Search for Bacteriophages Specific against Members of the Genus Rhodococcus

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

This is the first report on the isolation of Rhodococcus aetherivorans-specific bacteriophages and of applicability of such invertebrates as Hyalophora cecropia and Eisenia fetida as objects for screening the phage microflora of Rhodococcus species. Some of the isolated phages were capable of growth of R. ruber and R. qingshengii. An efficient procedure for bacteriophage reproduction in the liquid culture of R. aetherivorans was developed. The revealed bacteriophages may be used for development of efficient genetic tools for Rhodococcus strains, including the industrially significant ones.

Full Text

Бактерии рода Rhodococcus обладают большим биотехнологическим потенциалом в силу их способностей к биотрансформации и биосинтезу широкого круга органических молекул, таких, как лигноцеллюлоза, акриловые мономеры, триацилглицеролы, полигидроксиалканоаты, гликолипидные биосурфактанты, стероиды (Larkin et al., 2005; Martinkova et al., 2009; Kim et al., 2018). Разработка высокоактивных промышленно-значимых штаммов этих бактерий сдерживается ограниченной доступностью методов редактирования их генома, а именно, методов введения, замены и удаления генов, фрагментов генома и отдельных нуклеотидов (см. Grechishnikova et al., 2022; Liang et al., 2021).

Одним из путей расширения арсенала таких методов является поиск новых генов, кодирующих эффективные нуклеазы, рекомбиназы, интегразы, то есть ферменты, способные направленно изменять последовательность ДНК. Богатейшим источником разнообразия таких генов являются геномы бактериофагов, поэтому обнаруживаемые в природе фаги могут быть ценным источником генетического инструментария такого рода. Для бактерий E. coli сегодня активно применяются методы редактирования генома, основанные на рекомбинационных системах бактериофагов (Bubnov et al., 2022). Как правило, активность у фаговых рекомбиназ существенно выше, чем у бактериальных, что и является решающим фактором для их широкого применения. Для бактерий Rhodococcus такие подходы пока единичны (Liang et al., 2020), в первую очередь из-за недостатка эффективно работающих в родококках рекомбиназ. Эффективность функционирования фаговых генов в Rhodococcus (как и в клетках бактерий других родов) существенно зависит от оптимизированности их экспрессии, т.е. сходных с хозяином кодонных предпочтений и других особенностей. В силу этого, наиболее перспективным путем поиска новых ферментов для редактирования в Rhodococcus является поиск бактериофагов, способных размножаться на культурах этих бактерий. В российских и зарубежных коллекциях микроорганизмов количество таких изолятов невелико по сравнению с бактериофагами E. coli.

Мы провели анализ находящихся в открытом доступе геномов фагов, специфичных в отношении Rhodococcus (более 70), и выяснили, что лишь три генома содержат рекомбиназы RecET семейства, для которых показана функциональность в бактериях. Эти результаты указывают на то, что для расширения разнообразия рекомбиназ и выбора наиболее эффективных из них необходим поиск новых бактериофагов, специфичных в отношении Rhodococcus.

Целями настоящей работы были поиск в природе бактериофагов, способных размножаться на промышленно-значимых штаммах Rhodococcus, определение видоспецифичности изолятов и оптимизация методики выделения ДНК таких фагов, пригодной для молекулярно-биологических исследований.

В качестве бактерий-хозяев для исследования были выбраны промышленно значимые штаммы-биокатализаторы из коллекции ВКПМ R. aetherivorans Ас-926 (SU 1731814, 1990) и R aetherivorans Ac-2610 (US 20140187818A1, 2014).

Бактерии рода Rhodococcus являются типичными представителями почвенной микрофлоры. Однако ряд штаммов был обнаружен в составе микробиоты кровососущих насекомых (Yassin, 2005), различных полужесткокрылых (Salcedo-Porras et al., 2020), микробиоты тараканов (Guzman et al., 2021) и в кишечнике некоторых вредителей сельскохозяйственных культур. В связи с этим поиск штаммов проводился не только в разнообразных почвенных, компостных и водных образцах, полученных из различных природных зон, но также и в образцах экскрементов различных насекомых и иных беспозвоночных (Hyalophora cecropia, Medauroidea extradentata, Peruphasma schultei, Sungaya inexpectata, Eisenia fetida).

