“Биполярное” действие ингибитора васкулогенной мимикрии на экспрессию генов в клетках меланомы

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Multiple exogenous or endogenous factors alter gene expression patterns by different mechanisms that yet are poorly understood. We used RNA-Seq analysis in order to study changes in gene expression in melanoma cells capable to vasculogenic mimicry upon action of inhibitor of vasculogenic mimicry. Here, we describe that the drug induces a strong upregulation of 50 genes controlling cell cycle and microtubule cytoskeleton coupled with a strong downregulation of 50 genes controlling different cellular metabolic processes. We found that both groups of genes are simultaneously regulated by multiple sets of transcription factors. We conclude, that one way for coordinated regulation of big groups of genes is the regulation simultaneously by multiple transcription factors.

Full Text

Сокращения: РНК-сек – глубокое секвенирование РНК; LCS1269 – ингибитор васкулогенной мимикрии; MM – эксперименты с клетками меланомы, растущими на Матригеле; MMI – эксперименты с клетками меланомы, растущими на Матригеле в присутствии ингибитора; ФТ – фактор транскрипции; FC – кратные изменения экспрессии (Fold Changes); GO.ID – идентификатор Онтологии Генов.

Механизмы регуляции экспрессии генов изучают не одно десятилетие, однако многое остается непонятным, особенно это относится к механизмам, которые обеспечивают координированную экспрессию генов. Предполагается, что совместная регуляция таких генов обусловлена тем, что они располагаются рядом, в одних и тех же хромосомных доменах [1, 2]. С другой стороны, обеспечить одновременный сайленсинг многих генов, расположенных в разных хромосомах, можно с помощью молекул микроРНК (miРНК) или малых интерферирующих РНК (siРНК) [3–5]. Наряду с кровеносными сосудами, выстланными эндотелием, в опухолях представлены и высокоструктурированные васкулярные каналы, образованные опухолевыми клетками. В данной работе мы попытались выяснить, экспрессия каких генов изменяется в клетках высокоагрессивной меланомы, которые теряют способность к васкулогенной мимикрии под воздействием ингибитора LCS1269 [6, 7], и как эти гены регулируются. Васкулогенная мимикрия – это способность некоторых опухолевых клеток формировать ложные сосуды, не содержащие эндотелиальных клеток. Посредством васкулогенной мимикрии в опухоли образуется сеть лакун, которые обеспечивают кровоснабжение опухолевых клеток и способствуют тем самым их выживанию [8].

Оказалось, что в присутствии ингибитора LCS1269 одновременно усиливается экспрессия 102 генов, тогда как 122 гена повергаются репрессии. При этом экспрессия 50 генов каждой группы резко изменяется. Проведен анализ этих групп генов в базах онтологии генов, а также данных об их регуляции разными факторами транскрипции (ФТ). Наши данные свидетельствуют о том, что под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии в клетках меланомы происходит активация ФТ и изменяется экспрессия определенных групп генов. При этом до 10 разных ФТ могут регулировать экспрессию конкретного гена, а изменения экспрессии происходят в течение короткого промежутка времени.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток меланомы. Клетки меланомы MelZ [6, 9] получены в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Клетки исходно растили на пластике в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США), 2 мM глутамина, 0.1% гентамицина, в CO2-инкубаторе (37 °C, влажность 95 и 5% CO2) до 70–75% слияния (10 млн клеток). Затем клетки переносили на чашки с Матригелем (“BD Bioscience”, США) в той же среде, содержащей ингибитор васкулогенной мимикрии в нетоксической концентрации (LCS1269, 10-6 M), в которой он не влияет на пролиферацию клеток, или без ингибитора. Цитотоксичность ингибитора изучали с помощью MMT-теста, как описано ранее [6]. Рост клеток продолжался в течение 20 ч, затем из них выделяли препараты тотальной РНК.

