Unique findings of Phoma-like fungi associated with soybean

Texto integral

Введение

Соя — перспективная культура, активно возделываемая в России. Расширение посевов и увеличение доли сои в севооборотах способствует накоплению инфекционного потенциала фитопатогенных микромицетов. Аскохитоз сои — широко распространенное заболевание, которое вызывают несколько близкородственных видов фомоидных грибов, приводящих к развитию на сое сходных симптомов.

Фомоидные грибы — крупная, таксономически гетерогенная, полифилетическая группа морфологически сходных аскомицетов. Ранее большинство представителей этой группы объединяли в несколько крупных морфологически сходных родов, в основном Phoma Sacc., а также в Ascochyta Lib., Diaporthe Fuckel, Mycosphaerella Johanson, Paraphoma Morgan-Jones et J.F. White, Phyllosticta Pers., Stagonospora (Sacc.) Sacc. и др. (также понимаемых широко). Теперь фомоидные грибы делят на более чем 60 родов, относящихся к 20 семействам (Aveskamp et al., 2008, 2009, 2010; Boerema et al., 2004; Chen et al., 2015, 2017; Hou et al., 2020a, b; Rai et al., 2022; Gomzhina, Gannibal, 2017). Многие роды и виды фомоидных грибов являются фитопатогенами, приводящими к существенным потерям урожая (Deb et al., 2020; Hou et al., 2020a, 2020b; Rai et al., 2021; Zhao et al., 2021).

Одним из ключевых элементов для понимания того, как возникают и распространяются болезни растений и как с ними можно бороться, является выявление и корректная идентификация их возбудителей. Известно, что оценку биоразнообразия и надежную идентификацию видов фомоидных грибов в настоящее время осуществляют только с применением полифазного подхода в рамках консолидированной концепции вида (Consolidated species concept, CSC) (Crous et al., 2015), анализирующей в совокупности набор морфологических и молекулярно-генетических признаков. Таксономически информативными локусами ДНК, используемыми для реконструкции филогении в этой группе грибов, являются ITS-локус, участки генов, ответственные за синтез β-тубулина (tub2) и второй большой субъединицы фермента РНК-полимеразы II (rpb2).

Среди фомоидных грибов пятнистость листьев сои могут вызывать Boeremia exigua (Desm.) Aveskamp, Gruyter et Verkley и виды рода Didymella Sacc., в частности, Didymella glomerata (Corda) Qian Chen et L. Cai, D. pinodella (L.K. Jones) Qian Chen et L. Cai, D. pomorum (Thüm.) Qian Chen et L. Cai, и др. (Kövics et al., 2014; Deb et al., 2020; Hou et al., 2020a). Все эти виды являются сапротрофами и могут развиваться в почве, на растительных остатках, в воде, на широком круге других растений, включая культивируемые бобовые. На сое они могут быть патогенами, сапротрофами и эндофитами.

На текущий момент информация о фомоидных грибах, распространенных на территории России, является фрагментарной. Существуют отдельные работы, посвященные микобиоте конкретных растений-хозяев или биоразнообразию отдельных родов фомоидных грибов (Gomzhina et al., 2020a, 2020b, 2022; Gomzhina, Gasich, 2022; Nekrasov et al., 2022).

Исследования биоразнообразия фомоидных грибов, ассоциированных с соей, в рамках консолидированной концепции видов находятся на начальной стадии. Существует большое количество отечественных публикаций, посвященных изучению микобиоты сои, возделываемой на территории России (Abramov, 1931, 1938; Bondartseva-Monteverde, Vasilevskiy, 1940; Nikitina, 1962; Gunina, 1967; Nelen, 1977; Muravieva, 1977; Zhukovskaya, 1979; Naumova, 1988; Zaostrovnykh et al., 2018). Идентификация видов фомоидных микромицетов в опубликованных работах проводилась традиционными методами по морфологическим признакам спороносных структур. Очевидно, что данные, приведенные в этих работах, утратили свою актуальность.

Целью настоящего исследования являлась идентификация изолятов фомоидных грибов, выделенных из сои, собранной на территории нескольких регионов России, по молекулярно-генетическим, микроморфологическим и культуральным признакам и оценка их патогенности.

Материал и методы

Материал. В результате фитосанитарного мониторинга посевов сои, проводимого с 2017 г. в основных регионах, где возделывают эту культуру, были собраны листья с симптомами аскохитоза (рис. 1), а также семена пораженных растений. Образцы листьев хранятся в Микологическом гербарии LEP (ВИЗР).

Рис. 1. Листья сои с симптомами аскохитоза, из которых были выделены изученные изоляты: A — Рязанская обл., выделен Neoascochyta graminicola MF 1.42, 2020 г. (LEP 123703); Б — Амурская обл., выделен Remotididymella capsici MF 1.28, 2019 г. (LEP 123702); В — Амурская обл., выделен Stagonosporopsis stuijvenbergii MF 1.30, 2019 г. (LEP 123704).

