“Биполярное” действие ингибитора васкулогенной мимикрии на экспрессию генов в клетках меланомы
- 作者: Tchurikov N.A.1, Vartanian A.A.2, Klushevskaya E.S.3, Alembekov I.R.3, Kretova A.N.3, Сhechetkin V.R.3, Kravatskaya G.I.3, Kosorukov V.S.2, Kravatsky Y.V.3
-
隶属关系:
- Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Science
- Department of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia
- Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
- 期: 卷 58, 编号 2 (2024)
- 页面: 295-304
- 栏目: МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
- URL: https://bakhtiniada.ru/0026-8984/article/view/265742
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026898424020116
- EDN: https://elibrary.ru/NIAKKQ
- ID: 265742
如何引用文章
全文:
详细
Multiple exogenous or endogenous factors alter gene expression patterns by different mechanisms that yet are poorly understood. We used RNA-Seq analysis in order to study changes in gene expression in melanoma cells capable to vasculogenic mimicry upon action of inhibitor of vasculogenic mimicry. Here, we describe that the drug induces a strong upregulation of 50 genes controlling cell cycle and microtubule cytoskeleton coupled with a strong downregulation of 50 genes controlling different cellular metabolic processes. We found that both groups of genes are simultaneously regulated by multiple sets of transcription factors. We conclude, that one way for coordinated regulation of big groups of genes is the regulation simultaneously by multiple transcription factors.
全文:
Сокращения: РНК-сек – глубокое секвенирование РНК; LCS1269 – ингибитор васкулогенной мимикрии; MM – эксперименты с клетками меланомы, растущими на Матригеле; MMI – эксперименты с клетками меланомы, растущими на Матригеле в присутствии ингибитора; ФТ – фактор транскрипции; FC – кратные изменения экспрессии (Fold Changes); GO.ID – идентификатор Онтологии Генов.
Механизмы регуляции экспрессии генов изучают не одно десятилетие, однако многое остается непонятным, особенно это относится к механизмам, которые обеспечивают координированную экспрессию генов. Предполагается, что совместная регуляция таких генов обусловлена тем, что они располагаются рядом, в одних и тех же хромосомных доменах [1, 2]. С другой стороны, обеспечить одновременный сайленсинг многих генов, расположенных в разных хромосомах, можно с помощью молекул микроРНК (miРНК) или малых интерферирующих РНК (siРНК) [3–5]. Наряду с кровеносными сосудами, выстланными эндотелием, в опухолях представлены и высокоструктурированные васкулярные каналы, образованные опухолевыми клетками. В данной работе мы попытались выяснить, экспрессия каких генов изменяется в клетках высокоагрессивной меланомы, которые теряют способность к васкулогенной мимикрии под воздействием ингибитора LCS1269 [6, 7], и как эти гены регулируются. Васкулогенная мимикрия – это способность некоторых опухолевых клеток формировать ложные сосуды, не содержащие эндотелиальных клеток. Посредством васкулогенной мимикрии в опухоли образуется сеть лакун, которые обеспечивают кровоснабжение опухолевых клеток и способствуют тем самым их выживанию [8].
Оказалось, что в присутствии ингибитора LCS1269 одновременно усиливается экспрессия 102 генов, тогда как 122 гена повергаются репрессии. При этом экспрессия 50 генов каждой группы резко изменяется. Проведен анализ этих групп генов в базах онтологии генов, а также данных об их регуляции разными факторами транскрипции (ФТ). Наши данные свидетельствуют о том, что под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии в клетках меланомы происходит активация ФТ и изменяется экспрессия определенных групп генов. При этом до 10 разных ФТ могут регулировать экспрессию конкретного гена, а изменения экспрессии происходят в течение короткого промежутка времени.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культивирование клеток меланомы. Клетки меланомы MelZ [6, 9] получены в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Клетки исходно растили на пластике в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США), 2 мM глутамина, 0.1% гентамицина, в CO2-инкубаторе (37 °C, влажность 95 и 5% CO2) до 70–75% слияния (10 млн клеток). Затем клетки переносили на чашки с Матригелем (“BD Bioscience”, США) в той же среде, содержащей ингибитор васкулогенной мимикрии в нетоксической концентрации (LCS1269, 10-6 M), в которой он не влияет на пролиферацию клеток, или без ингибитора. Цитотоксичность ингибитора изучали с помощью MMT-теста, как описано ранее [6]. Рост клеток продолжался в течение 20 ч, затем из них выделяли препараты тотальной РНК.