Эксперименты РНК-сек. Проводили по два независимых эксперимента – с клетками, растущими без ингибитора или с ингибитором. Препараты РНК получали после лизиса клеток с помощью реагента Trisol (“Invitrogen”, США). Качество препаратов контролировали с помощью биоанализатора Agilent. Библиотеки кДНК готовили с помощью наборов реактивов TruSeq Stranded RNA. Глубокое секвенирование двух биологических реплик проводили на приборе HiSeq1500 (“Illumina”, США). Экспрессию генов анализировали с помощью пакета Deseq2 R. Консистентность реплик оценивали с помощью пакета deep Tools [10]. Коэффициенты Пирсона и Спирмана для наборов данных MM (r = 0.99, ρ = 0.69) и MMI (r = 0.99, ρ = 0.67) свидетельствуют о высокой воспроизводимости независимо полученных данных. Результаты РНК-сек помещены в базы данных (номера доступа для MM – GSE221872; для MMI – GSE221873).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Большие группы генов резко изменили уровень экспрессии в клетках меланомы в ответ на добавление ингибитора

Оказалось, что инкубация клеток в течение 20 ч с ингибитором приводит к повышению экспрессии 102 и снижению экспрессии 122 генов (при log2FG > 1.5, т. е. более чем в 2.83 раза). На рис. 1 приведено по 50 генов каждой группы с максимально изменившейся активностью. Цветная шкала приведена в широком диапазоне log2FC – от +5.5 до –5.0. Ген TMPO-AS1, экспрессия которого максимально усилилась, кодирует длинную некодирующую РНК, он вовлечен в пролиферацию клеток опухолей разного типа и является онкогеном [11]. Экспрессия генов ACER2 и TCAF2 снизилась примерно в 32 раза (log2FC около 5). Ген TCAF2 вовлечен в позитивную регуляцию миграции клеток [12]. Эти данные позволяют предположить, что под действием ингибитора активируется пролиферация клеток и подавляется их миграция. Чтобы выяснить, в какие биологические процессы вовлечены гены, экспрессия которых изменилась, провели поиск в базах данных онтологии генов и выбрали по 50 генов с максимально изменившейся экспрессией.

 

Рис. 1. Тепловая карта изменений экспрессии генов в клетках меланомы под действием ингибитора васкулогенной мимикрии. Отобрано по 50 генов, экспрессия которых максимально изменилась (повысилась либо снизилась) под действием ингибитора. Приведена цветная шкала изменений экспрессии в log2FC. 50 генам, экспрессия которых усилилась, соответствует критерий logFC > 1.71 (т. е., их экспрессия повысилась более чем в 3.27 раза). 50 генам, экспрессия которых снизилась, соответствует критерий log2FC < 1.89 (т. е. экспрессия снизилась более чем в 3.7 раза).

 

Анализ генов с измененной экспрессией в базах данных онтологии генов

Биологические процессы, с которыми связаны гены меланомы, экспрессия которых изменилась в присутствии ингибитора LCS1269, мы анализировали с использованием ресурса Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost). В табл. 1 приведены результаты для 10 терминов онтологии генов, наиболее высоко ассоциированных с данными генами. Видно, что гены, экспрессия которых усилилась, ассоциированы с клеточным циклом и организацией цитоскелета. Гены KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13 вовлечены в связывание с микротрубочками, а гены KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5 – в деполимеризацию микротрубочек. Гены BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB контролируют клеточный цикл.

 

Таблица 1. Молекулярные функции и биологические процессы, в которые вовлечены 50 генов, значительно усиливших экспрессию под действием ингибитора*

GO.ID

Функция/Процесс

Padj

Ген

Молекулярная функция

GO:0008017

Microtubule binding

0.006829558415930034

KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13

GO:0015631

Tubulin binding

0.04453959825226614

KIF18A, DLGAP5, KIF20A, PLK1, NAV3, FGF13

Биологический процесс

GO:0000278

Mitotic cell cycle

0.000002927752876054714

BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB

GO:1903047

Mitotic cell cycle process

0.00004046701434758872

BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A

GO:0022402

Cell cycle process

0.00018900471515918558

BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, WDR76

GO:0044770

Cell cycle phase transition

0.00022746298342911283

BUB1B, DLGAP5, CCNE2, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, WDR76

