклеотида. Статистически значимыми принято считать различия зондов, у которых дискриминационное отношение гибридизационных сигналов больше или равно 1.4 [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения работы получены следующие результаты.

Разработан метод прививки якорных аминогрупп на поверхности подложек из алюминиевой фольги реакцией с АПТЭС с контролем концентрации аминогрупп по связыванию с флуоресцентным красителем с применением цифровой флуоресцентной микроскопии.

Разработан метод покрытия поверхности алюминиевых подложек тонким прочным умеренно гидрофобным слоем ПВАц, полимерные макромолекулы которого перекрестно сшиты с образованием трехмерной сетки, прочно связанной с поверхностью подложки.

Разработан метод получения ячеек из щеточных полимеров на поверхности подложек фотоиндуцированной радикальной полимеризации “от поверхности” с формированием методом фотолитографии матрицы ячеек размером 200 × 200 мкм с шагом 600 мкм. Гидрофильные ячейки с четко очерченными границами регулярно расположены на гидрофобной поверхности. Полимерное покрытие с ячейками не растворяется и не отслаивается от подложки при нагревании в деионизированной воде и в ТЕ (Трис-EDТА) рН 8.0 при 95°C в течение 2 ч. На полимерных цепях расположены реактивные карбоксильные группы.

Анализ связывания с флуоресцентным красителем позволил оценить концентрацию химически доступных карбоксильных групп в ячейках биочипа (рис. 5б), которая составила 170 пмоль/см². Ранее на поверхности ПЭТ-подложек методом щелочного травления удалось получить карбоксильные группы с концентрацией только 8 пмоль/см² [23].

Подобран состав растворов ДНК-зондов и условия их микрокапельного нанесения на заранее сформированную матрицу гидрофильных ячеек, обеспечивающие одинаковую дозировку ДНК-зондов и ковалентную иммобилизацию в повторяющихся ячейках.

С использованием гибридизационного анализа с синтетической ДНК-мишенью, представляющей собой участок экзона 7 гена ABO человека, показано сохранение гибридизационной активности иммобилизованных ДНК-зондов.

 

Представленные методы могут быть использованы для разработки технологии параллельного множественного экспресс-микроанализа нуклеиновых кислот “лаборатория на чипе” для выявления соматических и инфекционных заболеваний человека.

Авторы выражают благодарность Р.А. Юрасову за помощь в использовании компьютерной программы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-14-00287-П).

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей и использованием животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

I. Yu. Shishkin

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

G. F. Shtylev

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. E. Barsky

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

S. A. Lapa

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

O. A. Zasedateleva

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. E. Kuznetsova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. E. Shershov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. A. Vasiliskov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

S. A. Polyakov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. S. Zasedatelev

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. V. Chudinov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: chud@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files