Фаги были изолированы методом обогащения (по Summer et al., 2011). Для этого 10–15 г материала образцов смешивали с 50 мл стерильной жидкой среды LB (триптон казеиновый – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl – 7 г, H2Oдист. – до 1 л; pH 7.0), содержавшей 1% хлороформа, инкубировали 4 ч при 30°С, 300 об./мин, затем отделяли осадок центрифугированием (10 мин, 10 тыс. об./мин). Надосадочную жидкость фильтровали через 0.22 мкм шприцевой фильтр (“Merck”), затем не менее 5 мл фильтрата добавляли к 45 мл культуры R. aetherivorans в среде LB в логарифмической стадии роста (ОП600 0.6), с последующей инкубацией в течение 4 ч при 30°С без перемешивания. Далее культуру продолжали культивировать в течение ночи при 30°С, 300 об./мин. Далее добавляли хлороформ до 1% и продолжали инкубирование при тех же условиях в течение 30 мин. После инкубации отделяли бактериальную биомассу центрифугированием с последующим фильтрованием через 0.22 мкм фильтр, фильтрат использовали для дальнейшей работы. Для изоляции, получения чистых культур и наработки посевных культур бактериофагов и культур штаммов-хозяев использовали агаризованную среду LB (для получения агаризованной среды дополнительно добавлялся агар-агар, 15 г/л). Верхний агар имел следующий состав (г/л): триптон казеиновый – 10, NaCl – 5, агар-агар – 10, H2Oдист. – до 1 л; pH 7.0. После автоклавирования в верхний агар добавляли 5 мM MgSO4 · 7H2O, 5 мM CaCl2 и глюкозу до 0.04%. Для получения негативных колоний бактериофагов из обогащенных культур 1 мл фильтрата смешивали с 1 мл расплавленного и охлажденного до 48°С верхнего агара с суспензией клеток Rhodococcus (конечная концентрация агар-агара в верхнем агаре 0.5%). При необходимости использовали разведения фильтрата. Чистые культуры бактериофагов получали путем неоднократной изоляции отдельной негативной колонии, ее суспендирования в фаговом буфере (10 мM Tris·HCl с pH 7.6, 5 мM MgSO4 · 7H2O, 0.01% желатин), разведения и посева (не менее 3–4 “раундов” очистки).

Наибольшее разнообразие штаммов бактериофагов R. aetherivorans удалось обнаружить в образцах зрелых компостов из различных географических зон, а также из экскрементов гусениц и дождевых червей. Насколько нам известно, это первое сообщение о выделении бактериофагов, специфичных для R. aetherivorans. Кроме того, мы впервые показали, что экскременты беспозвоночных являются перспективным источником бактериофагов родококков. Из водных образцов, взятых как в морских, так и пресных биотопах, выделить бактериофаги Rhodococcus не удалось.

Часть чистых культур фагов были использованы для капельного теста на видоспецифичность, проводившегося, как описано ранее, (Бактериофаги, 2012) на штаммах, полученных из ВКПМ. Анализ бактериофагов, выделенных из микробиоты Hyalophora cecropia, показал частичную перекрестную видоспецифичность с R. ruber Aс-1801, R. qingshengii Ас-1800, R. qingshengii Ac-1793, но не со штаммами R. erytropolis и R. rhodochrous. Большинство из протестированных изолятов (15 изолятов) были специфичны по отношению к R. aetherivorans (табл. 1).

 

Таблица 1. Оценка видоспецифичности выделенных фагов в отношении некоторых видов рода Rhodococcus

№ штамма

R. aetherivorans М33

R. aetherivorans Ac-2063

R. ruber Aс-1801

R. qingshengii Ac-1800

R. qingshengii Ac-1793

R. erythropolis Ac-1737

R. rhodochrous Ac-1572

11

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

12

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

13

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

14

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

15

Лизис

Лизис

Неполный лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

16

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

32

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

33

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

34

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

35

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

36

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

37

Лизис

Лизис

Неполный лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

38

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

39

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

C1

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

C2

Лизис

Лизис

Неполный лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

C3

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

C4

Лизис

Лизис

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

C5

Лизис

Лизис

Лизис

Неполный лизис

Неполный лизис

Нет

Нет

C6

Лизис

Лизис

Неполный лизис

Неполный лизис

Неполный лизис

Нет

Нет

Примечание. Штаммы 11–39 были выделены из различных образцов компоста; штаммы С1–С6 были выделены из экскрементов Hyalophora cecropia. Показаны не все выделенные штаммы.