GO:0007049

Cell cycle

0.00035945882615939285

BUB1B, KIF18A, DLGAP5, STAG1, CCNE2, KIF20A, RBL1, XRCC2, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A, MYB, WDR76, UHRF1

GO:0044772

Mitotic cell cycle phase transition

0.00045847139273843743

BUB1B, DLGAP5, CCNE2, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, E2F2, CDC25A

GO:0006270

DNA replication initiation

0.001981323810320336

CCNE2, MCM10, TICRR, PRIM1

GO:0006260

DNA replication

0.0027829515300584542

CCNE2, MCM10, TICRR, DTL, PRIM1, POLE2, FAM111B

GO:1901987

Regulation of cell cycle phase transition

0.004055801393608912

BUB1B, DLGAP5, RBL1, TICRR, PLK1, DTL, CDC25A, WDR76

GO:0007019

Microtubule depolymerization

0.005597736302291347

KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5

*Показаны только 10 процессов, максимально ассоциированных с 50 генами.

 

Представленные на рис. 1 гены, активность которых снизилась под действием ингибитора, связаны с положительной или отрицательной регуляцией ряда клеточных процессов (табл. 2). Приведенные в табл. 2 гены связаны с передачей клеточных сигналов медиаторами P53 (BBC3, EDA2R, SESN2, CDKN1A, ACER2), передачей сигналов о повреждениях ДНК (MRNIP, GADD45A, SESN2, CDKN1A, ACER2) и с клеточным ответом на стресс (MRNIP, PTGER4, EPHA2, BBC3, GADD45A, SESN1, VASN, EDA2R, SESN2, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2).

 

Таблица 2. Биологические процессы, в которые вовлечены 50 генов, экспрессия которых значительно снизилась под действием ингибитора*

GO.ID

Биологический процесс

Padj

Ген

GO:0043549

Regulation of kinase activity

0.0009631712673035452

MRNIP, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A

GO:0048523

Negative regulation of cellular process

0.001747679364398328

MRNIP, PTGER4, TRIM22, RGS2, SOCS1, ENC1, CAMSAP3, KANK3, EPHA2, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, VASN, ARC, PRDM1, SESN2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2, TCAF2

GO:0065009

Regulation of molecular function

0.001885574647728961

MRNIP, TRIM22, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, BBC3, XIRP1, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, EDA2R, ARC, SESN2, CDKN1A, ACER2, TCAF2

GO:0051338

Regulation of transferase activity

0.004627641665897807

MRNIP, EPHB3, RGS2, SOCS1, EPHA2, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A

GO:0048518

Positive regulation of biological process

0.02112371270600905

KDM3A, MRNIP, PTGER4, TRIM22, EPHB3, RGS2, SOCS1, ENC1, EPHA2, TNFSF9, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, EDA2R, ARC, PRDM1, SESN2, ACTA2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2, TCAF2

GO:0009893

Positive regulation of metabolic process

0.024747078153625094

KDM3A, MRNIP, PTGER4, TRIM22, EPHB3, SOCS1, EPHA2, BBC3, SERTAD1, GADD45A, SESN1, PRDM1, SESN2, ACTA2, TENT5C, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2

GO:0045859

Regulation of protein kinase activity

0.02510375699053

MRNIP, RGS2, SOCS1, SERTAD1, GADD45A, CCNG2, SESN2, CDKN1A

GO:0072331

Signal transduction by p53 class mediator

0.03283706367174577

BBC3, EDA2R, SESN2, CDKN1A, ACER2

GO:0042770

Signal transduction in response to DNA damage

0.04725086282309963

MRNIP, GADD45A, SESN2, CDKN1A, ACER2

GO:0033554

Cellular response to stress

0.04960437746562762

MRNIP, PTGER4, EPHA2, BBC3, GADD45A, SESN1, VASN, EDA2R, SESN2, TP53INP1, BTG2, CDKN1A, ACER2

*Приведены только 10 процессов, максимально ассоциированных с 50 генами.

