Recombinant VLP vaccines synthesized in plant expression systems: current updates and prospects

全文:

Сокращения:

VLP (virus-like particles) – вирусоподобные частицы; AlMV (alfalfa mosaic virus) – вирус мозаики люцерны; CCMV (cowpea chlorotic mosaic virus) – вирус хлоротичной пятнистости вигны; CMV (cucumber mosaic virus) – вирус огуречной мозаики; CPMV (cowpea mosaic virus) – вирус мозаики вигны; HBV (hepatitis B virus) – вирус гепатита B; HCV (hepatitis C virus) – вирус гепатита C; HPV (human papillomavirus) – вирус папилломы человека; MaMV (malva mosaic virus) – вирус мозаики мальвы; PapMV (papaya mosaic virus) – вирус мозаики папайи; PhMV (physalis mottle virus) – вирус пятнистой мозаики физалиса; PTM (post-translation modification) – посттрансляционные модификации; PVY (potato virus Y) – вирус Y картофеля; TEV (tobacco etch virus) – вирус увядания табака; TMV (tobacco mosaic virus) – вирус табачной мозаики; ОРБ – общий растворимый белок.

ВВЕДЕНИЕ

Подавляющее большинство вакцин, используемых в настоящее время, получено классическими способами. Это либо инактивированные, либо живые аттенуированные патогены. Несколько особняком стоят вакцины, получаемые на основе инактивированных токсинов микроорганизмов и формирующие антитоксический иммунитет. Хотя эти традиционные вакцины многие годы с успехом применяют против широкого круга инфекционных заболеваний, они не лишены недостатков, связанных в основном с низкой иммуногенностью [1]. Поразившая весь мир пандемия COVID-19 заставила научное сообщество задуматься о разработке новых вакцин, высокоэффективных и иммуногенных. Сейчас основная задача состоит в том, чтобы разработать новые технологические подходы, которые позволят повысить иммуногенность вакцин без ущерба для их безопасности и переносимости. Последние достижения в создании вакцин на основе ДНК, мРНК и рекомбинантных вирусных векторов – новое направление в борьбе с трудноизлечимыми и новыми инфекционными заболеваниями [2]. Активно разрабатываемая в настоящее время технология вирусоподобных частиц (virus-like particles, VLP) представляет собой альтернативную платформу для разработки эффективных вакцин. Она основана на рекомбинантных антигенах, синтезируемых в различных системах экспрессии и способных собираться в VLP. Эта технология развивается параллельно с вакцинами на основе ДНК, мРНК и вирусных векторов [3]. VLP-вакцины гораздо более иммуногенны по сравнению с субъединичными, ДНК- и РНК-вакцинами, так как содержат многократно повторяющиеся антигенные эпитопы/детерминанты в правильной конформации, которые иммунная система эффективно распознает. Заметим, что низкая иммуногенность субъединичных вакцин часто обусловлена именно неправильной конформацией целевого антигена [4]. Кроме того, в случае субъединичных и мРНК- и ДНК-вакцин чаще всего необходимо введение в их состав адьювантов и проведение повторных вакцинаций для индукции протективного иммунного ответа [5].

Изначально, с середины XX века, термин “virus-like particles” использовали в вирусологии для обозначения видимых при электронной микроскопии частиц, которые предположительно были вирусами. С развитием биотехнологии этот термин приобретает новое значение: сейчас под VLP понимают частицы, лишенные вирусного генетического материала, состоящие только из капсидных и/или других вирусных белков [6]. Впервые VLP были получены в 1968 году в результате реассоциации белков оболочки вируса хлоротической крапчатости вигны (cowpea chlorotic mottle virus, CCMV) [7]. В 1976 году были получены VLP на основе белков вируса мозаики папайи (papaya mosaic virus, PapMV) [8]. Платформа VLP позволяет решать различные проблемы, которые связаны с традиционными вакцинами: возможную реверсию к вирулентной форме аттенуированных штаммов патогенов, низкую иммуногенность, длительный период формирования иммунного ответа для инактивированных вакцин, – и обеспечить сильный иммунный ответ [9]. VLP – это мультимерные самособирающиеся комплексы одного или нескольких вирусных белков, которые образуют наночастицы размером 20–200 нм (в случае палочковидных или нитевидных вирусов длина может быть больше), по форме близкие к нативному вирусу, но лишенные его генетического материала и поэтому не способные к репликации [9]. VLP могут служить вакциной не только от вирусов, белки которых были использованы для их сборки, но также содержать иммуногенные эпитопы других патогенов. Для их получения используют методы конъюгации белков, слияния генов или химической модификации. Это так называемые химерные, или гибридные, VLP [9, 10]. Благодаря своим размерам VLP свободно проникают в лимфатические узлы и легко узнаются антигенпрезентирующими клетками, что повышает их иммуногенность по сравнению с другими вакцинами как на гуморальном, так и клеточном уровне [11]. Наличие множества копий антигена на их поверхности – еще один фактор, увеличивающий эффективность VLP-вакцин. Кроме того, использование VLP в качестве вакцин гораздо безопаснее по сравнению с классическими и нуклеиновыми вакцинами, так как они не содержат генетического материала патогенов.

VLP могут быть синтезированы в различных экспрессионных системах, как прокариотических (Escherichia coli), так и эукариотических (дрожжи, клетки млекопитающих и насекомых, растения и их клеточные культуры). В представленном обзоре рассмотрены в основном VLP-вакцины, синтезируемые в растительных системах экспрессии. Растительные системы, по сравнению с другими, имеют ряд преимуществ.

Так как многие вирусные белки гликозилированы, а прокариоты не способны к посттрасляционным модификациям (post-translation modification, PTM), то для получения эффективных VLP-вакцин предпочтение отдают эукариотическим системам экспрессии. Паттерны гликозилирования у растений и животных сильно отличаются, поэтому для синтеза VLP предпочитают использовать гуманизированные растения или культуры их клеток [10]. Растительные системы экспрессии требуют значительно меньших материальных затрат, чем культуры клеток млекопитающих, легко масштабируются и лишены опасности контаминации патогенами человека и животных. Кроме того, вакцины на основе VLP вирусов растений, а также животных безопасны для окружающей среды в целом, так как лишены вирусного генетического материала. Проблемы низкого уровня экспрессии VLP в клетках растений и сайленсинга случайно встроенных в геном целевых генов в большинстве случаев могут быть решены в системах транзиентной экспрессии с использованием репликонных систем вирусов растений: например, BeYDV-репликона [12, 13] и MagnICON [13, 14], созданных на основе вирусов желтой карликовости фасоли (bean yellow dwarf virus, BeYDV) и табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV) соответственно.

