Application of Flow Cytometry for Viability Assessment of Mutants for Translation Termination Factors in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

全文:

Процесс терминации трансляции в клетках эукариот обеспечивается совместной работой факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 (Zhouravleva et al., 1995) при участии ряда других белков (Журавлева и соавт., 2022). Белок eRF1 отвечает за распознавание стоп-кодона, а фактор eRF3 является ГТФазой, активирующей работу eRF1. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae белки eRF1 и eRF3 кодируются жизненно важными генами SUP45 и SUP35, соответственно (Inge-Vechtomov et al., 2003). Однако ранее удалось получить коллекцию нелетальных нонсенс-мутантов по этим генам (Moskalenko et al., 2003; Chabelskaya et al., 2004). Мутации в генах SUP45 и SUP35 не только снижают точность терминации трансляции, но и приводят к плейотропным эффектам. Такие мутанты характеризуются пониженной жизнеспособностью, чувствительностью к повышенной или пониженной температуре, чувствительностью к аминогликозидным антибиотикам и повышенному осмотическому давлению, а также снижением функциональной активности митохондрий, нарушением клеточного цикла и морфологии клеток (Inge-Vechtomov et al., 2003). Несмотря на подробное описание коллекции мутантов, количественная оценка жизнеспособности нонсенс-мутантов sup45 и sup35 еще не проводилась. Традиционно методы оценки жизнеспособности микроорганизмов подразделяются на две группы. К первой группе относятся методы “чашечного подсчета”, основанные на способности клеток расти и размножаться в определенных контролируемых условиях. Одним из наиболее часто используемых методов данной группы является определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в образце. Однако, несмотря на простоту использования и низкую стоимость, существенными недостатками этих методов являются трудоемкость и длительное время получения результата. Ко второй группе относятся методы микроскопии с использованием колориметрических или флуоресцентных красителей. Выделяют ДНК-связывающие флуоресцентные красители — пропидий йодид (PI) или этидий бромид; а также колориметрические — трипановый синий или эритрозин В. Красители данного класса не способны проникать через неповрежденную мембрану живых клеток и окрашивают только мертвые или поврежденные клетки. Кроме того, есть группа красителей, способных проникать как в живые, так и в мертвые клетки. Механизм действия данных красителей основан на свойствах клеточной мембраны. Живые клетки способны выкачивать краситель в окружающую среду (флуоресцентный краситель — флоксин В) или восстанавливать его до бесцветного состояния под действием ферментов (колориметрический краситель — метиленовый синий). Таким образом, живые клетки остаются бесцветными, тогда как мертвые — окрашиваются в красный (флоксин В) или синий (метиленовый синий) цвет (Kwolek-Mirek, Zadrag-Tecza, 2014). Однако детекция окрашенных клеток с помощью микроскопии — это трудоемкий и длительный процесс, который заключается в визуальной и, порой, субъективной оценке жизнеспособных и мертвых клеток (Davey, Guyot, 2020; Alexandrov et al., 2021).

Альтернативным подходом для определения жизнеспособности клеток является современный и высокочувствительный метод проточной цитофлуориметрии, который получил широкое распространение, как в клинической диагностике, в промышленности, так и в научных исследованиях (Davey, Guyot, 2020). Данный метод основан на детекции параметров светорассеяния и флуоресценции отдельной клетки, когда она проходит сквозь луч лазера в проточном цитофлуориметре. Современные проточные цитофлуориметры, наряду с огромным разнообразием флуоресцентных красителей и антител, позволяют быстро и с высокой эффективностью анализировать различные характеристики клеток внутри гетерогенной популяции (морфология клеток, количество ДНК, клеточные маркеры, количество жизнеспособных и мертвых клеток). Традиционно для оценки жизнеспособности клеточной популяции суспензию клеток окрашивают ДНК-специфичными флуоресцентными красителями (например, PI) и проводят детекцию на проточном цитофлуориметре.