Эксперименты РНК-сек. Проводили по два независимых эксперимента – с клетками, растущими без ингибитора или с ингибитором. Препараты РНК получали после лизиса клеток с помощью реагента Trisol (“Invitrogen”, США). Качество препаратов контролировали с помощью биоанализатора Agilent. Библиотеки кДНК готовили с помощью наборов реактивов TruSeq Stranded RNA. Глубокое секвенирование двух биологических реплик проводили на приборе HiSeq1500 (“Illumina”, США). Экспрессию генов анализировали с помощью пакета Deseq2 R. Консистентность реплик оценивали с помощью пакета deep Tools [10]. Коэффициенты Пирсона и Спирмана для наборов данных MM (r = 0.99, ρ = 0.69) и MMI (r = 0.99, ρ = 0.67) свидетельствуют о высокой воспроизводимости независимо полученных данных. Результаты РНК-сек помещены в базы данных (номера доступа для MM – GSE221872; для MMI – GSE221873).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Большие группы генов резко изменили уровень экспрессии в клетках меланомы в ответ на добавление ингибитора
Оказалось, что инкубация клеток в течение 20 ч с ингибитором приводит к повышению экспрессии 102 и снижению экспрессии 122 генов (при log2FG > 1.5, т. е. более чем в 2.83 раза). На рис. 1 приведено по 50 генов каждой группы с максимально изменившейся активностью. Цветная шкала приведена в широком диапазоне log2FC – от +5.5 до –5.0. Ген TMPO-AS1, экспрессия которого максимально усилилась, кодирует длинную некодирующую РНК, он вовлечен в пролиферацию клеток опухолей разного типа и является онкогеном [11]. Экспрессия генов ACER2 и TCAF2 снизилась примерно в 32 раза (log2FC около 5). Ген TCAF2 вовлечен в позитивную регуляцию миграции клеток [12]. Эти данные позволяют предположить, что под действием ингибитора активируется пролиферация клеток и подавляется их миграция. Чтобы выяснить, в какие биологические процессы вовлечены гены, экспрессия которых изменилась, провели поиск в базах данных онтологии генов и выбрали по 50 генов с максимально изменившейся экспрессией.
Рис. 1. Тепловая карта изменений экспрессии генов в клетках меланомы под действием ингибитора васкулогенной мимикрии. Отобрано по 50 генов, экспрессия которых максимально изменилась (повысилась либо снизилась) под действием ингибитора. Приведена цветная шкала изменений экспрессии в log2FC. 50 генам, экспрессия которых усилилась, соответствует критерий logFC > 1.71 (т. е., их экспрессия повысилась более чем в 3.27 раза). 50 генам, экспрессия которых снизилась, соответствует критерий log2FC < 1.89 (т. е. экспрессия снизилась более чем в 3.7 раза).
Анализ генов с измененной экспрессией в базах данных онтологии генов
Биологические процессы, с которыми связаны гены меланомы, экспрессия которых изменилась в присутствии ингибитора LCS1269, мы анализировали с использованием ресурса Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost). В табл. 1 приведены результаты для 10 терминов онтологии генов, наиболее высоко ассоциированных с данными генами. Видно, что гены, экспрессия которых усилилась, ассоциированы с клеточным циклом и организацией цитоскелета. Гены KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13 вовлечены в связывание с микротрубочками, а гены KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5 – в деполимеризацию микротрубочек. Гены BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB контролируют клеточный цикл.