Изоляты. Растительный материал поверхностно стерилизовали 5%-м р-ром гипохлорита натрия. Затем фрагменты листьев раскладывали на агаризованную картофельно-сахарозную питательную среду (КСА) (Samson et al., 2000) с добавлением смеси антибиотиков (ампициллин, стрептомицин, пенициллин, HyClone, Austria) и 0.4 мкл/л раствора Triton X-100 (Panreac, Spain). Чашки Петри инкубировали при 24 ^оC в темноте. Отсев выросших грибов проводили на 7—10-е сут, из каждой культуры гриба получали монопикнидиальные изоляты. Всего было выделено 100 изолятов фомоидных грибов. Бóльшая часть изолятов в результате мультилокусного севкенирования (данные не представлены) были идентифицированы как широко распространенные виды родов Boeremia и Didymella — традиционные представители микобиоты листьев сои. Восемь изолятов, отличающихся от большинства, было выбрано для исследования (табл. 1). Все изоляты хранятся в коллекции чистых культур микромицетов лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР (MF).

Таблица 1. Исследованные изоляты фомоидных грибов, выделенные из сои

Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование. Мицелий для экстракции ДНК был собран с поверхности 14-суточных чистых культур, выращенных на КСА при 24 ^оC. ДНК выделяли согласно стандартному методу СТАВ/хлороформ (Doyle, Doyle, 1990).

Для всех изолятов были определены нуклеотидные последовательности ITS-локусов рДНК и участки генов, tub2 и rpb2. Амплификацию локусов ДНК проводили с соответствующими парами праймеров: ITS-локус — ITS1/ITS4 (White et al., 1990), tub2 — βtub2Fw/βtub4Rd (Aveskamp et al., 2009), rpb2 — fRPB2—5F2 (Sung et al., 2007)/fRPB2—7cR (Liu et al., 1999). Финальный объем ПЦР смеси 25 мкл, включая dNTPs (200 μМ), прямой и обратный праймеры (0.5 μМ каждый), Taq ДНК полимеразу (5 ед./мкл), 10× ПЦР буфер с ионами Mg²⁺ и NH₄⁺, и 1—10 нг тотальной геномной ДНК. Условия проведения ПЦР были следующие: преденатурация 95 ^оC, 5 мин.; затем 35 циклов, состоящие из денатурации 92 ^оC, 50 с; отжиг праймеров 55 ^оC, 40 с, (ITS1/ITS4), 52 ^оC, 40 с (βtub2Fw/βtub4Rd), элонгация 72 ^оC, 75 с; финальная элонгация 5 мин при 72 ^оC. Участок гена rpb2 был амплифицирован согласно протоколу с прогрессивным снижением температуры отжига. Все этапы были проведены, как описано выше, но температуру отжига последовательно снижали, начиная с пяти циклов при 60 ^оC, 40 с, далее пять циклов при 58 ^оC, 40 с, затем 30 циклов при 54 ^оC, 40 с.

Для секвенирования, согласно стандартному протоколу (Boyle, Lew, 1995), производили очистку ДНК, полученной после ПЦР. Очищенные фрагменты секвенировали по методу Сэнгера (1977) на секвенаторе ABIPrism 3500 (Applied Biosystems — Hitachi, Япония) в соответствии с протоколами производителя с использованием набора реактивов с флуоресцентно меченными дезоксинуклеозидтрифосфатами BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI, США).

Филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997), после чего при необходимости выравнивание корректировали вручную.

Филогенетические деревья были построены согласно трем алгоритмам. Метод максимального правдоподобия (maximum likelihood — ML) был применен с использованием программного обеспечения IQ-tree (Minh et al., 2020). Оптимальная модель нуклеотидных замен была определена согласно Байесовскому информационному критерию (BIC) в программе IQ-tree. Принцип максимальной экономии (maximum parsimony — MP) — в программном обеспечении Molecular Evolutionary Genetics Analysis версии 10 (MEGA X; Kumar et al., 2018). Анализ последовательностей методом Байесовской статистики был проведен с использованием программы Mr. Bayes v. 3.2.1., интегрированной в платформу Armadillo v. 1.1 (Lord et al., 2012). Надежность топологии дендрограмм, построенных разными методами, была оценена с помощью бутстреп-анализа c 1000 повторностей. В качестве референсных были использованы полученные из базы данных GenBank последовательности ITS локуса рДНК, участков генов tub2, rpb2 всех видов на настоящий момент описанных для родов Neoascochyta Qian Chen et L. Cai, Remotididymella Valenz.-Lopez, Crous, Cano, Guarro et Stchigel и Stagonosporopsis Died. (табл. 2). В качестве внешней группы были взяты последовательности штамма Pyrenochaetopsis kuksensis Špetík, Eichmeier et Berraf-Tebbal.

