The effects of submicron particles of metal oxides on the production of hydrogen peroxide and the activity of oxidative enzymes of Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum

Full Text

Введение

Многие промышленные материалы подвергаются биодеградации под воздействием различных микроорганизмов. Одним из основных агентов биодеструкции промышленных материалов являются мицелиальные грибы. В силу разнообразия их метаболических путей, лабильности ферментных систем эта группа живых организмов способна вызывать биодеградацию как природных, так и синтетических полимеров. Наиболее эффективной и распространенной формой защиты от биоповреждений является применение биоцидов. В качестве биоцидов сейчас широко используются вещества на основе оксидов металлов. Особый интерес вызывают мелкодисперсные нано- и субмикронные частицы оксидов металлов. Они способны подавлять жизнедеятельность различных микроорганизмов и используются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, а также для защиты промышленных материалов от биоповреждений (He et al., 2011; Gunatillake et al., 2018; Veltri et al., 2019; Meleshko et al., 2020; Marin-Flores et al., 2021; Nevezhina, Fadeeva, 2021). Многие из этих соединений обладают фотокаталитической активностью, т.е. под действием света они способны образовывать активные формы кислорода (АФК) (Thabet et al., 2014; Sirelkhatim et al., 2015; Liu et al., 2020; Valenzuela et al., 2020; Riduan, Zhang, 2021). Весьма перспективным направлением является использование данных соединений для создания антимикробных полимерных композиций. Биоцидная активность фотокаталитически активных оксидов металлов зависит от множества факторов. Например, более мелкие частицы этих веществ показывают более сильную антимикробную активность. Большое влияние на это также оказывают их концентрация, форма и волновой спектр, а также виды металлов, входящих в состав оксида. Также имеют значение интенсивность излучения, специфика и особенности биологического объекта, например, вида или штамма микромицета (Yamamoto, 2001; Kutawa et al., 2021).

Одним из недостатков, ограничивающих применение оксидов металлов в качестве антимикробных агентов, является то, что они проявляют фотокаталитическую активность в области УФ-излучения (Kathirvelu et al., 2009; Bhanvase et al., 2017). Весьма перспективным является поиск новых оксидов, проявляющих фотокаталитическую активность (т.е. обладающих антимикробным эффектом) в условиях видимого света. В этом плане в НИИ Химии ННГУ разработаны сложные оксиды на основе W, Rb и Cs, фотокаталитический эффект которых проявляется в условиях видимого света. У этих соединений показана антимикробная активность по отношению к бактериям и мицелиальным грибам в темноте и на свету, причем на свету антимикробный эффект возрастал (Smirnov et al., 2022). В настоящее время работ по изучению механизмов ингибирующего действия (как на свету, так и в темноте) исследуемых соединений на метаболизм микроорганизмов немного. Отсутствие знаний о механизмах действия данных соединений на метаболизм микромицетов-биодеструкторов сдерживает их эффективное и целенаправленное применение в качестве средств защиты промышленных материалов от биоповреждений в плане создания различных промышленных композиций, обладающих антимикробной активностью.

Известно, что процесс биоповреждений и биоразрушений промышленных материалов происходит под воздействием экзометаболитов, выделяемых микромицетами. Важную роль в процессах биодеградации играют грибные экстрацеллюлярные оксидоредуктазы (каталаза, пероксидаза), а также активные формы кислорода, в частности пероксид водорода (Veignie et al., 2004). Ранее нами исследовалась активность внеклеточных (секретируемых) оксидоредуктаз (каталазы, пероксидазы) у штамма Aspergillus niger van Tieghem ВКМF-1119 при действии низкочастотного импульсного магнитного поля и низкоинтенсивного лазерного излучения. Было показано разнонаправленное действие этих факторов на активность данных ферментов (действие излучения могло как стимулировать, так и ингибировать активность вышеуказанных энзимов) (Makarov et al., 2019).

Целью настоящей работы являлось изучение влияния субмикронных частиц новых сложных оксидов металлов различного химического состава на ряд экзооксидоредуктаз (каталазы и пероксидазы) и на содержание пероксида водорода в среде культивирования грибов-биодеструкторов промышленных материалов.

Материалы и методы

В качестве объекта исследований использовали оксид вольфрама (V) (WO₃) со средним размером частиц 670 нм, сложные оксиды CsTeMoO₆ со средним диам. частиц 670 нм и RbTe_1.5W_0.5O₆ со средним диам. частиц 736 нм. В качестве образца мелкодисперсного оксида вольфрама WO₃ был использован химически чистый реактив, который предварительно перетирали в агатовой ступке в этиловом спирте. Соединения CsTeMoO₆ и RbTe_1.5W_0.5O₆ были синтезированы в НИИ химии ННГУ им. Н.И. Лобачевского и описаны ранее (Fukina et al., 2021, 2022а, 2022b).

В качестве тест-культур микроорганизмов использовали штаммы мицелиальных грибов, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, Пущино): A. niger van Tieghem ВКМ F-1119 и Penicillium chrysogenum Thom ВКМ F-245. Данные штаммы широко используются в различных стандартных испытаниях по оценке устойчивости промышленных материалов и изделий к действию микроскопических грибов (Smirnov et al., 2018; Ivanushkina et al., 2023). Штамм Aspergillus niger van Tieghem ВКМ F-1119 был выделен в Австралии с радиотехнического изделия в процессе его биоповреждения; штамм Penicillium chrysogenum Thom ВКМ F-245 выделен в Федеральном государственном унитарном предприятии “Государственный научный центр по антибиотикам” (ФГУП ГНЦА), Россия. Данные грибы являются хорошими продуцентами оксидоредуктаз и широко используются в различных биохимических экспериментах (Makarov et al., 2019).