В настоящем исследовании мы впервые провели количественную оценку жизнеспособности мутантов по генам SUP45 и SUP35 по сравнению со штаммами дикого типа с помощью метода проточной цитофлуориметрии.

В работе использовали штаммы дрожжей S. cerevisiae U-1A-D1628 (MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52 leu2-3,112 SUP45::HIS3MX [pRS315-SUP45]) (Moskalenko et al., 2003) и U14-D1690 (MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52 leu2-3,112 SUP35::HIS3MX [pRSU2-SUP35]) (Maksiutenko et al., 2021). Оба штамма являются производными штамма 1A-D1628, показано, что штамм U-1A-D1628 содержит транслокации, затрагивающие гены FLO, и не способен к инвазивному росту (Barbitoff et al., 2021). Для получения штаммов, несущих мутантные аллели, использовали центромерные плазмиды серии pRS315 с SUP45 или sup45-105 (Moskalenko et al., 2003), а также серию плазмид pRSU1, несущих аллель SUP35 (Volkov et al., 2002) или sup35-218 (Chabelskaya et l., 2004). Штаммы выращивали при температуре 26C с использованием стандартных сред (Kaiser et al., 1994). Трансформацию дрожжей проводили согласно методике (Gietz, 1995).

Выделение плазмид проводили с использованием штамма Escherichia coli DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) по стандартной методике (Sambrook et al., 1989).

Окрашивание клеток дрожжей PI проводили по следующей методике: штаммы выращивали в жидкой полной (YEPD) среде до OD = 0.2; промывали клетки буфером PBS (“Sigma”, Германия), ресуспендировали в PBS с добавлением PI (“Sigma”, Германия) и РНКазы А (“Merck”, Германия) до конечной концентрации 4 и 10 мкг/мл, соответственно; инкубировали в течение 30 мин при 26C в темноте при перемешивании; промывали и ресуспендировали в PBS буфере; обработку клеточной суспензии ультразвуком проводили во льду на соникаторе Sonopuls HD2070 (“Bandelin”, Германия) при мощности 40%.

Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S (“Beckman Coulter”, США) на канале детекции FL3 (610/20 нм), анализировали по 50 тыс. клеток. Обработку данных выполняли в программе FlowJo10 (“BD Biosciences”, США). Для статистической обработки данных использовали Rstudio (RStudio Team, 2020).

Нонсенс-мутации в генах SUP45 и SUP35 приводят к снижению жизнеспособности. Для количественной оценки влияния мутаций на жизнеспособность мы сравнили интенсивность флуоресценции клеток дикого типа с мутантными клетками с помощью проточной цитофлуориметрии. В связи с тем, что используемые нами штаммы характеризуются повышенным уровнем “слипания” клеток, была проведена серия экспериментов с различными режимами соникации для оптимизации условий пробоподготовки. Так, двукратная обработка клеток ультразвуком в течение 10 с позволила получить максимальную популяцию одиночных клеток. В результате экспериментов по подбору оптимальных условий соникации мы выявили повышенную чувствительность мутантных клеток к ультразвуковой обработке по сравнению со штаммами дикого типа. Оказалось, что даже при подобранном нами щадящем режиме обработки ультразвуком, не менее 40% популяции мутантных клеток по параметрам прямого и бокового светорассеяния попадали в область клеточного дебриса, т. е. в область, близкую к нулевым значениям (левая нижняя область на графике прямого и бокового светорассеяния). Одновременно мутантные клетки характеризовались большим количеством дуплетов и кластеров клеток, которые также исключались из анализа. В связи с этим для дальнейшей оценки и статистической обработки данных были взяты только 56‒58% одиночных клеток из всех популяций мутантов, в то время как у дикого типа этот показатель составил 81–83% (табл. 1).