Таблица 2. Номера доступа (GenBank) нуклеотидных последовательностей штаммов фомоидных грибов, включенных в исследование

Примечание. Типовые и репрезентативные штаммы обозначены буквами T и R соответственно. Номера доступа нуклеотидных последовательностей исследованных изолятов выделены полужирным. ATCC — American Type Culture Collection, Virginia, USA; BRIP — Plant Pathology Herbarium, Department of Employment, Economic, Development and Innovation, Queensland, Australia; DSM — Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany; CBS — Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, The Netherlands; CGMCC — China General Microbiological Culture Collection Center, Beijing, China; CMG — Culture collection of Micael Gonçalves, housed at Department of Biology, University of Aveiro, Aveiro, Portugal; CPC — Culture collection of Pedro Crous, housed at CBS; FMR — Facultat de Medicina, Universitat Rovira i Virgili, Reus, Spain; JW — Johanna Westerdijk working collection housed at the Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, The Netherlands; ICMP — International Collection of Microorganisms from Plants, Auckland, New Zealand; IMI — International Mycological Institute, CABI-Bioscience, Egham, Bakeham Lane, UK; LC — Personal Culture Collection Lei Cai, State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China; LEV — Plant Health and Diagnostic Station, Auckland, New Zealand; MF — Collection of Pure Cultures of the Laboratory of Mycology and Phytopathology, All-Russian Institute of Plant Protection, VIZR, Saint Petersburg, Russia; MFLU — Herbarium of Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailand; MFLUCC — Mae Fah Luang University Culture Collection, Chiang Rai, Thailand; MUCL — Mycotheque de l’Universite catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgium; MUM — Culture collection hosted at Center for Biological Engineering of University of Minho, Braga, Portugal; PD — Plant Protection Service, Wageningen, the Netherlands; PDDCC — Plant Diseases Division Culture Collection, Auckland, New Zealand; UTHSC — Fungus Testing Laboratory at the University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA; YMF — Herbarium of the Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources, Yunnan University, Kunming, Yunnan, PR China; ZHKUCC — Culture Collection of Zhongkai University of Agriculture and Engineering, China; ZHKU — Herbarium of Zhongkai University of Agriculture and Engineering, China.

Морфология. Для оценки культуральных признаков изоляты выращивали на трех агаризованных питательных средах, традиционно используемых для изучения фомоидных грибов, а именно на КСА, овсяной (OA) и солодовой (MEA) (Boerema et al., 2004). Изоляты культивировали в течение 14 сут при 24 ^оC. Первые семь сут в темноте, следующие семь — при переменном облучении ближним УФ в режиме день/ночь (12/12 ч). Диаметр колоний измеряли как на седьмые, так и на 14-е сут роста. Описание колоний осуществляли на 14-е сут. Микроморфологические признаки спороносных структур оценивали на 14-е сут на ОА. Наблюдения и измерения по 100 конидий и по 50 пикнид для каждого изолята были осуществлены на стереомикроскопе Olympus SZX16 (Olympus, Tokyo, Japan) и на микроскопе Olympus BX53. Микрофотографии были получены с камеры PROKYON (Jenoptik, Jena, Germany) с дифференциальным интерференционным контрастом Номарского.

Патогенность. Изучение патогенности изолятов в отношении сои осуществляли путем искусственного заражения отрезков листьев в лабораторных условиях. Для инокуляции использовали восприимчивый к листовым пятнистостям сорт сои Селекта 201 (ООО “Компания Соевый Комплекс”). Поверхностно стерилизованные 0.1%-м р-ром нитрата серебра семена помещали в чашки Петри на увлажненную водой фильтровальную бумагу и инкубировали в термостате при 24 ^оC, проросшие семена высевали в сосуды с почвой (по 2 шт. на 250 мл сосуд). Растения выращивали на светоустановке при переменном освещении люминесцентными лампами (12 ч день/12 ч ночь) до стадии двух тройчатых листьев. Инокулировали отрезки листочков первого тройчатого листа.

В качестве инокулюма использовали мицелиальную суспензию, полученную при культивировании изолятов на жидкой соевой среде (KH₂PO₄ —2 г; (NH₄)₂SO₄ —1 г; MgSO₄ —1 г; глюкоза — 20 г; соевая мука — 10 г; вода — 1 л; 50 мл среды на 250 мл колбу) в течение четырех суток на качалке (200 об./мин). Мицелий отделяли от культуральной жидкости, отжимали и измельчали, концентрацию мицелия доводили до 50 мг/мл.

Отрезки листьев растений раскладывали в чашки Петри на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу. В центр листового отрезка помещали каплю (10 мкл) мицелиальной суспензии. Инокулюм наносили на абаксиальную или адаксиальную поверхности листовых отрезков, интактные или надколотые в центре иглой. Чашки инкубировали на лабораторном столе при естественном освещении. Диаметр некрозов измеряли на 7, 14 и 21-е сут.