СТРУКТУРА И ТИПЫ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ

VLP образуются в результате самопроизвольного взаимодействия одного или нескольких белков вируса, образуя единую наноструктуру. VLP структурно похожи на вирусную частицу, но лишены вирусного генома или содержат только его фрагмент. Чаще всего VLP собираются в сферические, палочковидные или нитевидные структуры – в зависимости от вида формирующего их вируса. VLP, состоящие из одного белка, имеют относительно простое строение, в то время как мультибелковые VLP могут содержать два или даже три слоя, причем с разной структурой. Более сложные VLP, например на основе белков вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) или вируса гриппа, имеют внешнюю фосфолипидную мембрану, в которую встроены антигенные детерминанты поверхностных белков вируса. По этому признаку принято делить VLP на два типа: безоболочечные, состоящие только из вирусных белков, и оболочечные (eVLP), окруженные фосфолипидной мембраной, заимствованной у клетки-продуцента (рис. 1).

 

Рис. 1. Общая схема строения безоболочечных (а) и оболочечных (б) VLP. 1 – Структурный белок вируса, формирующий монобелковую VLP (если вирусных белков несколько, то они формируют мультибелковую VLP, в которой может быть уже несколько слоев); 2 – фосфолипидная мембрана, образованная из мембраны эндоплазматического ретикулума клетки-продуцента; 3 – вирусные мембранные или трансмембранные гликопротеины.

 

Необходимость формирования у eVLP мембраны со встроенными вирусными гликопротеинами ограничивает выбор экспрессионных систем для их синтеза. Оба типа VLP могут нести эпитопы чужеродных антигенов, присоединенные к вирусным белкам тем или иным способом (конъюгация на уровне белков, слияние генов, химическая модификация) [15].

Безоболочечные VLP

Безоболочечные VLP состоят из множества молекул одного или 2–3 самособирающихся вирусных белков и не имеют фосфолипидной мембраны хозяина (рис. 1). Для их образования обычно достаточно экспрессии генов, кодирующих соответствующие белки, в используемой системе. Безоболочечные VLP до сих пор остаются наиболее привлекательной платформой для создания вакцин против многих патогенов, так как их легко получать и очищать [16]. Более того, безоболочечные VLP имеют значительно меньшие размеры, чем оболочечные, что позволяет им проходить через тканевые барьеры и проникать в лимфоузлы [17]. Безоболочечные VLP делятся на моно- и мультибелковые, а также на одно-, двух- и трехслойные. В качестве примера монобелковых VLP можно привести вакцины на основе вируса папилломы человека (human papillomavirus, HPV). Единственный капсидный белок этого вируса можно экспрессировать как в прокариотических, так и в эукариотических системах. В некоторых случаях простые VLP могут быть сформированы в бесклеточной среде. В этом случае растворимый белок сначала нарабатывается в клетке, а затем выводится наружу, где собирается в VLP правильной конфигурации [18, 19].

Получение мультибелковых безоболочечных VLP – более трудная задача. Они чаще всего многослойные, со сложным взаимодействием мономеров друг с другом [20]. Эти VLP обычно синтезируются и собираются в эукариотических системах экспрессии, таких как дрожжи [21], клетки насекомых [22] и растений [23]. Разные белки мультибелковых VLP могут быть синтезированы и собраны в одной клетке. В качестве примера мультибелковых многослойных VLP можно привести синтезированные в клетках насекомых VLP на основе белков вирусов блютанг [24], энтеровируса-71 [25], полиовируса [26] и ротавируса [27]. Также мультибелковые VLP были получены из белков L1 и L2 HPV 16 типа (HPV-16) [28].

Оболочечные VLP (eVLP)

По сравнению с безоболочечными, eVLP имеют более сложное строение (рис. 1). У них есть внешняя фосфолипидная мембрана, происходящая из клетки-хозяина, с заякоренными в ней одним или несколькими вирусными гликопротеинами [29]. Эти поверхностные гликопротеины служат главными антигенами для образования нейтрализующих эти вирусы антител. Для формирования eVLP необходимо выполнение следующих условий: совместной экспрессии нескольких генов структурных белков вируса, сборки их в наночастицы в клетке и высвобождения последних наружу. Сборка кора VLP и приобретение фосфолипидной оболочки предположительно происходят в эндоплазматическом ретикулуме [30, 31]. К сожалению, минимальные компоненты, необходимые для образования eVLP, недостаточно хорошо изучены и варьируют от вируса к вирусу. Обычно их образование происходит в два этапа. Сначала из структурных белков вируса собирается кор VLP, который затем инкапсулируется мембраной, чаще всего происходящей из эндоплазматического ретикулума клетки-хозяина. На этом же этапе к образованной фосфолипидной мембране eVLP присоединяются вирусные гликопротеины, представляющие его основные антигенные детерминанты. Самосборка eVLP и выход их из клетки зависят как от структуры белков кора, так и гликопротеинов оболочки вируса или от того и другого [32–34]. Так, для образования eVLP ретровирусов, например ВИЧ-1, достаточно экспрессии гликопротеина Gag, а в случае флавивирусов и коронавирусов – только гликопротеина оболочки [29].