Таблица 1. Молекулярные функции и биологические процессы, в которые вовлечены 50 генов, значительно усиливших экспрессию под действием ингибитора*
GO.ID | Функция/Процесс | Padj | Ген |
Молекулярная функция | |||
GO:0008017 | Microtubule binding | 0.006829558415930034 | KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13 |
GO:0015631 | Tubulin binding | 0.04453959825226614 | KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13 |
Биологический процесс | |||
GO:0000278 | Mitotic cell cycle | 0.000002927752876054714 | BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB |
GO:1903047 | Mitotic cell cycle process | 0.00004046701434758872 | BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A |
GO:0022402 | Cell cycle process | 0.00018900471515918558 | BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, WDR76 |
GO:0044770 | Cell cycle phase transition | 0.00022746298342911283 | BUB1B, DLGAP5, CCNE2, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, WDR76 |
GO:0007049 | Cell cycle | 0.00035945882615939285 | BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB, WDR76, UHRF1 |
GO:0044772 | Mitotic cell cycle phase transition | 0.00045847139273843743 | BUB1B, DLGAP5, CCNE2, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A |
GO:0006270 | DNA replication initiation | 0.001981323810320336 | CCNE2, MCM10, TICRR, PRIM1 |
GO:0006260 | DNA replication | 0.0027829515300584542 | CCNE2, MCM10, TICRR, DTL, PRIM1, POLE2, FAM111B |
GO:1901987 | Regulation of cell cycle phase transition | 0.004055801393608912 | BUB1B, DLGAP5, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, CDC25A, WDR76 |
GO:0007019 | Microtubule depolymerization | 0.005597736302291347 | KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5 |
*Показаны только 10 процессов, максимально ассоциированных с 50 генами.
Представленные на рис. 1 гены, активность которых снизилась под действием ингибитора, связаны с положительной или отрицательной регуляцией ряда клеточных процессов (табл. 2). Приведенные в табл. 2 гены связаны с передачей клеточных сигналов медиаторами P53 (BBC3, EDA2R, SESN2, CDKN1A, ACER2), передачей сигналов о повреждениях ДНК (MRNIP, GADD45A, SESN2, CDKN1A, ACER2) и с клеточным ответом на стресс (MRNIP, PTGER4, EPHA2, BBC3, GADD45A, SESN1, VASN, EDA2R, SESN2, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2).
Таблица 2. Биологические процессы, в которые вовлечены 50 генов, экспрессия которых значительно снизилась под действием ингибитора*
GO.ID | Биологический процесс | Padj | Ген |
GO:0043549 | Regulation of kinase activity | 0.0009631712673035452 | MRNIP, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A |
GO:0048523 | Negative regulation of cellular process | 0.001747679364398328 | MRNIP, PTGER4, TRIM22, RGS2, SOCS1, ENC1, CAMSAP3, KANK3, EPHA2, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, VASN, ARC, PRDM1, SESN2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2, TCAF2 |
GO:0065009 | Regulation of molecular function | 0.001885574647728961 | MRNIP, TRIM22, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, BBC3, XIRP1, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, EDA2R, ARC, SESN2, CDKN1A, ACER2, TCAF2 |
GO:0051338 | Regulation of transferase activity | 0.004627641665897807 | MRNIP, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A |
GO:0048518 | Positive regulation of biological process | 0.02112371270600905 | KDM3A, MRNIP, PTGER4, TRIM22, EPHB3, RGS2, SOCS1, ENC1, EPHA2, TNFSF9, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, EDA2R, ARC, PRDM1, SESN2, ACTA2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2, TCAF2 |
GO:0009893 | Positive regulation of metabolic process | 0.024747078153625094 | KDM3A, MRNIP, PTGER4, TRIM22, EPHB3, SOCS1, EPHA2, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, PRDM1, SESN2, ACTA2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2 |
GO:0045859 | Regulation of protein kinase activity | 0.02510375699053 | MRNIP, RGS2, SOCS1, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A |
GO:0072331 | Signal transduction by p53 class mediator | 0.03283706367174577 | BBC3, EDA2R, SESN2, CDKN1A, ACER2 |
GO:0042770 | Signal transduction in response to DNA damage | 0.04725086282309963 | MRNIP, GADD45A, SESN2, CDKN1A, ACER2 |
GO:0033554 | Cellular response to stress | 0.04960437746562762 | MRNIP, PTGER4, EPHA2, BBC3, GADD45A, SESN1, VASN, EDA2R, SESN2, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2 |
*Приведены только 10 процессов, максимально ассоциированных с 50 генами.
В результате аналогичного анализа всех генов, экспрессия которых усилилась (102 гена) или снизилась (122 гена), сделан вывод, что под действием ингибитора усиливается моторная активность микротрубочек и миграция клеток меланомы. В то же время в этих клетках подавляется активность генов, которые регулируют пролиферацию и передают сигналы о клеточных стрессах.
Мы предположили, что одновременная активация или репрессия этих двух групп генов может быть связана с их корегуляцией, т. е. одна группа ФТ может одновременно усиливать экспрессию больших групп генов. Аналогично другая группа ФТ может одновременно ослаблять экспрессию больших групп генов.