Результаты

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ, основанный на нуклеотидных последовательностях трех филогенетически информативных локусов ДНК (ITS, rpb2 и tub2), включал 82 штамма. Выборка объединяла все исследованные российские изоляты (8) а также типовые или репрезентативные штаммы, представляющие на настоящий момент все виды, принятые в родах Neoascochyta (17), Remotididymella (10) и Stagonosporopsis (34). Данные об общей длине матриц для каждого изолята, длине каждого локуса в отдельности, числе вариабельных сайтов и оптимальных моделях нуклеотидных замен суммированы в табл. 3.

Топология филограмм, построенных разными методами на основании последовательностей каждого локуса в отдельности, совпадали с топологией комбинированной филограммы (рис. 2).

Таблица 3. Данные об общей длине матриц, длине каждого локуса в отдельности, числе вариабельных сайтов и оптимальных моделях нуклеотидных замен, использованных для филогенетического анализа

Примечание. K2 — двухпараметрическая дистанция Кимуры; TN93 — дистанция Тамуры — Нея; TIM — переходная модель.

Рис. 2. Комбинированное филогенетическое древо видов Neoascochyta, Remotididymella, Stagonosporopsis, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS, rpb2 и tub2. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML (≥ 70), MP ≥ 70) и Байесовский статистики (≥ 0.7), приведены в узлах ветвей дендрограммы соответственно. Номера типовых или репрезентативных штаммов выделены буквами Т или R. Номера исследованных изолятов выделены синим.

Изолят MF 1.42 на мультилокусном филогенетическом древе формировал кладу с тремя репрезентативными штаммами Neoascochyta graminicola (Punith.) Qian Chen et L. Cai CBS102789, CBS301.69 и CBS586.79. Три изолята MF 1.28, MF 21.1, MF 21.6 формировали кладу вместе с типовым штаммом Remotididymella capsici (Bond.-Mont.) L.W. Hou, L. Cai et Crous CBS679.77. Четыре изолята Stagonosporopsis на комбинированной филограмме входили в состав двух клад. Одну составляли два изолята MF 1.2—15 и MF 1.25 и репрезентативный штамм Stagonosporopsis heliopsidis (H.C. Greene) Aveskamp, Gruyter et Verkley CBS109182, вторую — MF 1.30, MF 6.1 и типовой штамм S. stuijvenbergii Hern.-Restr., L.W. Hou, L. Cai et Crous CBS144953.

Морфология

Neoascochyta graminicola MF 1.42, соя, листья, Рязанская обл., 2020 г. (рис. 3). Колонии на КСА 45.0 ± ± 0.9 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 3, А) и 74.2 ± 3.1 мм после 14 сут (рис. 3, Г). Край неровный, дендритный. Колония равномерно покрыта матом пушистого, слегка хлопьевидного воздушного мицелия, оливково-серого в центре, край золотисто-оливковый, очевидно отличается границей от всей колонии. Реверс в центре темно-серый, по краю двухцветная кайма, состоящая из серо- оливковой и желтовато-серой полос. Колонии на ОА 39.8 ± 1.0 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 3, Б) и 73.0 ± 3.6 мм после 14 сут (рис. 3, Д). Край слегка неровный, хлопьевидный. Колония покрыта необильным хлопьевидным воздушным мицелием темно-серого цвета, субстратный мицелий серо-зеленый, с краю перламутрово-серый. Реверс сходный, в центре крапчатый. Колонии на МЕА 39.5 ± 0.5 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 3, В) и 60.0 ± 4.9 мм после 14 сут (рис. 3, Е). Край сильно неровный, лопастной и дендритный, центр слегка складчатый. Колония равномерно покрыта бархатистым мицелием персиково-коричневого цвета, по периферии бежево-персиковая. Реверс сходный.

Рис. 3. Морфологические особенности Neoascochyta graminicola MF 1.42: A–Е — культуры (A – на КСА, 7 сут; Б — на ОА, 7 сут; В — на МЕА, 7 сут; Г — на КСА, 14 сут; Д — на ОА, 14 сут; Е — на MEA, 14 сут); Ж, З — пикниды; И — внутренняя стенка пикниды, выстланная конидиогенными клетками; К — конидии. Левая половина — верхняя часть колонии, правая — реверс колонии. Масштаб: Ж — 500 мкм; З — 100 мкм; И и К — 20 мкм.

На ОА пикниды (рис. 3, Ж, З) немногочисленные, рассеянные по периферии колонии, поверхностные и полупогруженные, одиночные, реже в группах по две, с одним, реже двумя остиолами, иногда с кремовым споровым экссудатом, гладкие, коричневые и светло-коричневые, 118—322(206 ± 35) × 111—332(217 ± 36) мкм. Стенка пикниды состоит из изодиаметрических клеток, внешние слои пигментированы. Конидиеносцы редуцированы до прозрачных колбовидных конидиогенных клеток (рис. 3, З), формирующихся на внутренних слоях стенки пикниды. Конидии (рис. 3, И) в большинстве бобовидные с двумя полярными гуттулами, редко конидии яйцевидные или гантелевидные с многочисленными гуттулами, прозрачные, несептированные, 3.55—6.06(4.82 ± 0.4) × 1.58—2.24(1.94 ± 0.01) мкм.