 

В результате аналогичного анализа всех генов, экспрессия которых усилилась (102 гена) или снизилась (122 гена), сделан вывод, что под действием ингибитора усиливается моторная активность микротрубочек и миграция клеток меланомы. В то же время в этих клетках подавляется активность генов, которые регулируют пролиферацию и передают сигналы о клеточных стрессах.

Мы предположили, что одновременная активация или репрессия этих двух групп генов может быть связана с их корегуляцией, т. е. одна группа ФТ может одновременно усиливать экспрессию больших групп генов. Аналогично другая группа ФТ может одновременно ослаблять экспрессию больших групп генов.

Совместная регуляция генов многочисленными факторами транскрипции

Регулируются ли гены, активность которых резко изменилась в присутствии ингибитора, одновременно разными ФТ? Чтобы проверить такую возможность, мы провели поиск 50 генов, транскрипция которых усилилась, в базе данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих эти гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence). На рис. 2а приведены результаты этого поиска. Оказалось, что действительно многие гены, транскрипция которых значительно усилилась в ответ на добавление ингибитора, регулируются одновременно 10 и более ФТ. В табл. 3 приведены только 10 ФТ и регулируемые ими гены. Видно, что в базе данных представлены всего 299 генов, которые регулируются таким образом. Среди рассмотренных 50 генов около 40 регулируются одновременно каждым из этих 10 ФТ.

 

Рис. 2. Гены, экспрессия которых изменилась под воздействием ингибитора (Input Genes), регулируются одновременно многими ФТ (Enriched Terms). а – Гены, экспрессия которых усилилась. б – Гены, экспрессия которых снизилась. Результаты получены с помощью базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).

 

Таблица 3. Факторы транскрипции (ФТ), одновременно регулирующие группы генов, активируемых после добавления ингибитора

Фактор транскрипции

Доля

Padj

Ген

DEPDC1B

42/299

3.580485614936991E-47

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;ARHGEF39;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

E2F7

41/299

3.821023448908531E-46

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

E2F8

41/299

3.821023448908531E-46

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

MYBL2

41/299

3.821023448908531E-46

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

RAD51

41/299

3.821023448908531E-46

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

DEPDC1

40/299

9.750383314399901E-45

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;ARHGEF39;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;KIF20A;MCM6;DTL

E2F1

40/299

9.750383314399901E-45

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

WDHD1

40/299

9.750383314399901E-45

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

ZNF367

40/299

9.750383314399901E-45

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;RBL1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

ZNF519

40/299

9.750383314399901E-45

UHRF1;PRIM1;CDCA7;KIF14;BUB1B;MCM10;LMNB1;AURKA;CDC20;MYB;PCLAF;E2F1;E2F2;CLSPN;ZNF367;DLGAP5;PLK4;GINS1;GINS2;ATAD5;XRCC2;PLK1;KIF23;CDC6;WDR76;CDC25A;TICRR;FAM111B;CCNA2;MMS22L;ASPM;NEIL3;KIF18A;WEE1;CCNE2;POLE2;DEPDC1;KIF20A;MCM6;DTL

Примечание. Представлены 10 ФТ. Доля – число генов, ассоциированных с данным ФТ, в выборке из 299 генов. Результаты анализа базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).

 

Ангиогенезу в меланомах способствует экспрессия гена DEPDC1B, кодирующего ФТ (табл. 3), нокдаун этого гена подавляет пролиферацию клеток меланомы и вызывает их апоптоз [13, 14], а также ФТ MYBL2 – важный регулятор пролиферации клеток [15]. Кроме того, в табл. 3 указаны гены ФТ E2F7 и E2F8, которые действуют синергично и важны для супрессии рака кожи [16]. Интересно, что экспрессия генов некоторых ФТ (ZNF367, E2F1 и DEPDC1) возрастает под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии. Эти гены приведены не только в колонке ФТ, но и среди групп генов, активируемых под воздействием ингибитора васкулогенной мимикрии.