Совместная регуляция генов многочисленными факторами транскрипции
Регулируются ли гены, активность которых резко изменилась в присутствии ингибитора, одновременно разными ФТ? Чтобы проверить такую возможность, мы провели поиск 50 генов, транскрипция которых усилилась, в базе данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих эти гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence). На рис. 2а приведены результаты этого поиска. Оказалось, что действительно многие гены, транскрипция которых значительно усилилась в ответ на добавление ингибитора, регулируются одновременно 10 и более ФТ. В табл. 3 приведены только 10 ФТ и регулируемые ими гены. Видно, что в базе данных представлены всего 299 генов, которые регулируются таким образом. Среди рассмотренных 50 генов около 40 регулируются одновременно каждым из этих 10 ФТ.
Рис. 2. Гены, экспрессия которых изменилась под воздействием ингибитора (Input Genes), регулируются одновременно многими ФТ (Enriched Terms). а – Гены, экспрессия которых усилилась. б – Гены, экспрессия которых снизилась. Результаты получены с помощью базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).
Таблица 3. Факторы транскрипции (ФТ), одновременно регулирующие группы генов, активируемых после добавления ингибитора
Фактор транскрипции | Доля | Padj | Ген |
DEPDC1B | 42/299 | 3.580485614936991E-47 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;ARHGEF39;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
E2F7 | 41/299 | 3.821023448908531E-46 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
E2F8 | 41/299 | 3.821023448908531E-46 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
MYBL2 | 41/299 | 3.821023448908531E-46 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
RAD51 | 41/299 | 3.821023448908531E-46 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
DEPDC1 | 40/299 | 9.750383314399901E-45 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;ARHGEF39;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;KIF20A;MCM6;DTL |
E2F1 | 40/299 | 9.750383314399901E-45 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
WDHD1 | 40/299 | 9.750383314399901E-45 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
ZNF367 | 40/299 | 9.750383314399901E-45 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
ZNF519 | 40/299 | 9.750383314399901E-45 | UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL |
Примечание. Представлены 10 ФТ. Доля – число генов, ассоциированных с данным ФТ, в выборке из 299 генов. Результаты анализа базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).
Ангиогенезу в меланомах способствует экспрессия гена DEPDC1B, кодирующего ФТ (табл. 3), нокдаун этого гена подавляет пролиферацию клеток меланомы и вызывает их апоптоз [13, 14], а также ФТ MYBL2 – важный регулятор пролиферации клеток [15]. Кроме того, в табл. 3 указаны гены ФТ E2F7 и E2F8, которые действуют синергично и важны для супрессии рака кожи [16]. Интересно, что экспрессия генов некоторых ФТ (ZNF367, E2F1 и DEPDC1) возрастает под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии. Эти гены приведены не только в колонке ФТ, но и среди групп генов, активируемых под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии.
Анализ регуляции 50 генов со сниженной экспрессией показал, что примерно 20–30 из них в разных комбинациях регулируются 10 другими ФТ (табл. 4). Таким образом, ингибитор, подавляя образование ложных сосудов клетками меланомы, существенно изменяет характер экспрессии этих 50 генов с помощью множества ФТ.