На ОА многочисленные погруженные практически до самого донца чашки Петри скопления толстостенных меланизированных гиф со вздутыми клетками, а также склероциоподобных структур, из-за чего реверс выглядит крапчатым. На МЕА также формируются меланизированные утолщенные гифы, но их мало и они не погруженные, а в воздушном мицелии.

Remotididymella capsici MF 1.28, соя, листья, Амурская обл., 2019 г. (рис. 4). Колонии на КСА 72.2 ± 0.2 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 4, А), после 14 сут колонии достигают края чашки (рис. 4, Г). Край ровный. Колония равномерно покрыта матом обильного войлочного воздушного мицелия, серебристо-серая в центре, зелено-серая по периферии. Реверс в центре графитно-черный, по периферии темно-серый. Многочисленные плодовые тела равномерно рассеяны по поверхности колонии. Колонии на ОА 67.2 ± 0.5 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 4, Б), после 14 сут колонии достигают края чашки (рис. 4, Д). Край ровный. Колония покрыта обильным войлочным воздушным мицелием агатово-серого цвета, в центре колония практически черная, по периферии зеленовато-серая. Реверс серо-зеленый, в центре крапчатые секторы, по периферии равномерно крапчатый. Колонии на МЕА 49.5 ± 0.9 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 4, В), после 14 сут колонии достигают края чашки (рис. 4, Е). Край неровный, слегка лопастной. В центре колонии мицелий лизирован. Далее колония равномерно покрыта бархатистым мицелием, располагающимся радиальными кругами, разных оттенков персиково-бежевого цвета. Реверс сходный.

На ОА многочисленные плодовые тела (рис. 4, Ж, З), одиночные или собранные в крупные конгломераты, поверхностные. Многочисленны погруженные конгломераты из плодовых тел прямо на донце чашки Петри, из-за чего реверс выглядит крапчатым. Плодовые тела округлые или кувшинообразные, с одним слегка выраженным сосочком, темные, в массе практически черные, размеры сильно варьируют 52—145(114 ± 7) × 77—153(108 ± 5) мкм. Стенка плодового тела состоит из изодиаметрических клеток, внешние слои пигментированы. Внутри плодового тела в массе веером развиваются многочисленные сумки (рис. 4, З, И), в зрелых сумках формируется по восемь аскоспор. Аскоспоры двуклеточные с многочисленными гуттуалми, у перегородки перетянутые (обе части слегка сужаются к основанию), вершины закругленные, самая широкая часть — верхняя в основании сразу после септы (рис. 4, К) 9.78—17.3(13.47 ± 0.18) × 2.88—4.59(3.76 ± 0.04) мкм.

Рис. 4. Морфологические особенности Remotididymella capsici MF 1.28: A–Е — культуры (A – на КСА, 7 сут; Б — на ОА, 7 сут; В — на MEA, 7 сут; Г — на КСА, 14 сут; Д — ОА, 14 сут; Е — MEA, 14 сут); Ж, З — плодовые тела; И — незрелая сумка; К — аскоспоры; Л — сумка. Левая половина — верхняя часть колонии, правая — реверс колонии. Масштаб: Ж — 1 мм; З — 100 мкм; И и К — 20 мкм.

Stagonosporopsis heliopsidis MF 1.25, соя, семядоли, Приморский край, Уссурийск, 2018 г. (рис. 5). Колонии на КСА достигают края чашки после седьмых сут роста (рис. 5, А). Край ровный. Колония равномерно покрыта матом обильного войлочного воздушного мицелия от светлого серо-зеленого до оливково-серого, по периферии крапчатая. Реверс графитно-черный. Многочисленные пикниды равномерно рассеяны по колонии и под воздушным мицелием. Колонии на ОА достигают края чашки после седьмых сут роста (рис. 5, Б). Край ровный. Колония покрыта необильным клочковатым вой- лочным воздушным мицелием серо-пепельного цвета, субстратный мицелий темный серо-оливково-зеленый. Реверс металлическо-серый, по периферии равномерно или секторно-крапчатый. Колонии на МЕА 72.5 ± 1.0 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 5, В), после 14 сут достигают края чашки (рис. 5, Е). Край ровный. Колония слегка складчатая, равномерно покрыта необильным редким бархатистым мицелием, оранжево-коричневая в центре, далее к периферии перламутрово-золотистая. Реверс сходный. На ОА многочисленные пикниды (рис. 5, Ж–И), одиночные или собранные в конгломераты по две-три, поверхностные, погруженные и полупогруженные. Многочисленны погруженные пикниды прямо на донце чашки Петри, из-за чего реверс выглядит крапчатым. Пикниды округлые (рис. 5, И) 61.6—184.9(149.4 ± 29.4) × 57—218.8(162.6 ± 36.5) мкм или кувшинообразные (рис. 5, З) 119.5— 144.9(133.5 ± 7.4) × 76.5—81.8(78.5 ± 1.75) мкм, с одним небольшим сосочком, темные. Стенка пикниды состоит из изодиаметрических клеток, внешние слои пигментированы. Конидиеносцы редуцированы до прозрачных колбовидных конидиогенных клеток (рис. 5, К), формирующихся на внутренних слоях стенки пикниды. Конидии (рис. 5, Л) в большинстве бобовидные с двумя полярными гуттулами, прозрачные, несептированные, 3.7—5.07(4.41 ± 0.03) × 1.67—2.74(2.02 ± 0.02) мкм.