Анализ регуляции 50 генов со сниженной экспрессией показал, что примерно 20–30 из них в разных комбинациях регулируются 10 другими ФТ (табл. 4). Таким образом, ингибитор, подавляя образование ложных сосудов клетками меланомы, существенно изменяет характер экспрессии этих 50 генов с помощью множества ФТ.

 

Таблица 4. Факторы транскрипции (ФТ), одновременно регулирующие группы генов, экспрессия которых снизилась после добавления ингибитора

Фактор транскрипции

Доля

Padj

Ген

ZNF79

31/299

2.3420335820357761E-26

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;PRDM1;PPM1D;BBC3;RGS2;SERTAD1;SESN1;SESN2;ENC1;TP53INP1;FDXR;IER5;TRIM22;POLH;GADD45A;GDF15;SLC30A1;KLF4;PGF;PNRC1;ACER2;ACTA2;MDM2;PLXNB2;TNFSF9;EPHA2;HBEGF

ZNF821

26/299

6.532976510709839E-20

CSRNP1;BTG2;CDKN1A;SLC2A3;PRDM1;IFIT2;BBC3;FAM117A;RGS2;SESN1;SESN2;ENC1;TP53INP1;BMF;GADD45A;SMOX;GDF15;ARRDC3;KLF4;PGF;SBK1;BCL6;CCNG2;FSCN1;PLXNB2;HBEGF

ZNF425

24/299

1.5281770047316118E-17

BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PGF;PNRC1;IFIT2;RND1;BBC3;IQCN;RGS2;BCL6;SERTAD1;SESN1;CCNG2;SESN2;ENC1;TP53INP1;BMF;HBEGF

NR4A3

23/299

1.9800969612121248E-16

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;SOCS1;BCL6;CRISPLD2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF

MAFF

22/299

2.156404175382678E-15

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;PGF;PNRC1;IFIT2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;ENC1;IER5;EPHA2;HBEGF

SNAI1

22/299

2.156404175382678E-15

CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;GADD45A;GDF15;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PGF;RND1;ACTA2;RGS2;SOCS1;BCL6;SERTAD1;CRISPLD2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF

ATF3

21/299

1.4250083219969755E-14

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;SESN2;IER5;EPHA2;HBEGF

FOSB

21/299

1.4250083219969755E-14

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;KLF4;CLU;IFIT2;ACTA2;RGS2;ARC;BCL6;SERTAD1;CRISPLD2;ENC1;IER5;EPHA2;HBEGF

JDP2

21/299

1.4250083219969755E-14

PTGER4;CSRNP1;BTG2;CDKN1A;NOTCH1;GADD45A;GDF15;SLC2A3;PRDM1;KLF4;CLU;IFIT2;RGS2;BCL6;CRISPLD2;SESN2;ENC1;FSCN1;IER5;EPHA2;HBEGF

MXD1

21/299

1.4250083219969755E-14

CSRNP1;BTG2;CDKN1A;GADD45A;SMOX;GDF15;ARRDC3;SLC2A3;PRDM1;KLF4;PNRC1;IFIT2;HELZ2;RGS2;SOCS1;BCL6;SERTAD1;CCNG2;SESN2;IER5;HBEGF

Примечание. Представлены 10 ФТ. Указано число генов, ассоциированных с данным ФТ, в выборке из 299 генов, депонированных в базе данных (Доля). Результаты получены с помощью базы данных Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) для поиска ФТ, одновременно регулирующих гены (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что ингибитор васкулогенной мимикрии вызывает изменения в экспрессии более чем 200 генов в клетках меланомы. Экспрессия 100 из них довольно значительно усиливается или снижается (рис. 1). Предполагалось, что ингибитор LCS1269 вызывает повреждения ДНК и арест G2/M перехода клеточного цикла, тем самым восстанавливая чувствительность клеток меланомы к ДНК-повреждающим агентам [6, 7, 9].