 

Полученные изоляты были депонированы в НБРЦ ВКПМ.

На последнем этапе нашей работы, для получения больших объемов фаголизатов с высоким титром для целей выделения ДНК для секвенирования, депонирования штаммов и закладки их в лабораторную коллекцию нами была разработана методика наработки бактериофагов с использованием жидких культур R. aetherivorans. Культивирование проводили в 50 мл разбавленной среды LB (г/л): триптон – 5, дрожжевой экстракт – 2.5, NaCl – 4. Колбы Эрленмейера с 50 мл среды засевали ночной культурой R. aetherivorans до ОП600 не менее 0.8, после чего заражали посевной культурой бактериофага (конечные значения титра – не менее 105 БОЕ/колбу). Посевные культуры для получения больших объемов фаголизатов получали путем смыва верхнего агара фаговым буфером с последующим фильтрованием через 0.22-мкм шприцевые фильтры. Зараженную фагом культуру культивировали в термостате при 30°С без перемешивания в течение не менее 4 ч с последующим культивированием не менее 12 ч при 30°С, 300 об./мин. Дополнительный цикл культивирования – 4 ч 30°С без перемешивания, с последующим культивированием не менее 4 ч при 30°С и 300 об./мин повышал выход бактериофага примерно на 10%. Далее к фаголизату добавляли хлороформ до конечной концентрации 0.1% и культивирование с перемешиванием продолжали еще 30 мин. Лизат центрифугировали при 4°С, 12000 об./мин и фильтровали через 0.22-мкм шприцевые фильтры (“Merck”). Титр бактериофагов в лизатах, приготовленных таким образом, колебался от 109 до 1011 БОЕ/мл (в зависимости от штамма).

Геномную ДНК бактериофагов выделяли фенольным методом, как описано в работе (Petrovski et al., 2011), со следующей модификацией: перед стадией обработки фенолом образец смешивали с равным объемом гуанидинового буфера (Тритон Х100 3%, гуанидин гидрохлорид 5%, Трис HCl pH 8.0 10 мM, ЭДТА 0.2 мM, H2Odist – до 1 л).

Геномная ДНК из найденных нами 25 новых штаммов бактериофагов R. aetherivorans была выделена, как описано выше. Качество препаратов геномной ДНК проверяли гель-электрофорезом, рестрикционным анализом и ПЦР. Оказалось, что препараты ДНК выглядели как гомогенная полоса с молекулярным весом около 40 т.п.н., что говорит об отсутствии значительных примесей более тяжелой хромосомной ДНК бактерий и продуктов ее деградации. При гидролизе рестриктазами ДНК бактериофагов давала характерный воспроизводимый профиль фрагментов различного веса (данные не приведены), что указывает на достаточную для молекулярно-биологических операций чистоту препарата.

Таким образом, в работе впервые были выделены бактериофаги, специфичные для R. aetherivorans, и впервые была показана перспективность беспозвоночных как объектов для скрининга фаговой флоры представителей рода Rhodococcus. Была разработана методика наработки суспензий бактериофагов с высоким титром с использованием жидких культур R. aetherivorans. Найденные бактериофаги могут быть использованы для разработки эффективных молекулярно-биологических инструментов для Rhodococcus aetherivorans, в том числе и промышленно значимых штаммов представителей этого вида.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность ведущему научному сотруднику ООО “ДНК Экспертиза” Радченко В.В. и коллективу Сибирского ботанического сада ТГУ (г. Томск) за предоставленные образцы экскрементов беспозвоночных.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках Государственного задания НИЦ Курчатовский институт, при частичной поддержке Соглашения МОН 075-15-2019-1659 о создании геномных центров мирового уровня (выделение и анализ ДНК бактериофагов).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