Рис. 5. Морфологические особенности Stagonosporopsis heliopsidis MF 1.25: A–Е — культуры (A – на КСА, 7 сут; Б — на ОА, 7 сут; В — на MEA, 7 сут; Г — на КСА, 14 сут; Д — ОА, 14 сут; Е — MEA, 14 сут); Ж–И — пикниды; К — конидиогенная клетка; Л — конидии. Левая половина — верхняя часть колонии, правая — реверс колонии. Масштаб: Ж — 2 мм; З, И — 50 мкм; К, Л — 20, мкм.

S. stuijvenbergii MF 1, соя, семена, Амурская обл., 2018 г. (рис. 6). Колонии на КСА 71.0 ± 0.4 мм в диам. после седьмых суток роста (рис. 6, А), после 14 сут достигают края чашки (рис. 6, Г). Край ровный. Колония равномерно покрыта обильным хлопьевидным воздушным мицелием серо-желтого цвета в центре, далее серовато-желто-оливкового. Реверс черно-коричневый, по периферии светлый оливково-серый, в центре крапчатый. Колонии на ОА 59.8±2.0 мм в диаметре после седьмых сут роста (рис. 6, Б), после 14 сут достигают края чашки (рис. 6, Д). Край ровный. Колония покрыта редким воздушным мицелием серебристо-серого цвета, субстратный мицелий практически черный в центре, по периферии желтовато-серо-оливковый. Реверс графитно-серый, по периферии коричнево-зеленый, крапчатый. Многочисленные пикниды равномерно рассеяны по поверхности колонии, на пикнидах крупные капли светло-серого экссудата. Колонии на МЕА 62.0 ± 0.9 мм в диам. после седьмых сут роста (рис. 6, В), после 14 сут достигают края чашки (рис. 6, Е). Край ровный. Колония равномерно покрыта бархатистым мицелием серебристо-серого цвета. Реверс коричнево-оранжевый.

На ОА многочисленные пикниды (рис. 6, Е, Ж), одиночные или собранные в конгломераты по двое- трое, с обильным споровым экссудатом светло-кремового цвета. Бóльшая часть пикнид поверхностные, полупогруженные и редко погруженные. Многочисленны погруженные пикниды прямо на донце чашки Петри, из-за чего реверс выглядит крапчатым. Пикниды округлые (рис. 6, З) 137.8—250.8(192 ± 12.6) × 142.5—283.6(195.3 ± 12.7) мкм, с одним или двумя сосочками, светло-коричневые. Стенка пикниды состоит из изодиаметрических клеток, внешние слои пигментированы. Конидиеносцы редуцированы до прозрачных колбовидных конидиогенных клеток, формирующихся на внутренних слоях стенки пикниды. Конидии (рис. 6, И) в большинстве бобовидные или эллипсоидные, с двумя полярными гуттулами, прозрачные, несептированные, 3.39—5.5(4.27 ± 0.04) × 1.52—2.38(1.87 ± 0.02) мкм, отдельные конидии очевидно крупнее остальных 5.82—8.24(6.97 ± 0.23) × 1.64—2.46(2.01 ± 0.09) мкм.

Рис. 6. Морфологические особенности Stagonosporopsis stuijvenbergii MF 6.1: A–Е — культуры (A – на КСА, 7 сут; Б — на ОА, 7 сут; В — на MEA, 7 сут; Г — на КСА, 14 сут; Д — ОА, 14 сут; Е — MEA, 14 сут); Ж, З — пикниды; И — конидии. Левая половина — верхняя часть колонии, правая — реверс колонии. Масштаб: Ж — 5 мм; З — 100 мкм; И — 20, мкм.

Патогенность

Все исследованные изоляты не проявили патогенных свойств в отношении листьев сои тестируе- мого восприимчивого к листовым пятнистостям сорта Селекта 201. На 21-е сут после заражения симптомы отсутствовали на всех листьях во всех вариантах опыта (рис. 7).

