Email this article 
Phylogenetic analysis of phn transporters of Achromobacter insolitus LCu2
- Authors: Kryuchkova Y.V.1, Burygin G.L.1,2,3
-
Affiliations:
- Saratov Scientific Centre, Russian Academy of Sciences
- Saratov State University
- Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering Named after N.I. Vavilov
- Issue: Vol 93, No 4 (2024)
- Pages: 438-443
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://bakhtiniada.ru/0026-3656/article/view/272132
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624040062
- ID: 272132
Cite item
Full Text
Abstract
Phosphonates are alternative phosphorus sources for bacteria. The genome of Achromobacter insolitus strain LCu2 contains three predicted phn clusters of ABC-type phosphonate transporters into the cell. To understand the functional, evolutionary, and ecological role of the phn clusters, phylogenetic analysis of substrate-binding PhnD proteins from strain LCu2 with their homologs in other Achromobacter species and in closely related genera of the family Alcaligenaceae was carried out. The PhnD transporters formed three separate clusters, which indicated the differences in their structural composition. PhnD1 and PhnD2 were present in the genomes of all Achromobacter species and grouped separately from those of other members of the family Alcaligenaceae, which indicated vertical inheritance of the phnD1 and phnD2 genes and their involvement in the life-supporting processes. PhnD3 was found in the genomes of seven Achromobacter species. The phnD3 gene was probably acquired via horizontal transfer or duplication and is induced during adaptation to changing environmental conditions. Maintenance of three structurally different clusters of the phn transporters is probably ecologically advantageous to A. insolitus LCu2, providing for phosphorus retrieval from synthetic and natural organophosphonates as well as other sources.
Full Text
Фосфонаты – органические соединения, содержащие высокостабильную (С‒Р) связь, используются бактериями как альтернативный источник фосфора. Дефицит фосфатов в окружающей среде индуцирует у бактерий работу Pho регулона и экспрессию генов phn оперона, отвечающего за поглощение и расщепление фосфонатов. Гены phn оперона кодируют АТФ-зависимый импортер (PhnCE) и периплазматический субстрат-связывающий белок (PhnD) для поглощения фосфонатов, регулятор транскрипции (PhnF), а также белковый комплекс (PhnGHIJKLMNOP), непосредственно участвующий в расщеплении С‒Р связи (Amstrup et al., 2023). Однако наличие phn оперона не всегда позволяет бактериям утилизировать различные по своей структуре фосфонаты. Так, например, культура E. coli, у которой впервые был открыт и описан phn оперон, росла на алкил фосфонатах, но не была способна к росту на глифосате, даже в присутствии ароматических аминокислот (Kertesz et al., 1991). Одной из причин, почему некоторые бактерии, имеющие С‒Р лиазу, не утилизируют те или иные фосфонаты, может быть различная субстратная специфичность и степень аффинности транспортных phn белков к фосфоновым кислотам и их производным (Hove-Jensen et al., 2014).
Целью данного исследования было проведение сравнительного филогенетического анализа между различными субстрат-связывающими PhnD транспортерами штамма Achromobacter insolitus LCu2 и гомологами других видов рода Achromobacter, а также некоторых близкородственных представителей семейства Alcaligenaceae.
Ризосферный штамм A. insolitus LCu2 (IBPPM 631; RCAM 04723) выделен с корней люцерны посевной, как деструктор глифосата по С‒Р лиазному пути. Геном A. insolitus LCu2 секвенирован на базе Казанского федерального университета, аннотирован и депонирован в базе данных GenBank под номером CP038034.
Для анализа использовали аминокислотные последовательности, предсказанные как PhnD, экстрагированные из общедоступных в GenBank бактериальных геномов рода Achromobacter и семейства Alcaligenaceae, включая исследуемый штамм LCu2. Множественное выравнивание последовательностей для филогении осуществляли в Clustal Omega (Sievers et al., 2011). Филогенетическую реконструкцию проводили в программе MEGA X (Kumar et al., 2018), используя Neighbor-joining анализ и бутстрэп-тест (1000 повторов).
Геном A. insolitus LCu2 содержал три кластера предсказанных phn транспортеров: первый (phnC1D1E1), расположенный на прямой цепи около phn оперона, кодирующего С‒Р лиазный ферментный комплекс; второй (phnD2C2E2Е2) и третий (phnD3C3E3), размещенные, соответственно, выше и ниже phn оперона на обратной цепи ДНК. Таким образом, для работы были отобраны три субстрат-связывающие белка PhnD1 (QEK91627), PhnD2 (QEK91158) и PhnD3 (QEK94759). Попарное выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков между собой показало низкую степень идентичности в пределах 25‒29% и покрытие менее 70%.