Таблица 4. Факторы транскрипции (ФТ), одновременно регулирующие группы генов, экспрессия которых снизилась после добавления ингибитора
Фактор транскрипции | Доля | Padj | Ген |
ZNF79 | 31/299 | 2.3420335820357761E-26 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;PRDM1;PPM1D;BBC3;RGS2;SERTAD1;SESN1;SESN2;ENC1;TP53INP1;FDXR;IER5;TRIM22;POLH;GADD45A;GDF15;SLC30A1;KLF4;PGF;PNRC1;ACER2;ACTA2;MDM2;PLXNB2;TNFSF9;EPHA2;HBEGF |
ZNF821 | 26/299 | 6.532976510709839E-20 | CSRNP1;BTG2;CDKN1A;SLC2A3;PRDM1;IFIT2;BBC3;FAM117A;RGS2;SESN1;SESN2;ENC1;TP53INP1;BMF;GADD45A;SMOX;GDF15;ARRDC3;KLF4;PGF;SBK1;BCL6;CCNG2;FSCN1;PLXNB2;HBEGF |
ZNF425 | 24/299 | 1.5281770047316118E-17 | BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PGF;PNRC1;IFIT2;RND1;BBC3;IQCN;RGS2;BCL6;SERTAD1;SESN1;CCNG2;SESN2;ENC1;TP53INP1;BMF;HBEGF |
NR4A3 | 23/299 | 1.9800969612121248E-16 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;SOCS1;BCL6;CRISPLD2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF |
MAFF | 22/299 | 2.156404175382678E-15 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;PGF;PNRC1;IFIT2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;ENC1;IER5;EPHA2;HBEGF |
SNAI1 | 22/299 | 2.156404175382678E-15 | CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;GADD45A;GDF15;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PGF;RND1;ACTA2;RGS2;SOCS1;BCL6;SERTAD1;CRISPLD2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF |
ATF3 | 21/299 | 1.4250083219969755E-14 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;SESN2;IER5;EPHA2;HBEGF |
FOSB | 21/299 | 1.4250083219969755E-14 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;CRISPLD2;ENC1;IER5;EPHA2;HBEGF |
JDP2 | 21/299 | 1.4250083219969755E-14 | PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;GADD45A;GDF15;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;RGS2;BCL6;CRISPLD2;SESN2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF |
MXD1 | 21/299 | 1.4250083219969755E-14 | CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;SMOX;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PNRC1;IFIT2;HELZ2;RGS2;SOCS1;BCL6;SERTAD1;CCNG2;SESN2;IER5;HBEGF |
Примечание. Представлены 10 ФТ. Указано число генов, ассоциированных с данным ФТ, в выборке из 299 генов, депонированных в базе данных (Доля). Результаты получены с помощью базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что ингибитор васкулогенной мимикрии вызывает изменения в экспрессии более чем 200 генов в клетках меланомы. Экспрессия 100 из них довольно значительно усиливается или снижается (рис. 1). Предполагалось, что ингибитор LCS1269 вызывает повреждения ДНК и арест G2/M перехода клеточного цикла, тем самым восстанавливая чувствительность клеток меланомы к ДНК-повреждающим агентам [6, 7, 9].
В настоящее время мы не можем выявить ключевые гены, ответственные за эффект ингибитора, однако нами идентифицированы 100 генов, экспрессия которых резко изменяется под действием ингибитора. Эти гены играют важную роль в клеточном цикле, пролиферации клеток, формировании цитоскелета, миграции клеток, а также выполняют другие функции в клетках. Обнаружено, что кодируемый геном DEPDC1B ФТ, вовлеченный в миграцию клеток и запуск Wnt-сигнального пути, регулирует 42 гена, значительно усиливших экспрессию под действием ингибитора (табл. 3).
Как показано ранее, васкулогенная мимикрия связана с ремоделированием цитоскелета и требует целостности сети микротрубочек [17]. Значительное усиление активности генов KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5 (табл. 1), которые вовлечены в деполимеризацию микротрубочек, свидетельствует о нарушениях цитоскелета, вызываемых ингибитором. Кроме того, ингибитор вызывает резкое подавление экспрессии генов TCAF2 и ACER2, связанных с позитивной регуляцией миграции клеток и пролиферации (рис. 1). Известно, что миграция клеток связана с малигнизацией и метастазированием [18]. Следовательно, активация генов KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5, нарушающих целостность цитоскелета, и одновременная репрессия генов TCAF2 и ACER2, которые теперь не могут усиливать миграцию и пролиферацию, способны потенцировать эффект подавления васкулогенной мимикрии ингибитором (рис. 3). В настоящее время мы планируем использовать искусственное выключение активности генов TCAF2 и ACER2, чтобы ослабить малигнизацию клеток меланомы за счет подавления миграции и метастазирования. Указанные гены могут быть мишенями для онкотерапии.
Рис. 3. Схема, показывающая, как добавление ингибитора нарушает баланс генной экспрессии и как это сказывается на фенотипе клеток меланомы. а – Баланс экспрессии генов до добавления ингибитора. Клетки веретеновидной формы на Матригеле формируют сосудоподобные структуры. б – Нарушение баланса экспрессии генов вызывает изменение поведения клеток (нарушается образование сосудоподобных структур) и их формы (клетки более округлые).