В настоящее время мы не можем выявить ключевые гены, ответственные за эффект ингибитора, однако нами идентифицированы 100 генов, экспрессия которых резко изменяется под действием ингибитора. Эти гены играют важную роль в клеточном цикле, пролиферации клеток, формировании цитоскелета, миграции клеток, а также выполняют другие функции в клетках. Обнаружено, что кодируемый геном DEPDC1B ФТ, вовлеченный в миграцию клеток и запуск Wnt-сигнального пути, регулирует 42 гена, значительно усиливших экспрессию под действием ингибитора (табл. 3).

Как показано ранее, васкулогенная мимикрия связана с ремоделированием цитоскелета и требует целостности сети микротрубочек [17]. Значительное усиление активности генов KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5 (табл. 1), которые вовлечены в деполимеризацию микротрубочек, свидетельствует о нарушениях цитоскелета, вызываемых ингибитором. Кроме того, ингибитор вызывает резкое подавление экспрессии генов TCAF2 и ACER2, связанных с позитивной регуляцией миграции клеток и пролиферации (рис. 1). Известно, что миграция клеток связана с малигнизацией и метастазированием [18]. Следовательно, активация генов KIF18A, NAV3, FGF13, NCKAP5, нарушающих целостность цитоскелета, и одновременная репрессия генов TCAF2 и ACER2, которые теперь не могут усиливать миграцию и пролиферацию, способны потенцировать эффект подавления васкулогенной мимикрии ингибитором (рис. 3). В настоящее время мы планируем использовать искусственное выключение активности генов TCAF2 и ACER2, чтобы ослабить малигнизацию клеток меланомы за счет подавления миграции и метастазирования. Указанные гены могут быть мишенями для онкотерапии.

 

Рис. 3. Схема, показывающая, как добавление ингибитора нарушает баланс генной экспрессии и как это сказывается на фенотипе клеток меланомы. а – Баланс экспрессии генов до добавления ингибитора. Клетки веретеновидной формы на Матригеле формируют сосудоподобные структуры. б – Нарушение баланса экспрессии генов вызывает изменение поведения клеток (нарушается образование сосудоподобных структур) и их формы (клетки более округлые).

 

Ранее обнаружили, что ингибитор LCS1269 повреждает ДНК [6, 7, 9]. Нами показано, что ингибитор подавляет активность генов, которые связаны с передачей сигналов медиаторами P53 и сигналов о повреждениях ДНК (табл. 2), делая клетки меланомы более чувствительными к ДНК-повреждающим агентам. Таким образом, наши данные согласуются с ранее определенными свойствами ингибитора.

Другой важный аспект данной работы состоит в обнаружении механизма координированной экспрессии генов с помощью одновременной регуляции десятков генов наборами из десятков ФТ. Интересно, что при этом одни наборы ФТ вызывают активацию одних групп генов, тогда как другие в это же время вызывают репрессию других групп генов (табл. 3, табл. 4, рис. 3). Такая биполярная регуляция способна вызывать резкие изменения в экспрессии генов. Недавно мы обнаружили, что наборы таких генов-мишеней ФТ далеко не случайно перекрываются с генами, которые образуют контакты с ядрышками (данные будут опубликованы отдельно).

Одновременная экспрессия больших перекрывающихся наборов генов (коэкспрессия) – это недавно обнаруженный механизм регуляции генной активности. Во всех изученных клетках человека (ткани или культуры клеток) найдены гены, которые коэкспрессируются в разных комбинациях [19]. В клетках линии K562, например, в разных комбинациях коэкспрессируются 177 наборов генов [20]. Удобной клеточной моделью для анализа механизмов регуляции экспрессии генов, включая роль трехмерных структур хромосом в изменениях экспрессии генов, является также меланома.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-14-00035) и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант № 075-15-2021-1060).