Правильный фолдинг и гликозилирование поверхностных антигенов вируса в составе оболочечных eVLP-вакцин – чрезвычайно важные факторы для эффективного распознавания патогенов иммунной системой хозяина [35]. Например, мутантный вирус Зика, содержащий негликозилированный белок оболочки (Е), не вызывает у млекопитающих серьезного заболевания и индуцирует слабый иммунный ответ [36]. Показано, что гликозилирование белка E – один из факторов патогенности вируса Денге (DENV) [37]. Поскольку eVLP имеют фосфолипидную мембрану, полученную от клетки-хозяина, они значительно более чувствительны, чем безоболочечные VLP, к условиям внешней среды. Так, температурные сдвиги, а также процессы выделения и очистки могут привести к нежелательным воздействиям на их структуру. В некоторых случаях еVLP подвергают модификациям, вводя в них мутации, повышающие устойчивость к повышенной температуре [38]. Наиболее известны еVLP вируса гриппа [39], ретровирусов [40] и вируса гепатита C (hepatitis C virus, HCV) [30]. Сконструированы eVLP вируса болезни Ньюкасла, которые формировались при одновременной экспрессии белков HN, F, NP и M в клетках птиц. Эти наночастицы структурно напоминали нативные вирионы, сохраняли функциональную активность ассоциированных с оболочкой гликопротеинов. Эффективность формирования этих eVLP составила 84%, что позволяет получать их в больших количествах, необходимых для производства вакцины [41].

Химерные VLP

Химерные VLP, наряду со структурными белками одного вируса, содержат еще белки или иммуногенные эпитопы других патогенов. Химерные VLP считают наиболее эффективным инструментом для разработки вакцин, которые обеспечивают широкую и мощную комплексную защиту от инфекционных заболеваний [42]. Такие сложные наноструктуры, содержащие иммуногенные эпитопы разных вирусов, могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных векторов, содержащих как гены структурных вирусных белков, формирующих VLP, так и гены пептидов или белков других патогенов [43]. Химерные VLP имеют на своей поверхности множество сайтов, к которым методами генной инженерии или химической модификации могут быть присоединены антигены других вирусов [44]. Химерные VLP могут быть созданы как на основе безоболочечных, так и оболочечных вирусов. Несколько вакцин на основе химерных VLP уже проходят клинические испытания, включая вакцины против гепатита B (M2-HBcAg) и против малярии (MalaryVax) [29]. Также сконструированы вакцины против вируса гриппа A/Udorn/72 (H3N2) [43] и ВИЧ-1 [45, 46].

Химерные VLP-вакцины значительно более иммуногенны, чем субъединичные, и индуцируют сильный не только B-клеточный, но и T-клеточный иммунные ответы, включая как CD4⁺, так и CD8⁺ лимфоциты [47].

Разработаны и проходят клинические испытания химерные VLP-вакцины, предназначенные для борьбы с неинфекционными заболеваниями. На основе бактериофага Qβ созданы химерные VLP против артериальной гипертензии, рака, аллергического ринита, астмы, диабета, болезни Альцгеймера и даже от никотиновой зависимости [48, 49]. В экспериментах на животных продемонстрирована высокая эффективность вакцин против малярии [50, 51], некоторых онкологических [44, 51] и аутоиммунных заболеваний [49], болезни Альцгеймера [51, 52] и аллергических реакций [51]. Эти потенциальные вакцины, основанные на VLP вирусов растений: вируса огуречной мозаики (cucumber mosaic virus, CMV), вируса мозаики вигны (cowpea mosaic virus, CPMV) и TMV, – были высокоэффективны в экспериментах на животных [49–53].

ЭКСПРЕССИОННЫЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА VLP. РАСТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ

Для производства VLP-вакцин могут быть использованы различные системы экспрессии – как прокариотические, так и эукариотические. У каждой платформы есть свои преимущества и недостатки; их выбор определяется строением и сложностью получаемых VLP, а также балансом между выходом продукта и стоимостью процесса наработки рекомбинантного белка [11]. Эукариотические системы включают Baculovirus/insect cells (B/IC) [29], культуры клеток млекопитающих [54] и растения или их клеточные культуры [23]. Правильный выбор экспрессионной системы – важнейший фактор обеспечения корректного фолдинга и PTM белков, образующих VLP. Третичная структура VLP-формирующих вирусных белков и строение VLP могут различаться в разных экспрессионных системах из-за различий в гликозилировании и фосфорилировании, что влияет на иммуногенность вакцины, так как PTM антигенов часто необходимы для стимуляции иммунного ответа [54].

Нерастительные экспрессионные системы: преимущества и недостатки

Бактерии, в основном Escherichia coli, относятся к широко используемым экспрессионным системам для получения VLP. Однако в связи с рядом факторов, таких как отсутствие системы PTM, неправильное формирование дисульфидных связей и низкая растворимость синтезируемых рекомбинантных белков, бактериальные системы не подходят для синтеза еVLP [16], хотя вполне удовлетворяют требованиям для получения безоболочечных VLP с одним или двумя структурными вирусными белками [54].

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris часто используют для синтеза VLP, так как они быстро растут, продуцируют высокие уровни рекомбинантных белков, производят некоторые PTM, их культивирование не требует больших затрат и легко масштабируемо. Однако отсутствие метаболических путей для осуществления сложных PTM, высокоманнозное гликозилирование, более низкий по сравнению с бактериальными системами экспрессии выход рекомбинантных белков и склонность к потере плазмид значительно ограничивают использование дрожжевой платформы для синтеза VLP [29]. Тем не менее в дрожжевых системах экспрессии получены эффективные VLP-вакцины, например против вируса гепатита B (hepatitis B virus, HBV). Несмотря на отличные от клеток млекопитающих паттерны PTM, эта вакцина индуцировала высокий иммунный ответ [10].

Бакуловирусные системы экспрессии в культурах клеток насекомых (B/IC-системы) наиболее распространены для получения как безоболочечных, так и еVLP [29]. В этих системах уровни синтезируемых рекомбинантных белков сопоставимы с бактериальными и дрожжевыми платформами. В клетках насекомых происходят сложные PTM и формируются мультибелковые VLP [55]. К основным недостаткам B/IC-платформы относятся более простые по сравнению с млекопитающими паттерны N-гликозилирования, что может быть неприемлемо для некоторых VLP, а также плохая масштабируемость и высокая стоимость по сравнению с бактериальными системами экспрессии. Следует подчеркнуть, что паттерны гликозилирования могут быть изменены введением в геном клеток насекомых гликозилтрансфераз млекопитающих [56].