 

Таблица 1. Сравнение размера популяций одиночных и PI-позитивных клеток у дикого типа и у мутантов по генам SUP45 и SUP35

Вариант	Популяция одиночных клеток, %	Популяция PI-позитивных клеток, %
SUP45 (контроль)	81.37 ± 1.656	5.75 ± 0.597
sup45-105	56.03 ± 3.202	24.41 ± 3.289
SUP35 (контроль)	83.86 ± 1.929	6.12 ± 1.019
sup35-218	56.4 ± 2.80	22.17 ± 0.665

Примечание. Для каждого варианта представлены средние значения со стандартными отклонениями для 6 клонов. Данные соответствуют нормальному распределению (тест Шапиро‒Уилка), сравнение средних значений двух независимых выборок проведено с помощью t-критерия Стьюдента; p-уровень значимости указан для доли PI-позитивных клеток: p-value = 3.514 × 10^–6 и p-value = = 5.497 × 10^–12 для SUP45 и SUP35, соответственно.

 

В результате настоящего исследования мы выявили значимые различия размеров субпопуляций окрашенных, т. е. мертвых, клеток у штаммов дикого типа по сравнению с мутантом sup45 или sup35, соответственно (рис. 1).

 

Рис. 1. Мутации в генах SUP45 и SUP35 приводят к снижению жизнеспособности. Представлены данные проточной цитофлуориметрии (популяции одиночных клеток) для клонов, несущих аллели SUP45 (панель А) или SUP35 (панель Б). FSC-A — параметр прямого светорассеяния по площади. FL3-A::PI-A — флуоресцентный канал детекции (610/20 нм), регистрирующий интенсивность флуоресцентного сигнала (в данном случае — пропидий йодида) по площади.

 

На наш взгляд, чувствительность мутантов к воздействию ультразвука дополняет уже описанные многочисленные плейотропные эффекты у мутантов sup45 и sup35: чувствительность к повышенной температуре, осмочувствительность, нарушение почкования, изменения цитоскелета и пр. (Valouev et al., 2002; Inge-Vechtomov et al., 2003; Moskalenko et al., 2003; Chabelskaya et al., 2004). Кроме того, описана измененная и специфическая морфология мутантных клеток (Merritt et al., 2010), что также неоднократно наблюдалось и в исследованиях нашей лаборатории. Вероятно, мутации в генах SUP45 и SUP35 оказывают влияние на цитоскелет, морфологию клеток и клеточную стенку, что и приводит к чувствительности мутантных клеток к ультразвуковому воздействию.

Таким образом, в настоящем исследовании мы провели количественную оценку жизнеспособности штаммов S. cerevisiae, несущих мутации по генам SUP45 и SUP35. Метод проточной цитофлуориметрии позволяет эффективно разделить популяции живых и мертвых клеток дрожжей, а при использовании дополнительных красителей может помочь провести более детальные исследования для выявления различных субпопуляций клеток. Важно заметить, что, несмотря на широкое использование проточной цитофлуориметрии в разных областях, работ по применению данного метода для анализа дрожжей не так много. В ходе настоящего исследования основная сложность заключалась в оптимизации условий пробоподготовки. На основании полученных нами данных, описанную методику можно адаптировать для работы с другими штаммами дрожжей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данное исследование было выполнено на базе Ресурсного центра “Молекулярные и клеточные технологии” СПбГУ. Статья посвящается 300-летию СПбГУ.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Проект выполнен при финансовой поддержке гранта РНФ № 23-14-00063.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

E. Efremova

St. Petersburg State University

Email: g.zhuravleva@spbu.ru
俄罗斯联邦, St Petersburg, 199034

O. Zemlyanko

St. Petersburg State University; Laboratory of Amyloid Biology SPBU

Email: g.zhuravleva@spbu.ru
俄罗斯联邦, St Petersburg, 199034; St Petersburg, 199034

G. Zhouravleva

St. Petersburg State University; Laboratory of Amyloid Biology SPBU

编辑信件的主要联系方式.
Email: g.zhuravleva@spbu.ru
俄罗斯联邦, St Petersburg, 199034; St Petersburg, 199034

参考

补充文件