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

N. A. Tchurikov

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Science

Author for correspondence.
Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. A. Vartanian

Department of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 115478

E. S. Klushevskaya

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

I. R. Alembekov

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. N. Kretova

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. R. Сhechetkin

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

G. I. Kravatskaya

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. S. Kosorukov

Department of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 115478

Yu. V. Kravatsky

Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

  1. Kosak S.T., Scalzo D., Alworth S.V., Li F., Palmer S., Enver T., Lee J.S., Groudine M. (2007) Coordinate gene regulation during hematopoiesis is related to genomic organization. PLoS Biol. 5(11), e309. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050309
  2. Tchurikov N.A., Fedoseeva D.M., Sosin D.V., Snezhkina A.V., Melnikova N.V., Kudryavtseva A.V., Kravatsky Y.V., Kretova O.V. (2015) Hot spots of DNA double-strand breaks and genomic contacts of human rDNA units are involved in epigenetic regulation. J. Mol. Cell. Biol. 7, 366‒382. doi: 10.1093/jmcb/mju038
  3. Xu P., Wu Q., Yu J., Rao Y., Kou Z., Fang G., Shi X., Liu W., Han H. (2020) A systematic way to infer the regulation relations of miRNAs on target genes and critical miRNAs in cancers. Front. Genet. 11, 278. doi: 10.3389/fgene.2020.00278
  4. Tchurikov N.A., Kretova O.V. (2007) Suffix-specific RNAi leads to silencing of F element in Drosophila melanogaster. PLoS One. 2(5), e476. doi: 10.1371/journal.pone.0000476
  5. Bartel D.P. (2018) Metazoan microRNAs. Cell. 173, 20–51. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.006
  6. Vartanian A., Baryshnikova M., Burova O., Afanasyeva D., Misyurin V., Belyаvsky A., Shprakh Z. (2017) Inhibitor of vasculogenic mimicry restores sensitivity of resistant melanoma cells to DNA-damaging agents. Melanoma Res. 27, 8‒16. doi: 10.1097/CMR.0000000000000308
  7. Kalitin N.N., Ektova L.V., Kostritsa N.S., Sivirinova A.S., Kostarev A.V., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Golubeva I.S., Ermolaeva E.V., Vergun M.A., Babaeva M.A., Lushnikova A.A., Karamysheva A.F. (2022) A novel glycosylated indolocarbazole derivative LCS1269 effectively inhibits growth of human cancer cells in vitro and in vivo through driving of both apoptosis and senescence by inducing of DNA damage and modulating of AKT/mTOR/S6K and ERK pathways. Chem. Biol. Interact. 364, 10056. doi: 10.1016/j.cbi.2022.110056
  8. Maniotis A.J., Folberg R., Hess A., Seftor E.A., Gardner L.M., Pe’er J., Trent J.M., Meltzer P.S., Hendrix M.J. (1999) Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. Am. J. Pathol. 155(3), 739–752. doi: 10.1016/S0002-9440(10)65173-5
  9. Вартанян А., Хоченкова Ю., Кособокова Е., Барышникова М., Косоруков В. (2021) СД437 снижает метастатический потенциал клеток меланомы. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 62(4), 333–340.
  10. Ramirez F., Ryan D.P., Gruning B., Bhardwaj V., Kilpert F., Richter A.S., Heyne S., Dundar F., Manke T. (2016) deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucl. Acids Res. 44, W160–165.
  11. Cui H., Zhao J. (2020) LncRNA TMPO-AS1 serves as a ceRNA to promote osteosarcoma tumorigenesis by regulating miR-199a-5p/WNT7B axis. J. Cell Biochem. 121, 2284–2293. doi: 10.1002/jcb.2945110
  12. Gkika D., Lemonnier L., Shapovalov G., Gordienko D., Poux C., Bernardini M., Bokhobza A., Bidaux G., Degerny C., Verreman K., Guarmit B., Benahmed M., de Launoit Y., Bindels R.J., Fiorio Pla A., Prevarskaya N. (2015) TRP channel-associated factors are a novel protein family that regulates TRPM8 trafficking and activity. J. Cell Biol. 208, 89–107. 10.1083/jcb.201402076' target='_blank'>https://doi: 10.1083/jcb.201402076