Рис. 7. Результаты теста на патогенность, отрезки листьев сои, сорт Селекта 201, 14 сут после инокуляции. Варианты инокуляции: A — негативный контроль, стерильная вода; Б — мицелиальная суспензия изолята MF 6.1 Stagonosporopsis stuijvenbergii; В — позитивный контроль, мицелиальная суспензия изолята Cercospora cf. sigesbeckiae MF 3.13. Первый ряд в каждой чашке Петри — инокулюм нанесен на верхнюю сторону интактного отрезка. Второй ряд — инокулюм нанесен на верхнюю сторону отрезка с предварительным ранением. Третий ряд — инокулюм нанесен на нижнюю сторону интактного отрезка. Четвертый ряд — инокулюм нанесен на нижнюю сторону отрезка с предварительным ранением.

Обсуждение

Все исследованные изоляты в результате мультилокусного филогенетического и сравнительно-морфологического анализа были идентифицированы до таксонов уровня вида. Обычно аскохитоз сои вызывают виды родов Didymella: D. pinodella, D. pinodes, D. pomorum и др., поэтому находки грибов Neoascochyta graminicola, Remotididymella capsici, Stagonosporopsis heliopsidis и S. stuijvenbergii являются редкими. Все эти грибы были впервые выявлены на таком растении-хозяине, как соя.

Изоляты MF 1.28, MF 21.1 и MF 21.6 по морфологическим признакам плодовых тел были идентифицированы как Mycosphaerella. Результаты мультилокусного филогенетического анализа позволили заключить, что эти изоляты являются видом Remotididymella capsici, входящими в состав другого рода и даже семейства. Базионимом R. capsici был Ascochyta capsici Bond.-Mont. Этот гриб был описан В.Н. Бондарцевой-Монтеверде в 1923 (Bondartseva-Monteverde, 1923) с листьев Capsicum annuum, собранных в РСФСР. В 1977 г. на Фиджи были собраны и сохранены в гербарии (CBS H-24340) листья этого же вида растения с симптомами пятнистости, возбудитель которой был идентифицирован как Ascochyta capsici. В мире существует единственный штамм A. capsici CBS679.77 = LEV 11926b, выделенный из этого образца. В 2020 г. в результате идентификации этого штамма по молекулярно-филогенетическим признакам было установлено, что он не является сестринским другим штаммам Ascochyta, а попадает в кладу, сформированную видами Remotididymella, где образует отдельную монофилетичную линию (Hou et al., 2020a). Так была предложена новая таксономическая комбинация Remotididymella capsici. Штамм CBS679.77, который предложили использовать как репрезентативный для этого вида, в чистой культуре является стерильным. По морфолого-культуральным признакам исследованные нами изоляты отличались от репрезентативного. Так на ОА репрезентативный штамм формирует быстрорастущие колонии светло-коричневатого оттенка (Hou et al., 2020a), в то время как колонии исследованных изолятов зеленовато-серого оттенка. На МЕА колонии репрезентативного штамма беловатые с черными зонами (Hou et al., 2020a), а колонии исследованных изолятов персиково-бежевого цвета.

В 2021 г. из воздуха, взятого между листьями Ageratina adenophora в Китае в провинции Юннань, был выделен штамм CGMCC3.19990, на основании которого был описан новый вид Remotididymella anemophila H.B. Zhang, A.L. Yang et L. Chen (Yang et al., 2021). В мультилокусный филогенетический анализ по необъяснимой причине авторы не включили последовательности ITS, rpb2 и tub2 репрезентативного штамма R. capsici CBS679.77, хотя другие виды Remotididymella, описанные в работе Hou et al. (2020), в этом анализе были использованы. Нуклеотидные последовательности всех трех локусов штамма CGMCC3.19990 являются идентичными таковым у штамма R. capsici CBS679.77. Кроме того, все исследованные нами изоляты имеют также одинаковые нуклеотидные последовательности ITS, rpb2 и tub2, что и штаммы CGMCC3.19990 и CBS679.77. Более того, морфологические особенности R. anemophila, описанные в протологе, полностью согласуются с морфологическими признаками исследованных изолятов MF 1.28, MF 21.1 и MF 21.6. Таким образом, на основании изучения молекулярно-филогенетических, морфолого-культуральных и микроморфологических признаков, очевидно, что все пять штаммов (CGMCC3.19990, CBS679.77, MF 1.28, MF 21.1 и MF 21.6) являются представителями одного вида Remotididymella. Согласно кодексу номенклатуры водорослей, грибов и растений, имя R. anemophila следует признать избыточным и изменить его статус на nom. rej., оставив приоритет за ранее описанным именем R. capsici (Bond.-Mont.) L.W. Hou, L. Cai et Crous. R. capsici был выявлен на листьях перца в России (Bondartseva-Monteverde, 1923) и на Фиджи (Hou et al., 2020a). Соя впервые зарегистрирована нами как субстрат для этого гриба.