Ранее обнаружили, что ингибитор LCS1269 повреждает ДНК [6, 7, 9]. Нами показано, что ингибитор подавляет активность генов, которые связаны с передачей сигналов медиаторами P53 и сигналов о повреждениях ДНК (табл. 2), делая клетки меланомы более чувствительными к ДНК-повреждающим агентам. Таким образом, наши данные согласуются с ранее определенными свойствами ингибитора.
Другой важный аспект данной работы состоит в обнаружении механизма координированной экспрессии генов с помощью одновременной регуляции десятков генов наборами из десятков ФТ. Интересно, что при этом одни наборы ФТ вызывают активацию одних групп генов, тогда как другие в это же время вызывают репрессию других групп генов (табл. 3, табл. 4, рис. 3). Такая биполярная регуляция способна вызывать резкие изменения в экспрессии генов. Недавно мы обнаружили, что наборы таких генов-мишеней ФТ далеко не случайно перекрываются с генами, которые образуют контакты с ядрышками (данные будут опубликованы отдельно).
Одновременная экспрессия больших перекрывающихся наборов генов (коэкспрессия) – это недавно обнаруженный механизм регуляции генной активности. Во всех изученных клетках человека (ткани или культуры клеток) найдены гены, которые коэкспрессируются в разных комбинациях [19]. В клетках линии K562, например, в разных комбинациях коэкспрессируются 177 наборов генов [20]. Удобной клеточной моделью для анализа механизмов регуляции экспрессии генов, включая роль трехмерных структур хромосом в изменениях экспрессии генов, является также меланома.
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-14-00035) и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант № 075-15-2021-1060).
В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
作者简介
N. Tchurikov
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Science
编辑信件的主要联系方式.
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
A. Vartanian
Department of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 115478
E. Klushevskaya
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
I. Alembekov
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
A. Kretova
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
V. Сhechetkin
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
G. Kravatskaya
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
V. Kosorukov
Department of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 115478
Yu. Kravatsky
Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences
Email: tchurikov@eimb.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991
参考
- Kosak S.T., Scalzo D., Alworth S.V., Li F., Palmer S., Enver T., Lee J.S., Groudine M. (2007) Coordinate gene regulation during hematopoiesis is related to genomic organization. PLoS Biol. 5(11), e309. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050309
- Tchurikov N.A., Fedoseeva D.M., Sosin D.V., Snezhkina A.V., Melnikova N.V., Kudryavtseva A.V., Kravatsky Y.V., Kretova O.V. (2015) Hot spots of DNA double-strand breaks and genomic contacts of human rDNA units are involved in epigenetic regulation. J. Mol. Cell. Biol. 7, 366‒382. doi: 10.1093/jmcb/mju038
- Xu P., Wu Q., Yu J., Rao Y., Kou Z., Fang G., Shi X., Liu W., Han H. (2020) A systematic way to infer the regulation relations of miRNAs on target genes and critical miRNAs in cancers. Front. Genet. 11, 278. doi: 10.3389/fgene.2020.00278
- Tchurikov N.A., Kretova O.V. (2007) Suffix-specific RNAi leads to silencing of F element in Drosophila melanogaster. PLoS One. 2(5), e476. doi: 10.1371/journal.pone.0000476
- Bartel D.P. (2018) Metazoan microRNAs. Cell. 173, 20–51. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.006
- Vartanian A., Baryshnikova M., Burova O., Afanasyeva D., Misyurin V., Belyаvsky A., Shprakh Z. (2017) Inhibitor of vasculogenic mimicry restores sensitivity of resistant melanoma cells to DNA-damaging agents. Melanoma Res. 27, 8‒16. doi: 10.1097/CMR.0000000000000308
- Kalitin N.N., Ektova L.V., Kostritsa N.S., Sivirinova A.S., Kostarev A.V., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Golubeva I.S., Ermolaeva E.V., Vergun M.A., Babaeva M.A., Lushnikova A.A., Karamysheva A.F. (2022) A novel glycosylated indolocarbazole derivative LCS1269 effectively inhibits growth of human cancer cells in vitro and in vivo through driving of both apoptosis and senescence by inducing of DNA damage and modulating of AKT/mTOR/S6K and ERK pathways. Chem. Biol. Interact. 364, 10056. doi: 10.1016/j.cbi.2022.110056
- Maniotis A.J., Folberg R., Hess A., Seftor E.A., Gardner L.M., Pe’er J., Trent J.M., Meltzer P.S., Hendrix M.J. (1999) Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. Am. J. Pathol. 155(3), 739–752. doi: 10.1016/S0002-9440(10)65173-5
- Вартанян А., Хоченкова Ю., Кособокова Е., Барышникова М., Косоруков В. (2021) СД437 снижает метастатический потенциал клеток меланомы. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 62(4), 333–340.