  13. Hu F., Fong K.O., Cheung M.P.L., Liu J.A., Liang R., Li T.W., Sharma R., Ip P.P., Yang X., Cheung M. (2022) DEPDC1B promotes melanoma angiogenesis and metastasis through sequestration of ubiquitin ligase CDC16 to stabilize secreted SCUBE3. Adv. Sci. 9, 2105226. https://doi.org/10.1002/advs.202105226
  14. Xu Y., Sun W., Zheng B., Liu X., Luo Z., Kong Y., Xu M., Chen Y. (2019) DEPDC1B knockdown inhibits the development of malignant melanoma through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis. Exp. Cell. Res. 379(1), 48–54. doi: 10.1016/j.yexcr.2019.03.021
  15. Musa J., Aynaud M.M., Mirabeau O., Delattre O., Grünewald T.G. (2017) MYBL2 (B-Myb): a central regulator of cell proliferation, cell survival and differentiation involved in tumorigenesis. Cell Death Dis. 8, e2895 (2017). https://doi.org/10.1038/cddis.2017.244
  16. Thurlings I., Martínez-López L., Westendorp B., Hien B.T., Martínez-López L.M., Zijp M., Thurlings I., Thomas R.E., Schulte-Merker S., Bakker W.J., de Bruin A. (2017) Synergistic functions of E2F7 and E2F8 are critical to suppress stress-induced skin cancer. Oncogene. 36, 829–839. https://doi.org/10.1038/onc.2016.251
  17. Vartanian A., Stepanova E., Grigorieva I., Solomko E., Belkin V., Baryshnikov A., Lichinitser M. (2011) Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling. Microcirculation. 18, 390–399. doi: 10.1111/j.1549-8719.2011.00102.x
  18. Bera K., Kiepas A., Godet I., Li Y., Mehta P., Ifemembi B., Paul C.D., Sen A., Serra S.A., Stoletov K., Tao J., Shatkin G., Lee S.J., Zhang Y., Boen A., Mistriotis P., Gilkes D.M., Lewis J.D., Fan C.M., Feinberg A.P., Valverde M.A., Sun S.X., Konstantopoulos K. (2022) Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611, 365–373. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05394-6
  19. Lachmann A., Torre D., Keenan A.B., Jagodnik K.M., Lee H.J., Wang L., Silverstein M.C., Ma’ayan A. (2018) Massive mining of publicly available RNA-seq data from human and mouse. Nat. Commun. 9, 1366.
  20. Tchurikov N.A., Klushevskaya E.S., Alembekov I.R., Kretova A.N., Chechetkin V.R., Kravatskaya G.I., Kravatsky Y.V. (2023) Induction of the erythroid differentiation of K562 Cells is coupled with changes in the inter-chromosomal contacts of rDNA clusters. Int. J. Mol. Sci. 24(12), 9842. https://doi.org/10.3390/ijms24129842

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Heat map of gene expression changes in melanoma cells under the influence of a vasculogenic mimicry inhibitor. Fifty genes were selected for each gene whose expression changed maximally (increased or decreased) under the influence of the inhibitor. A color scale of expression changes in log2FC is shown. The 50 genes whose expression increased correspond to the logFC > 1.71 criterion (i.e., their expression increased by more than 3.27 times). The 50 genes whose expression decreased correspond to the log2FC < 1.89 criterion (i.e., their expression decreased by more than 3.7 times).

Download (189KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Genes whose expression changed under the influence of the inhibitor (Input Genes) are regulated simultaneously by many FTs (Enriched Terms). a – Genes whose expression increased. b – Genes whose expression decreased. The results were obtained using the Enrichr database (https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich) to search for FTs that simultaneously regulate genes (Enrichr Submissions TF-Gene Coocurrence).

Download (270KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Schematic showing how adding an inhibitor disrupts the gene expression balance and how this affects the phenotype of melanoma cells. a – Gene expression balance before adding the inhibitor. Spindle-shaped cells on Matrigel form vessel-like structures. b – Disruption of the gene expression balance causes changes in cell behavior (formation of vessel-like structures is disrupted) and their shape (cells are more rounded).

Download (196KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».