Культуры клеток млекопитающих и птиц считаются идеальной платформой для производства как безоболочечных, так и eVLP-вакцин, но и они не лишены недостатков. Это, прежде всего, высокая стоимость, трудности с масштабированием и возможность загрязнения патогенами клеток-продуцентов [29]. Бесклеточные экспрессионные системы имеют ряд преимуществ по сравнению с клеточными платформами и позволяют быстро нарабатывать требуемое количество VLP, не загрязненных клетками и клеточными компонентами. Но их коммерческое использование ограничено высокой стоимостью и плохой масштабируемостью [55, 57].

Растительные экспрессионные системы: преимущества и недостатки

Растительные системы экспрессии, как целые растения, так и их суспензионные клеточные культуры, обладают, по сравнению с другими экспрессионными платформами, рядом преимуществ. Это низкая стоимость производства и очистки рекомбинантных белков и VLP, возможность масштабирования, комплексное гликозилирование белков и отсутствие возможности контаминации патогенами млекопитающих. Современные технологии транзиентной экспресии, такие как MagnICON, BeYDV-репликон [12–14], Magnifection [58] и CPMV-HT [59], основанные на репликонах вирусов растений, позволяют быстро, в течение нескольких суток, синтезировать в растении до 5 г рекомбинантного белка на 1 кг сырой биомассы (до 80% общего растворимого белка) [58]. Общая схема растительных систем экспрессии, используемых для наработки рекомбинантных белков для получения VLP-вакцин, представлена на рис. 2.

 

Рис. 2. Схема биосинтеза рекомбинантных VLP в растительной системе экспрессии. Обозначения: PRO – промотор, TER – терминатор.

 

Транзиентная и ядерная системы экспрессии для наработки VLР-вакцин в растениях

Химерные или модифицированные вирусы растений, безопасные для животных и человека, широко используют в биотехнологии для создания вакцин. Более 50 вирусов растений в настоящее время служат основой для создания VLP и химерных вирусов, несущих на своей поверхности чужеродные антигены. Среди них TMV, CMV, вирус мозаики люцерны (AlMV), CPMV, CCMV, PapMV и X- и Y-вирусы картофеля (PVX и PVY соответственно). Химерные вирусы TMV, PVX, CPMV и CCMV оказались наиболее стабильными при высоких температурах и щелочных pH и могут быть получены в больших количествах в растениях-хозяевах [29, 60]. Показано, что CPMV и вирус легкой крапчатости перца (pepper mild mottle virus, PMMoV) высокостабильны в условиях пищеварительного тракта человека [61] и, следовательно, могут быть использованы для создания так называемых “съедобных” вакцин. Также многие вирусы растений используются или могут найти применение в дальнейшем для создания химерных VLP-вакцин [49, 62]. В табл. 1 представлены некоторые примеры такого использования растительных вирусов.

 

Таблица 1. Вирусы растений, используемые для создания кандидатных VLP-вакцин

VLP- формирующий вирус	Заболевание	Патоген	Антиген	Система экспрессии	Источник
AlMV	бешенство, гидрофобия	вирус бешенства	пептид Drg24 гликопротеина G (5–24 а. о.) и 31D-эпитоп	Nicotiana benthamiana	[63]
	ВИЧ-инфекция	ВИЧ-1	V3-домен белка gp120	N. benthamiana	[63]
	малярия	Plasmodium falciparum	белок Pfs25	N. benthamiana	[64]
	респираторная инфекция нижних дыхательных путей	респираторно-синцитиальный вирус	пептид G-белка (21 а. о.)	E. coli	[65]
CCMV	столбняк	Clostridium tetani	тетанотоксин	E. coli	[66]
	стрептококковая инфекция	Streptococcus agalactiae	пептид S9	Pichia pastoris	[67]
CPMV	стрептококковая инфекция	Streptococcus agalactiae	пептид S9	P. pastoris	[67]
	парвовирусный энтерит собак	парвовирус собак	пептид 3L17 белка VP2	Vigna unguiculata	[68]
PVY	гепатит B	HBV	эпитоп preS1	E. coli	[69]
	аллергия на кошек		аллерген кошек Fel d1	E. coli	[70]
MaMVa	грипп	вирусы гриппа A (H1N1 и H3N8)	M2e-пептид белка M2	E. coli	[71]
PhMVb	рак молочной железы		CH401-эпитоп белка HER2	E. coli	[72]
PapMV	гепатит С	HCV	эпитоп E2	E. coli	[73]
	грипп, пневмония	вирус гриппа и Streptococcus pneumonia	некодирующая оцРНК	E. coli	[74]
	листериоз	Listeria monocytogenes	некодирующая оцРНК	E. coli	[75]
TMV	поражения кожи и слизистой у кроликов	папилломавирусы кролика CRPV/ROPVс	эпитопы белка L2	N. benthamiana N. tabacum	[76]
CMV	псориаз		IL-17 + T-клеточный эпитоп титанотоксина	E. coli	[77]
	аллергия на кошек		Fel d1 + T-клеточный эпитоп титанотоксина
	болезнь Альцгеймера		Aβ1–6-эпитоп β-амилоида + T-клеточный эпитоп титанотоксина
TEVd	репродуктивный и респираторный синдром свиней	PRRSVe	эпитопы белков GP3, GP4, GP5 и M	E. coli	[78]

 

Помимо специфического иммунного ответа, вызванного присоединенными чужеродными антигенами, гибридные VLP на основе вирусов растений и целые модифицированные растительные вирусы способны вызывать сильные неспецифические иммунные реакции, то есть могут выступать в качестве сильных адъювантов. Этот эффект особенно важен при лечении неинфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний. Собственные антигены, расположенные на поверхности VLP вирусов растений, взаимодействуют с антигенпрезентирующими комплексами, что приводит к активации и увеличению числа нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток и, следовательно, к выработке широкого спектра интерлейкинов и хемокинов. Так, VLP на основе белков CMPV, как и исходный вирус, проявляют иммуномодулирующую активность, которая индуцирует регрессию опухоли [60]. За последние годы разработано более 100 экспериментальных вакцин, основанных на вирусах растений и их VLP. Они предназначены как для человека, так и для использования в ветеринарии и направлены против широкого круга заболеваний, включая онкологические, инфекционные и аутоиммунные [49–53]. В трех системах, использующих репликоны модифицированных вирусов растений (часть нежелательных или подлежащих контролю функций вируса передана другим компонентам экспрессионной системы), выявлено значительное усиление экспрессии VLP вирусов растений при транзиентной экспрессии. Это основанная на РНК-репликоне TMV система MagnICON [13, 14], на РНК-репликоне CPMV система CPMV-HT [59] и на ДНК-репликоне геминивирусов система BeYDV [12, 13].