- Ramirez F., Ryan D.P., Gruning B., Bhardwaj V., Kilpert F., Richter A.S., Heyne S., Dundar F., Manke T. (2016) deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucl. Acids Res. 44, W160–165.
- Cui H., Zhao J. (2020) LncRNA TMPO-AS1 serves as a ceRNA to promote osteosarcoma tumorigenesis by regulating miR-199a-5p/WNT7B axis. J. Cell Biochem. 121, 2284–2293. doi: 10.1002/jcb.2945110
- Gkika D., Lemonnier L., Shapovalov G., Gordienko D., Poux C., Bernardini M., Bokhobza A., Bidaux G., Degerny C., Verreman K., Guarmit B., Benahmed M., de Launoit Y., Bindels R.J., Fiorio Pla A., Prevarskaya N. (2015) TRP channel-associated factors are a novel protein family that regulates TRPM8 trafficking and activity. J. Cell Biol. 208, 89–107. 10.1083/jcb.201402076' target='_blank'>https://doi: 10.1083/jcb.201402076
- Hu F., Fong K.O., Cheung M.P.L., Liu J.A., Liang R., Li T.W., Sharma R., Ip P.P., Yang X., Cheung M. (2022) DEPDC1B promotes melanoma angiogenesis and metastasis through sequestration of ubiquitin ligase CDC16 to stabilize secreted SCUBE3. Adv. Sci. 9, 2105226. https://doi.org/10.1002/advs.202105226
- Xu Y., Sun W., Zheng B., Liu X., Luo Z., Kong Y., Xu M., Chen Y. (2019) DEPDC1B knockdown inhibits the development of malignant melanoma through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis. Exp. Cell. Res. 379(1), 48–54. doi: 10.1016/j.yexcr.2019.03.021
- Musa J., Aynaud M.M., Mirabeau O., Delattre O., Grünewald T.G. (2017) MYBL2 (B-Myb): a central regulator of cell proliferation, cell survival and differentiation involved in tumorigenesis. Cell Death Dis. 8, e2895 (2017). https://doi.org/10.1038/cddis.2017.244
- Thurlings I., Martínez-López L., Westendorp B., Hien B.T., Martínez-López L.M., Zijp M., Thurlings I., Thomas R.E., Schulte-Merker S., Bakker W.J., de Bruin A. (2017) Synergistic functions of E2F7 and E2F8 are critical to suppress stress-induced skin cancer. Oncogene. 36, 829–839. https://doi.org/10.1038/onc.2016.251
- Vartanian A., Stepanova E., Grigorieva I., Solomko E., Belkin V., Baryshnikov A., Lichinitser M. (2011) Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling. Microcirculation. 18, 390–399. doi: 10.1111/j.1549-8719.2011.00102.x
- Bera K., Kiepas A., Godet I., Li Y., Mehta P., Ifemembi B., Paul C.D., Sen A., Serra S.A., Stoletov K., Tao J., Shatkin G., Lee S.J., Zhang Y., Boen A., Mistriotis P., Gilkes D.M., Lewis J.D., Fan C.M., Feinberg A.P., Valverde M.A., Sun S.X., Konstantopoulos K. (2022) Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611, 365–373. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05394-6
- Lachmann A., Torre D., Keenan A.B., Jagodnik K.M., Lee H.J., Wang L., Silverstein M.C., Ma’ayan A. (2018) Massive mining of publicly available RNA-seq data from human and mouse. Nat. Commun. 9, 1366.
- Tchurikov N.A., Klushevskaya E.S., Alembekov I.R., Kretova A.N., Chechetkin V.R., Kravatskaya G.I., Kravatsky Y.V. (2023) Induction of the erythroid differentiation of K562 Cells is coupled with changes in the inter-chromosomal contacts of rDNA clusters. Int. J. Mol. Sci. 24(12), 9842. https://doi.org/10.3390/ijms24129842
补充文件