A. D. Novikov

NRC “Kurchatov Institute”, Kurchatov Genomic Center

Author for correspondence.
Email: alexm19@mail.ru
Russian Federation, 123182

I. P. Tokmakova

NRC “Kurchatov Institute”, Kurchatov Genomic Center

Email: alexm19@mail.ru
Russian Federation, 123182

A. A. Samarin

NRC “Kurchatov Institute”, Kurchatov Genomic Center

Email: alexm19@mail.ru
Russian Federation, 123182

K. V. Lavrov

NRC “Kurchatov Institute”, Kurchatov Genomic Center

Email: alexm19@mail.ru
Russian Federation, 123182

A. S. Yanenko

NRC “Kurchatov Institute”, Kurchatov Genomic Center

Email: alexm19@mail.ru
Russian Federation, 123182

References

  1. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Под ред. Э. Каттер, А. М. Сулаквелидзе. М.: Научный мир, 2012. 640 с.
  2. Bubnov D. M., Yuzbashev T. V., Khozov A. A., Melkina O. E., Vybornaya T. V., Stan G. B., Sineoky S. P. Robust counterselection and advanced λRed recombineering enable markerless chromosomal integration of large heterologous constructs // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. P. 8947–8960. https://doi.org/10.1093/nar/gkac649
  3. Grechishnikova E. G., Shemyakina A. O., Novikov A. D., Lavrov K. V., Yanenko A. S. Rhodococcus: sequences of genetic parts, analysis of their functionality, and development prospects as a molecular biology platform // Crit. Rev. Biotechnol. 2023. V. 43. P. 835–850. https://doi.org/10.1080/07388551.2022.2091976
  4. Guzman J., Vilcinskas A. Draft genome sequence of Rhodococcus rhodochrous strain G38GP, isolated from the Madagascar hissing cockroach // Microbiol. Resour. Announc. 2021. V. 10. Art. e0077721. https://doi.org/10.1128/MRA.00777-21
  5. Kim D., Choi K. Y., Yoo M., Zylstra G. J., Kim E. Biotechnological potential of Rhodococcus biodegradative pathways // J. Microbiol. Biotechnol. 2018. V. 28. P. 1037–1051. https://doi.org/10.4014/jmb.1712.12017
  6. Larkin M. J., Kulakov L. A., Allen C. C. Biodegradation and Rhodococcus – masters of catabolic versatility // Curr. Opin. Biotechnol. 2005. V. 16. P. 282–290. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2005.04.007
  7. Liang Y., Jiao S., Wang M., Yu H., Shen Z. A CRISPR/Cas9-based genome editing system for Rhodococcus ruber TH // Metab. Engin. 2020. V. 57. P. 13–22. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.10.003
  8. Liang Y. X., Yu H. M. Genetic toolkits for engineering Rhodococcus species with versatile applications // Biotechnol. Adv. 2021. V. 49. Art. 107748. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107748
  9. Martinkova L., Uhnakova B., Patek M., Nesvera J., Kren V. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus // Environ. Int. 2009. V. 35. P. 162–177. https://doi.org/10.1016/j.envint.2008.07.018
  10. Salcedo-Porras N., Umana-Diaz C., de Oliveira Barbosa Bitencourt R., Lowenberger C. The role of bacterial symbionts in triatomines: an evolutionary perspective // Microorganisms. 2020. V. 8. Art. 1438. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091438
  11. Summer E. J., Liu M., Gill J. J., Grant M., Chan-Cortes T.N., Ferguson L., Janes C., Lange K., Bertoli M., Moore C., Orchard R. C., Cohen N. D., Young R. Genomic and functional analyses of Rhodococcus equi phages ReqiPepy6, ReqiPoco6, ReqiPine5, and ReqiDocB7 // Appl. Environ. Microbiol. 2011. V. 77. P. 669–683. https://doi.org/10.1128/AEM.01952-10
  12. Yassin A. F. Rhodococcus triatomae sp. nov., isolated from a blood-sucking bug // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1575–1579. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63571-0
  13. Патент СССР. 1990. № SU1731814.
  14. Патент США. 2014. № US20140187818A1.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».