Растительные системы экспрессии также широко используют для получения VLP на основе вирусов животных и человека. VLP безоболочечного вируса Норволк (Norwalk virus, NV), этиологического агента гастроэнтерита, успешно синтезированные в стабильно трансформированных растениях томата, картофеля, табака и салата, имели структуру, сходную с нативным NV, реплицирующимся в клетках кишечника человека. Очищенные VLP проявляли высокую иммуногенность на мышиной модели. Однако в этих системах экспрессии синтез VLP NV проходил медленно и выход составлял менее 1% от общего растворимого белка (ОРБ), что ограничивало их возможное использование в качестве вакцины. В системах транзиентной экспрессии MagnICON и BeYDV удалось повысить выход этих VLP более чем в 80 раз и получить в листьях Nicotiana benthamiana через 12 суток после инфильтрации 0.86 мг/г сырой биомассы [13].

Транзиентная экспрессионная система CPMV-HT, основанная на репликоне CPMV, была использована для синтеза гетеромультимерных VLP вирусов гриппа А (H1N1 и H5N1) в листьях N. benthamiana. Показано, что в этой транзиентной системе можно за несколько дней синтезировать в растении значительные количества VLP обоих штаммов вируса гриппа. Вирус гриппа оболочечный и содержит на поверхности вириона два белка: нейраминидазу (NA) и гемагглютинин (HA). Гликопротеин HA несет основные антигенные детерминанты вируса гриппа. Показано, что для создания сильного иммунного ответа достаточно присутствия на поверхности VLP белка HA. При транзиентной экспрессии HA в N. benthamiana образовавшиеся VLP концентрировались в пространстве между цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой, что облегчало их выделение. Авторами показано, что на платформе CPMV-HT можно продуцировать в растении химерные VLP, несущие HA сразу нескольких штаммов вируса гриппа, что значительно расширяет спектр действия вакцины. Процесс легко масштабировать и получать за месяц столько доз вакцины, сколько другими конвенциональными методами достигается за год [79]. Эта же транзиентная система была использована для создания VLP вируса птичьего гриппа А(H7N9); их высокая иммуногенность продемонстрирована на мышиной модели [80]. На базе транзиентной платформы CPMV-HT в листьях N. benthamiana получены VLP, сформированные четырьмя белками вируса африканской чумы лошадей (African horse sickness virus, AHSV). Продемонстрирована способность этой вакцины вызывать сильный иммунный ответ на AHSV в экспериментах на морских свинках [81]. В последнее время для синтеза рекомбинантных белков и VLP в промышленных масштабах широко используют основанную на системе CPMV-HT платформу транзиентной экспрессии pEAQ-HT, обеспечивающую высокий выход целевых продуктов [82].

Вирион HBV несет поверхностный белок HBsAg, способный формировать VLP. Ген, кодирующий HBsAg, перенесли в геномы картофеля, томата, люпина и салата и из биомассы этих растений выделили VLP HBsAg. Однако их выход был очень низким – микрограммы на грамм сырого веса, что недостаточно для дальнейшего их использования в качестве растительной вакцины. И только использование платформы транзиентной экспрессии позволило повысить выход VLP HBsAg до 2 мг/г [60, 83]. Следовательно, этот подход можно считать перспективным для создания вакцины против гепатита В.

На основе AlMV и поверхностного белка Pfs25 малярийного плазмодия (Plasmodium falciparum) создана антималярийная вакцина Pfs25 VLP-FhCMB (Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, США), транзиентно нарабатываемая в листьях N. benthamiana; в ходе клинических испытаний продемонстрирована ее безопасность и высокая иммуногенность [50, 84]. Канадская биофармацевтическая компания “Medicago Inc.” разработала эффективную платформу транзиентной экспрессии рекомбинантных белков в листьях N. benthamiana для получения VLP-вакцин против инфекций, вызванных вирусами гриппа, коронавирусами, ротавирусами и норовирусами [85]. Недавно компания сообщила о создании квадривалентной VLP-вакцины, защищающей сразу от 4 штаммов сезонных вирусов гриппа. В ходе клинических испытаний этой вакцины выявлена высокая иммуногенность и сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ [86].

Этот же подход был использован для создания VLP-вакцины Covifenz (разработка Medicago in Canada & GlaxoSmithKline, UK) против SARS-CoV-2, содержащей рекомбинантный белок шипа (S), модифицированный для улучшения его стабильности и формирования VLP. S-белок образует тримеры, заякоренные в липидной оболочке VLP, сформированной из клеточной мембраны N. benthamiana [87]. Протективная эффективность вакцины Covifenz составляет 78.8% [88]. Другая VLP-вакцина против SARS-CoV-2, разработанная компанией “Kentuky Bioprocessing” (США), KBP-201, основана на VLP TMV и рецепторсвязывающем домене (receptor-binding domain, RBD) белка S. Оба компонента были совместно синтезированы в транзиентной системе N. bentahmiana и затем химически сшиты в процессе очистки. Для повышения стабильности вакцины KBD-201 последовательность RBD белка S была слита с Fc-доменом IgG1 человека, а также с пептидом экстенсина N. benthamiana, обеспечивающим секрецию рекомбинантного белка в апопласт [89]. В экспериментах на мышах показана протективная эффективность этой вакцины: около 100% при двукратном введении [90]. Серию SARS-CoV-2 VLP-вакцин разрабатывает компания “iBio, Inc.” (США): IBIO-200, IBIO-201 и IBIO-202. Вакцины основаны на полноразмерном S-белке с применением технологии FastFarming и транзиентной системы экспрессии в N. benthamiana [91].