Первоначально мы проанализировали геномы различных видов рода Achromobacter, чтобы выяснить количество phn транспортеров и гомологию к PhnD белкам штамма LCu2. Поиск осуществляли с помощью BLASTP анализа. Гомологи PhnD1 и PhnD2 транспортеров присутствовали у всех исследуемых видов Achromobacter, обладали высокой степенью идентичности (> 95%). PhnD3 был найден только в геномах семи видов ‒ A. denitrificans, A. arsenitoxydans, A. deleyi, A. aegrifaciens, A. insolitus, A. pestifer, A. agilis (дополнительные материалы, таблица S1).
Для наглядности в филогенетический анализ были добавлены последовательности Phn транспортеров некоторых бактерий семейства Alcaligenaceae, близкородственных роду Achromobаcter: Alcaligenes faecalis (типовой вид для семейства), Bordetella petrii, B. Holmesii, B. pertussis. А также PhnD последовательности Cupriavidus basilensis, C. pampae, C. agavae, демонстрирующие идентичность с белками штамма LCu2 в BLASTP анализе, исключающем другие ахромобактерии. Филогенетическая реконструкция показала, что исследуемые PhnD транспортеры штамма LCu2 расходились в три самостоятельных кластера. Кластер фосфонат-связывающих белков PhnD1 ахромобактерий, из phn оперона, был образован тремя обособленными кладами, отстоял отдельно от B. petrii и С. basilensis. Транспортер PhnD1 штамма A. insolitus LCu2 группировался с белками A. aegrifaciens, A. pestifer, A. anxifer (рис. 1).
Рис. 1. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей PhnD транспортеров бактерий рода Achromobacter и некоторых представителей семейства Alcaligenaceae. PhnD последовательности штамма A. insolitus LCu2 обозначены звездами; фигурные скобки соответствуют границам кластеров, образованных белками PhnD1, PhnD2, PhnD3; структурные организации ABC-кассет phn транспортеров в геномах Achromobacter, включая A. insolitus LCu2, приведены справа; phnD маркированы зеленым.
Подобная топология говорит о консервативности гена phnD1, который наследовался, вероятно, путем вертикального переноса и является важным для жизнеобеспечения бактерий. Используя множественное выравнивание последовательностей PhnD1 относительно референсного белка из E. coli (3P7I), показано наличие консервативных мотивов в белке A. insolitus LCu2, а также аминокислотные остатки, потенциально отвечающие за связывание субстрата (дополнительные материалы, рис. S1).
Второй кластер был образован белками PhnD3 ахромобактерий, а также Cupriavidus и Bordetella. Несмотря на высокую идентичность (92‒98%) между PhnD3 последовательностями ахромобактерий (дополнительные материалы, таблица S1), белки A. insolitus LCu2, A. agilis, A. denitrificans образовывали самостоятельные клады. Возможно, поддержание в геноме PhnD3 транспортеров обеспечивает бактериям преимущество в адаптации к изменяющимся условиям местообитаний. Анализ геномного окружения выявил рядом с ABC-кассетой PhnD3C3E3 ген, кодирующий фосфолипазу С (QEK94757), расщепляющую фосфолипид мембраны – фосфатидилхолин до фосфохолина и диацилглицерина. У некоторых почвенных и ризосферных бактерий экспрессия фосфолипазы С увеличивается в десятки раз в условиях фосфорного голодания, а высвободившийся фосфохолин используется на нужды клетки (Krol, Becker, 2004; Zavaleta-Pastor et al., 2010).
В кластере, образованном белками PhnD2, транспортер штамма LCu2 располагался в общей кладе с A. aegrifaciens, A. pestifer, A. anxifer. Видовой состав соответствовал кладе, образованной белками PhnD1, но имел иную топологию. Транспортер PhnD2 A. insolitus LCu2 был на одной ветви с A. anxifer, а PhnD1 штамма LCu2 с A. aegrifaciens. В остальном PhnD2 последовательности ахромобактерий преимущественно группировались отдельно от изолятов Alcaligenaceae. Исключение составили белки двух видов – A. xylosoxidans и A. spanius, которые показали филогенетическую близость к Alcaligenes faecalis. Общая топология кластера PhnD2 также свидетельствовала о вертикальном наследовании гена phnD2, и его роли в жизнедеятельности клетки. Вокруг кассеты phnD2C2E2Е2 расположены гены биосинтеза витаминов группы В (тиамина, рибофлавина, пантотеновой кислоты), а также гены, продукты которых фосфорилируют витамины до активных коферментов. Можно предположить, что PhnD2 имеет сродство к фосфорилированным витаминам, или транспортирует источники для фосфорилирования. Безусловно, эта гипотеза нуждается в тщательном исследовании.
Таким образом, биоинформатический и филогенетический анализ показали, что три предсказанных PhnD субстрат-связывающих транспортера в геномах представителей рода Achromobacter, включая последовательности A. insolitus LCu2, различаются между собой по степени консервативности, структурному строению, геномному контексту. Выявленные различия могут быть опосредованы сродством PhnD транспортеров к разным источникам фосфора, включая как органофосфонаты, так и соединения с фосфоэфирной связью. Полученные результаты отражают адаптационный потенциал A. insolitus LCu2, а также демонстрируют его возможные стратегии в условиях дефицита неорганического фосфора.