Neoascochyta graminicola широко распространен в Европе на растениях семейства Poaceae (Chen et al., 2017; Hou et al., 2020a). Stagonosporopsis stuijvenbergii известен из образцов почвы, собранной в Нидерландах (Hou et al., 2020а), а изоляты S. heliopsidis были обнаружены в США, Канаде, Нидерландах, России только на сложноцветных растениях. Таким образом, виды Neoascochyta graminicola и Stagonosporopsis stuijvenbergii были впервые выявлены на территории России в Рязанской и Амурской областях соответственно.

В результате оценки патогенности изолятов этих грибов в отношении сои восприимчивого сорта Селекта 201 было установлено, что таким свойством они не обладают, по всей вероятности, развиваются сапротрофно на вызванных другими фитопатогенными грибами некротических пятнах или же являются эндофитами. Микобиота листьев сои обогатилась на четыре новых вида фомоидных грибов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-76-30005).

Sobre autores

М. Gomzhina

Autor responsável pela correspondência
Email: gomzhina91@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

E. Gasich

Email: elena_gasich@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

Bibliografia

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares

Ação

1. JATS XML

Baixar

2. Fig. 1. Soybean leaves with symptoms of ascochyta blight, from which the studied isolates were isolated: A - Ryazan region, isolated Neoascochyta graminicola MF 1.42, 2020 (LEP 123703); B — Amur region, isolated Remotididymella capsici MF 1.28, 2019 (LEP 123702); B - Amur region, isolated Stagonosporopsis stuijvenbergii MF 1.30, 2019 (LEP 123704).

Baixar (127KB)

Metadados

3. Fig. 2. Combined phylogenetic tree of the species Neoascochyta, Remotididymella, Stagonosporopsis, constructed by the ML method, based on the nucleotide sequences of ITS, rpb2 and tub2. Numerical values of bootstrap support obtained by the ML (≥ 70), MP ≥ 70) and Bayesian statistics (≥ 0.7) methods are given at the nodes of the dendrogram branches, respectively. Numbers of type or representative strains are indicated by the letters T or R. Numbers of tested isolates are indicated in blue.

Baixar (1018KB)

Metadados

4. Fig. 3. Morphological features of Neoascochyta graminicola MF 1.42: A–E - cultures (A - on KSA, 7 days; B - on OA, 7 days; C - on MEA, 7 days; D - on KSA, 14 days; E - on OA, 14 days; E - on MEA, 14 days); F, Z - pycnidia; I - the inner wall of the pycnida, lined with conidiogenic cells; K - conidia. The left half is the top of the colony, the right half is the reverse of the colony. Scale: F - 500 µm; W - 100 µm; I and K - 20 µm.

Baixar (924KB)

Metadados

5. Fig. 4. Morphological features of Remotididymella capsici MF 1.28: A–E - cultures (A - on KSA, 7 days; B - on OA, 7 days; C - on MEA, 7 days; D - on KSA, 14 days; E - OA , 14 days; E - MEA, 14 days); F, H - fruiting bodies; And - immature bag; K - ascospores; L - bag. The left half is the top of the colony, the right half is the reverse of the colony. Scale: F - 1 mm; W - 100 µm; I and K - 20 µm.

Baixar (1MB)

Metadados

6. Fig. 5. Morphological features of Stagonosporopsis heliopsidis MF 1.25: A–E — cultures (A — on KSA, 7 days; B — on OA, 7 days; C — on MEA, 7 days; D — on KSA, 14 days; E — OA , 14 days; E - MEA, 14 days); F–I—pycnidia; K - conidiogenic cell; L - conidia. The left half is the top of the colony, the right half is the reverse of the colony. Scale: F - 2 mm; H, I - 50 µm; K, L - 20, microns.

Baixar (1MB)

Metadados

7. Fig. 6. Morphological features of Stagonosporopsis stuijvenbergii MF 6.1: A–E - cultures (A - on KSA, 7 days; B - on OA, 7 days; C - on MEA, 7 days; D - on KSA, 14 days; E - OA , 14 days; E - MEA, 14 days); F, Z - pycnidia; And - conidia. The left half is the top of the colony, the right half is the reverse of the colony. Scale: F - 5 mm; W - 100 µm; I - 20, microns.

Baixar (1MB)

Metadados

8. Fig. 7. Results of the pathogenicity test, pieces of soybean leaves, Selecta 201 variety, 14 days after inoculation. Inoculation options: A - negative control, sterile water; B — mycelial suspension of isolate MF 6.1 Stagonosporopsis stuijvenbergii; B — positive control, mycelial suspension of Cercospora cf. sigesbeckiae MF 3.13. The first row in each Petri dish is the inoculum applied to the upper side of the intact segment. Second row - inoculum is applied to the upper side of the segment with preliminary wounding. Third row - inoculum is applied to the underside of the intact segment. Fourth row - inoculum is applied to the underside of the segment with preliminary wounding.

Baixar (296KB)

Metadados