Вирус Зика (Zika virus, ZIKV) относится к семейству Flaviviridae, как и вирусы Денге (Dengue virus, DENV), Западного Нила (West Nile virus, WNV), клещевого энцефалита (tick-borne encephalitis virus, TBEV), японского энцефалита (Japanese encephalitis virus, JEV) и желтой лихорадки (yellow fever virus, YFV). Гликопротеин оболочки ZIKV (zE) состоит из трех доменов (EDI, EDII и EDIII) и отвечает за сборку вируса, прикрепление к клеточным рецепторам и последующее слияние мембран при проникновении вируса в клетку. Гликопротеин zE также – основная мишень иммунного ответа хозяина [92]. Поскольку вирусы ZIKV и DENV генетически очень близки и эти инфекции совместно циркулируют в человеческой популяции, то вакцины против одной инфекции могут вызывать перекрестные реакции с другой и, как следствие, приводить к антителозависимому усилению инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) второго возбудителя, что затрудняет создание вакцин [93]. Экспериментальная VLP-вакцина против ZIKV, основанная на структурном белке нуклеокапсида (coat protein, HBcAg) HBV, слитого с EDIII ZIKV (HBcAg–zEDIII), и транзиентно экспрессируемая в N. benthamiana, индуцировала в мышах как B-, так и T-клеточный иммунный ответ. Важно, что эта вакцина не вызывала ADE по отношению к DENV [92]. Другая экспериментальная вакцина против ZIKV создана на основе VLP CMV, в состав которого введен эпитоп тетанотоксина Clostridium tetani и EDIII ZIKV. В экспериментах на мышах вакцина индуцировала высокие уровни ZIKV-нейтрализующих антител и не вызывала ADE при DENV-инфекции [94].

Экспериментальная VLP-вакцина против DENV, tHBcAg-cEDIII, транзиентно синтезируемая в N. benthamiana, сконструирована на основе VLP HBV и EDIII DENV. Вакцина эффективна против 4 серотипов DENV. Для лучшего представления EDIII-эпитопа иммунной системе этот домен был встроен в иммунодоминантную область петли c/e1 HBcAg так, чтобы он оказался на шиповидных структурах собранных частиц. Иммунизация мышей вызвала высокие титры антител к DENV через 4 недели после введения вакцины [95]. Другая кандидатная VLP-вакцина против DENV, транзиентно синтезируемая в листьях N. benthamiana, основана на VLP, получаемых на основе полноразмерного белка Е DENV. Продемонстрирована ее более высокая иммуногенность и эффективность по сравнению с VLP DENV EDIII [96].

Недавно были получены VLP TBEV, транзиентно cинтезируемые в N. benthamiana и основанные на вирусных белках C и prM-E. Образование VLP подтвердили микроскопически и серологически, но в экспериментах на мышах, которым перорально вводили свежие листья N. benthamiana + VLP TBEV, не выявили никакого иммунного ответа. Скорее всего, отсутствие иммунной реакции связано с разрушением VLP в желудочно-кишечном тракте животных [97]. Однако такие же VLP TBEV, полученные ранее в клетках насекомых, были высокоиммуногенными при парентеральном введении и вызывали у мышей образование антител к вирусу [98]. Экспериментальная VLP-вакцина против JEV была создана на основе VLP вируса мозаики бамбука (BaMV) и EDIII JEV. Эти VLP транзиентно нарабатывали в N. benthamiana и в листьях Chenopodium quinoa. Иммунизация мышей этой вакциной приводила к выработке у них JEV-нейтрализующих антител [99].

Флавивирус WNV переносится птицами и комарами и широко распространен по всему миру [100]. Создано большое число кандидатных вакцин против WNV, в том числе две экспериментальные VLP: на основе prM-E WNV (содержит полноразмерный вирусный белок E) и химерная на основе HBV и EDIII WNV. Эти VLP-вакцины были транзиентно синтезированы в листьях N. benthamiana и вызывали у мышей сильный B- и T-клеточный ответ [101, 102].

Распространенные в человеческой популяции штаммы HPV высокого онкогенного риска считаются основной причиной развития рака шейки матки у женщин. Основной белок капсида HPV, L1, способен к самосборке в VLP, морфологически подобные нативным вирионам и несущие на поверхности его основные антигены. Эти VLP могут индуцировать сильный иммунный ответ как B-, так и T-клеток [103]. За последние годы получено множество кандидатных противораковых VLP-вакцин на основе белка L1 HPV-16 и HPV-11. Некоторые из них содержат либо модифицированный белок L1, либо несут дополнительные белки HPV, например L1E6/E7 или L1/L2, либо содержат фрагменты белков других вирусов. Гены для синтеза этих VLP либо встраиваются в ядерный геном, либо транзиентно экспрессируются в различных раcтениях: N. benthamiana, N. tabacum, Solanum licopersicum, S. tuberosum, Arabidopsis thaliana. Наиболее полный список этих экспериментальных противораковых вакцин приведен в обзоре B. Shanmugaraj с соавт. [104].

Трансмембранный белок gp41 оболочки ВИЧ-1 играет важную роль в проникновении вируса через слизистые и инфицировании CD4⁺-клеток. Полипептид Gag – важный структурный компонент ВИЧ-1, который образует капсид и несет важные антигенные детерминанты вируса. Совместная экспрессия этих белков (полноразмерного Gag и модифицированного gp41, dgp41) – как стабильная ядерная, так и транзиентная – в листьях N. benthamiana приводит к образованию оболочечных VLP, которые в дальнейшем могут служить основой для создания вакцины против ВИЧ-1 [105].

Другие методы получения белковых наночастиц в клетках растений для производства вакцин

Трансформация хлоропластов, по сравнению с ядерной, имеет целый ряд преимуществ. Прежде всего, за счет большого числа хлоропластных геномов (пластомов) – до 10 000 на клетку (рис. 2) – она обеспечивает высокий уровень экспрессии трансгенов, сопоставимый с методами транзиентой экспрессии, но который, в отличие от последних, стабилен. Трансформация хлоропластов происходит адресно по механизму гомологичного обмена, позволяет избежать инактивации трансгенов и дает возможность создавать искусственные опероны из нескольких белков. Кроме того, двойная мембрана хлоропласта защищает рекомбинатные белки от расщепления цитозольными протеазами, а наследование хлоропластов по материнской линии исключает вероятность переноса пыльцой трансгенов на другие растения. В то же время неспособность посттрансляционного аппарата хлоропластов осуществлять гликозилирование может значительно снижать эффективность синтезируемых в них VLP-вакцин. Кроме того, трансформация пластид происходит с низкой частотой и возникают проблемы при отборе гомопластомных и гомопластидных растений [106, 107]. В связи с этими недостатками, несмотря на всю привлекательность транспластомных растений, синтезировать VLP-вакцины в хлоропластах удавалось только в нескольких единичных случаях.