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА
Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы 121031700141-7.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Таблица S1. Наличие и идентичность аминокислотных последовательностей PhnD в геномах бактерий рода Achromobacter
No. | Species | Identity, % | ||
PhnD1 | PhnD2 | PhnD3 | ||
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 | A. xylosoxidans A. piechaudii A. denitrificans A. arsenitoxydans A. insuavis A. deleyi A. aegrifaciens A. mucicolens A. marplatensis A. insolitus A. ruhlandii A. spanius A. aestuarii A. anxifer A. animicus A. pestifer A. kerstersii A. veterisilvae A. agilis A. aloeverae A. dolens A. pulmonis | 99.69 94.19 95.71 95.06 92.33 94.80 97.55 22.58* 95.71 100 91.41 95.72 78.26 96.63 – 96.93 95.72 95.09 95.71 71.91 91.10 92.33 | 91.10 96.69 96.39 98.19 97.89 97.59 98.49 97.29 96.39 100 96.12 96.39 48.24 99.70 96.39 98.49 96.08 96.08 96.69 36.08 95.52 96.39 | – – 95.44 93.73 – 92.23 98.70 – – 100 – – – – – 98.39 – – 97.26 – – – |
Белками запроса в BLASTP анализе были PhnD транспортеры штамма A. insolitus LCu2.
Рис. S1. Множественное выравнивание PhnD1 из разных бактерий относительно референсного белка из E. coli (3P7I)
(3P7I) E. coli UTI89; (Q1R3F7) E. coli UTI89; (WP_207408615.1) Bordetella petrii; (WP_276287551.1) Cupriavidus basilensis; (QQV13938.1) Achromobacter xylosoxidans; (QEK91627) Achromobacter insolitus LCu2; (WP_062683200.1) Achromobacter denitrificans. “*” ‒ одинаковые аминокислоты; “:” ‒ аминокислоты одного класса; “.” ‒ часть аминокислот одного класса; консервативные мотивы помечены персиковым; аминокислотные остатки, отвечающие за образование водородных связей между субстратом (2-аминоэтилфосфонатом) и белком из E. coli (3P7I), отмечены звездочками (Alicea et al., 2011).
Alicea I., Marvin J. S., Miklos A. E., Ellington A. D., Looger L. L., Schreiter E. R. Structure of the Escherichia coli phosphonate binding protein PhnD and rationally optimized phosphonate biosensors // J. Mol. Biol. 2011. V. 414. P. 356‒369.
About the authors
Ye. V. Kryuchkova
Saratov Scientific Centre, Russian Academy of Sciences
Author for correspondence.
Email: kryu-lena@yandex.ru
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms
Russian Federation, SaratovG. L. Burygin
Saratov Scientific Centre, Russian Academy of Sciences; Saratov State University; Saratov State University of Genetics, Biotechnology and Engineering Named after N.I. Vavilov
Email: kryu-lena@yandex.ru
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms
Russian Federation, Saratov; Saratov; SaratovReferences
- Amstrup S. K., Ong S. C., Sofos N., Karlsen J. L., Skjerning R. B., Boesen T., Enghold J. J., Hove-Jensen B., Brodersen D. E. Structural remodelling of the carbon–phosphorus lyase machinery by a dual ABC ATPase // Nat. Commun. 2023. V. 14. Art. 1001. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y
- Hove-Jensen B., Zechel D. L., Jochimsen B. Utilization of glyphosate as phosphate source: biochemistry and genetics of bacterial carbon-phosphorus lyase // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014. V. 78. P. 176‒197.
- Kertesz M., Elgorriaga A., Amrhein N. Evidence for two distinct phosphonate-degrading enzymes (C‒P lyases) in Arthrobacter sp. GLP-1 // Biodegradation. 1991. V. 2. P. 53‒59.
- Krol E., Becker A. Global transcriptional analysis of the phosphate starvation response in Sinorhizobium meliloti strains 1021 and 2011 // Mol. Genet. Genom. 2004. V. 272. P. 1‒17.
- Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Mol. Biol. Evol. 2018. V. 35. P. 1547‒1549.
- Shah B. S., Ford B. A., Varkey D., Mikolajek H., Orr C., Mykhaylyk V., Owens R. J., Paulsen I. T. Marine picocyanobacterial PhnD1 shows specificity for various phosphorus sources but likely represents a constitutive inorganic phosphate transporter // ISME J. 2023. V. 17. P. 1040‒1051.
- Sievers F., Wilm A., Dineen D., Gibson T. J., Karplus K., Li W., Lopez R., McWilliam H., Remmert M., Söding J., Thompson J. D., Higgins D. G. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega // Mol. Syst. Biol. 2011. V. 7. Art. 539.
- Zavaleta-Pastor M., Sohlenkamp C., Gao J. L., Guan Z., Zaheer R., Finan T. M., Geiger O. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling during phosphorus limitation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 302‒307.
Supplementary files