Ген белка L1 HPV-16 методом биобаллистической трансформации был встроен в хлоропластный геном N. tabacum, а последующий многоступенчатый отбор привел к получению гомопластомных и гомопластидных растений, стабильно синтезирующих рекомбинантный белок L1 в хлоропластах. По сравнению с количеством L1, получаемым при ядерной трансформации табака (<0.1 мг/г сырой биомассы), содержание этого белка, синтезированного в хлоропластах, достигало 3 мг/г, что составляло 24% от ОРБ. По результатам седиментационного анализа ~30% L1 находилось в составе VLP, не отличающихся по форме и размеру от нативного вириона (диаметр ~60 нм). Остальные наночастицы были меньше 55 нм и состояли из 12–24 пентамерных капсомеров L1, тогда как полный капсид образован 72 капсомерами, то есть 360 молекулами L1. Иммунизация мышей частично очищенными экстрактами листьев транспластомных растений с добавлением адъюванта Фрейнда или гидроксида алюминия индуцировала продукцию HPV-нейтрализующих антител в сыворотке крови мышей в титрах 1 : 400 и 1 : 100 соответственно. Эти титры сопоставимы с таковыми для VLP HPV, синтезированными в клетках насекомых (1 : 400) [108]. В другом исследовании трансформацию хлоропластов N. tabacum геном белка L1 HPV проводили в двух вариантах: нативном и оптимизированном по составу кодонов. В результате полученный белок L1 составлял 1.5% от массы ОРБ. Наряду с VLP из L1-белка регистрировали более легкие фракции наночастиц, а также отдельные пентамерные капсомеры [109]. В транспластомных растениях N. tabacum, синтезирующих мутантный вариант рекомбинантного L1 HPV, у которого два консервативных остатка Cys, образующих дисульфидные связи, были заменены на остатки Ser, почти весь белок L1 находился в составе капсомеров, также обладающих высокой иммуногенностью [110].

Белок Gag (Pr55^gag) ВИЧ-1 формирует VLP, обладающие высокой иммуногенностью, но при транзиентной и ядерной экспрессии синтезируется в очень малом количестве. Продукция Pr55^gag ВИЧ-1 резко повышалась при экспрессии в хлоропластах транспластомных растений и достигала 7–8% от ОРБ. При слиянии гена белка Gag с последовательностью, кодирующей N-концевой участок фотосинтетического белка RbcL, было достигнуто 25-кратное увеличение уровня Gag (до 338 мг/кг сырой биомассы) в транспластомных растениях N. tabacum. Также обнаружили, что накопление Gag падает в старых листьях табака, что может быть связано со сниженной интенсивностью транскрипции/трансляции в них и усилением протеолитической деградации белков. Электронная микроскопия подтвердила образование в хлоропластах VLP, не отличимых по форме и размеру от VLP ВИЧ-1, полученных в клетках насекомых [111]. В транспластомных растениях было синтезировано несколько экспериментальных VLP-вакцин: против DENV (из белков prM/E) [112]) и против трех серотипов вируса полиомиелита [113] в хлоропластах салата и против вируса некроза нервов рыб (NNV) в генетически модифицированных хлоропластах N. tabacum [114].

Совершенно иной подход к повышению уровня накопления VLP-вакцин в растениях предложен в ряде других работ. Он заключается в транзиентной или ядерной экспрессии вирусного гена, кодирующего VLP-образующий белок, слитый с транзитным сигнальным пептидом, направляющим синтезированный белок в хлоропласты. Низкая протеазная активность в хлоропластах позволяет значительно повысить выход вирусных белков и образованных ими VLP. Подробно этот подход рассмотрен в обзоре Т. Muthamilselvan и др. [115]. С использованием этого подхода в N. benthamiana и N. tabacum был синтезирован рекомбинантный белок L1 HPV-16, собирающийся в VLP и составляющий 11% от ОРБ [116]. В работе Т. Muthamilselvan с соавт. [117] получена ДНК-конструкция, кодирующая белок L1 HPV-16, слитый с 79-аминокислотной последовательностью белка хлоропластов RbcS, которая направляет белок в хлоропласты, а также с доменом SUMO. Одновременная транзиентная экспрессия этого рекомбинантного белка с направляемой в хлоропласты специфической протеазой bdSENP1, расщепляющей белок по сайту SUMO, позволила синтезировать в N. benthamiana L1 HPV-16 с выходом 6–8 мкг на 1 г сырой биомассы и получить соответствующие VLP, обладавшие высокой иммуногенностью в экспериментах на мышах [117]. Введение в рекомбинантный белок Gag ВИЧ-1 последовательности другого транзитного пептида, направляющего белок в хлоропласты, также приводило к увеличению продукции целевого белка в транзиентной системе экспрессии N. benthamiana [111]. Цирковирус свиней (porcine circovirus, PCV) вызывает серьезные заболевания свиней, с высоким уровнем летальности. При транзиентной экспрессии в N. benthamiana рекомбинантного белка капсида (rCap) PCV типа 2, слитого с транзитным пептидом, направляющим белок в хлоропласты, были получены VLP PCV2 в количестве 102 мг/кг сырой биомассы, вызывающие сильный иммунный ответ у морских свинок [118].

Наряду с VLP для разработчиков эффективных вакцин представляют значительный интерес и другие наночастицы, которые могут быть синтезированы и накоплены в растениях. Прежде всего, это белковые тельца – производные эндоплазматического ретикулума. Белковые тельца содержат мало воды, проявляют низкую протеазную активность, имеют высокую плотность седиментации и идеально подходят для длительного хранения и выделения больших количеств фармацевтических белков. Модифицированный N-концевой сигнальный пептид γ-зеина кукурузы, названный Zera, содержит 112 а. о.; он направляет слитый с ним белок в эндоплазматический ретикулум, где и образуются белковые тельца [119, 120]. Интересно, что сигнальный пептид Zera приводит к накоплению слитых с ним белков не только в клетках растений, но и в клетках насекомых и млекопитающих [120, 121]. При транзиентной экспрессии гена белка E7 HPV-16, слитого с последовательностью, кодирующей пептид Zera, в N. benthamiana формировались белковые тельца E7 в количестве 0.1–6.0 г/кг сырой биомассы. У мышей, иммунизированных этими белковыми тельцами, регистрировали сильный как B-, так и T-клеточный иммунный ответ, а также регрессию экспериментальных опухолей. Слитый с E7 Zera-пептид усиливал иммуногенность E7-белковых телец по типу молекулярного адъюванта [122]. Недавно получены белковые тельца из рекомбинантного белка Env ВИЧ-1, слитого с Zera-пептидом (gp140-Zera), которые у кроликов индуцировали сильный иммунный ответ [123].

Эластиноподобные сигнальные пептиды (ELP) [124, 125] и гидрофобины (HFB) [126] также относятся к перспективным молекулам для создания вакцин, основанных на формировании белковых телец. Как и Zera-пептид, они направляют слитый с ними рекомбинантный белок в эндоплазматический ретикулум с дальнейшим образованием белковых телец [127]. Использование этих пептидов для формирования белковых телец позволяет значительно повысить выход рекомбинантных белков. Так, экспрессия в листьях табака широко используемого в качестве репортера зеленого флуоресцентного белка (GFP), слитого с EPL, достигает 40% от ОРБ [128], а при слиянии с HFB – 51% [129].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, современная биотехнология открывает совершенно новые перспективы для создания безопасных и эффективных вакцин против широкого спектра возбудителей как вирусных, так и бактериальных инфекций. Кроме того, вакцины нового поколения эффективны при протозойных заболеваниях, в частности малярии, а также могут найти применение при неинфекционных патологиях, таких как болезнь Альцгеймера, аутоиммунные, системные и онкологические заболевания. VLP и другие биологические наночастицы, служащие основой этих новых вакцин, обеспечивают их высокую иммуногенность и презентацию иммунокомпетентным клеткам, а их биосинтез в клетках растений позволяет получать биобезопасные вакцинные продукты с относительно небольшими затратами и адекватными PTM, а также их биобезопасность и невысокую себестоимость.

Производство VLP и других наночастиц представляет особый интерес для разработки вакцин нового поколения, так как они презентируют иммунокомпетентным клеткам млекопитающих множество эпитопов белкового антигена, причем без предварительного их синтеза в клетках, как это необходимо в случае ДНК- и мРНК-вакцин. Сравнимые с вирионами размеры VLP – еще один фактор, повышающий эффективность презентации антигенов иммунной системе. Этот эффект усиливается тем, что антигенные детерминанты многократно повторены на поверхности VLP. Довольно простые безоболочечные VLP могут быть синтезированы в разных экспрессионных системах, включая прокариотические. Однако прокариоты не способны ко многим PTM, в том числе гликозилированию, что необходимо для высокой иммуногенности многих VLP вакцин. Для производства более сложных, eVLP-вакцин, используют эукариотические системы: дрожжевые, бакуловирусные, клетки насекомых и млекопитающих, – большинство из которых высокозатратны и трудно масштабируемы. Напротив, растения и культуры их клеток легко масштабируются и значительно дешевле. Кроме того, клетки растений способны к сложным PTM – одному из ключевых факторов высокой иммуногенности VLP. Синтез вакцин в растениях также исключает их контаминацию вирусами животных и человека.

Сейчас в свете необходимости создания вакцин нового поколения на основе наночастиц сформировалось три главных направления: вакцины, основанные (i) на VLP патогенных вирусов человека и животных, (ii) на химерных VLP вирусов растений и (iii) на химерных вирусах растений, содержащих генетический материал самого вируса. Несколько особняком стоит еще одно направление – (iv) получение белковых телец, содержащих вирусные белки с антигенными детерминантами соответствующего патогена. Первое, второе и четвертое направления безопасны для биосферы в целом, тогда как третье представляет определенную опасность для фитоценозов. Основное преимущество вакцин, основанных на VLP патогенных вирусов животных, состоит в том, что они презентируют иммунной системе все эпитопы антигена патогена, тогда как вакцины на основе химерных растительных вирусов и их VLP представляют только те эпитопы патогена, которые были слиты с белками, формирующими VLP. Кроме того, эти эпитопы, из-за особенностей конформации VLP-формирующих белков, могут оказаться недоступными для компетентных иммунных клеток. Но, с другой стороны, сами белки вирусов растений могут быть молекулярными адъювантами и усиливать иммуногенность вакцины.

Основной недостаток растительных экспрессионных систем – низкий выход продукта. Разработанные системы транзиентной экспрессии позволяют получать в короткие сроки большие количества VLP и других наночастиц, предназначенных для создания вакцин нового поколения. Конститутивная экспрессия VLP-вакцин в хлоропластах транспластомных растений или ядерная трансформация с направлением синтезированных в цитоплазме белков в хлоропласты с помощью слитых с ними транзитных пептидов позволяет также получать большие количества VLP-вакцин в течение длительного времени. Направление синтезированных белков, слитых с сигнальными пептидами Zera, ELP или HFB, в эндоплазматический ретикулум и далее в белковые тельца позволяет постоянно синтезировать VLP-вакцины в большом количестве, а высокая плотность белковых телец облегчает их выделение и очистку. Таким образом, растительные системы экспрессии обладают многими преимуществами по сравнению с другими и представляют значительный интерес для получения вакцин нового поколения.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования (грант № FWNR-2022-0022).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. С.М. Розов и Е.В. Дейнеко внесли равноценный вклад в написание обзора.

作者简介

S. Rozov

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Brunch, Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: rozov@bionet.nsc.ru
俄罗斯联邦, Novosibirsk, 630090

E. Deineko

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Brunch, Russian Academy of Sciences

Email: deineko@bionet.nsc.ru
俄罗斯联邦, Novosibirsk, 630090

参考

补充文件