В качестве источника света использовали светодиодный прожектор JAZZWAY PFL-C3 мощностью 50 Вт. Поверхностная плотность потока излучения светодиодного прожектора, воздействующая на поверхность образцов соединений, составляла 524 Вт/м². Значительную часть в спектральном составе данного прожектора составляет излучение в области видимого спектра, что является хорошей моделью естественных условий.

Культивирование микроскопических грибов проводили на жидкой полной питательной среде Чапека — Докса следующего состава (г/л): NaNO₃–2.0, KH₂PO₄-0.74, K₂HPO₄–0.3, KCl – 0.5, MgSO₄ × 7Н₂О – 0.5, FeSO₄ × 7Н₂О – 0.01, сахароза – 30.0. Выращенный на жидкой питательной среде мицелий грибов отфильтровывали, взвешивали и помещали в колбы с 50 мл новой жидкой питательной средой Чапека — Докса. В исследовании было представлено три варианта эксперимента: контрольная группа (культивирование грибов в среде, не содержащей исследуемые оксиды металлов) и две опытные группы (культивирование грибов в среде, содержащей исследуемые оксиды металлов, в темноте и под воздействием света). В опытные группы добавлялись субмикронные частицы оксида металла в концентрации 2 мг/мл. Культивирование проводилось в течение 7 сут на шейкерах при температуре 25 ± 2 ^оC, скорость — 120 об./мин. Затем отбирали равные аликвоты (10 мл) культуральной жидкости из каждой колбы и центрифугировали со скоростью 10 300g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения активности экзокаталазы и экзопероксидазы, а также количества образовавшегося пероксида водорода.

Определение содержания суммы гидроперекисей проводили на основе методики Gay, Gebicki (2000) с изменениями. К 1 мл культуральной жидкости приливали 200 мкл 0.25 М H₂SO₄, 200 мкл 1 мМ ксиленолового оранжевого, 200 мкл 1 мМ соли Мора, 400 мкл 0.5 М сорбитола. В контрольном р-ре культуральную жидкость заменяли на жидкую питательную среду Чапека — Докса. Контрольную и опытные пробирки выдерживали в темноте в течение 30 мин и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре UV-mini 1240 “Shimadzu” (Япония) при длине волны 560 нм против оптического контроля.

Активность ферментов определяли спектрофотометрически на приборе UV-mini 1240 “Shimadzu” (Япония): каталазную — по убыли Н₂О₂ при λ = 240 нм (Li, Schellhorn, 2007), пероксидазную — по окислению п-фенилендиамина при λ = 535 нм в присутствии Н₂О₂ (Nagaraja et al., 2009). За единицу активности (ед.) ферментов принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мг белка. Содержание белка в культуральной среде определяли методом Лоури — Фолина (Dawson et al., 1991).

Все результаты, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах и не менее чем в трех — пяти повторностях, обрабатывали с помощью программ Statistica 11.0 и Microsoft Excel 2007. Оценку достоверности различий средних значений проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95%. На рисунках приведены средние значения всех опытов со стандартными ошибками (Kobzar, 2006).

Результаты и обсуждение

Как уже отмечалось нами выше, определенная роль в процессе биодеградации грибами промышленных материалов принадлежит пероксиду водорода. Выделяемый почвенными микромицетами H₂O₂ участвует в трансформации различных химических соединений, образующийся в результате разложения пероксида водорода кислород способен также окислять различные природные и синтетические субстраты. Кроме этого пероксид водорода может являться субстратом для ряда экзооксидоредуктаз, участвующих в биодеструкции различных промышленных материалов. Известно, что многие микроорганизмы, в том числе и грибы, используют H₂O₂ в процессах конкуренции и антагонизма (Marinho et al., 2014; Zhang et al., 2019; Vilchis-Landeros et al., 2020).

Используемые нами методы позволяют определять суммарное содержание образующихся гидроперекисей в среде. Исходя из того, что основная их масса представлена пероксидом водорода, в целом, на наш взгляд, при обсуждении полученных результатов будет обоснованно говорить именно об этом соединении.

Согласно литературным данным, H₂O₂ может образовываться в водной среде под воздействием исследуемых соединений в результате их фотокаталитической активности (Smirnov et al., 2022):

МеO + hν → МеО (h⁺ + e^–) [1];

H₂O + h⁺ → H⁺ + •OH [2];

O₂ + e^– → •O₂^– [3];

• O₂^–+ H⁺ → •HO₂ [4];

2HO₂• → H₂O₂+ O₂ [5];

HO₂ + H⁺→ H₂O₂ [6].

Известно, что супероксид-анион радикал является основным предшественником пероксида водорода, образующегося в воде под действием света, или в результате его дисмутации, или в результате взаимодействия с протонами, образующимися при диссоциации воды в процессе ее фотолиза (уравнения 2, 5, 6). Аналогичные реакции образования пероксида водорода происходят и в клетках живых организмов (Andrés et al., 2022).

На первом этапе исследований представляло интерес определить содержание H₂O₂ в среде культивирования без грибов в присутствии исследуемых соединений. Как уже отмечалось выше, фотокаталитическая активность оксидов металлов, в т.ч. исследуемых нами соединений, связана с образованием АФК (супероксид-анион радикала, гидроперекисного радикала, пероксида водорода). Согласно литературным данным, количество АФК и их вид зависит от природы металла и ширины его запрещенной зоны. В данном эксперименте мы обнаружили H₂O₂ только в случае воздействия света на CsTeMoO₆. Что касается содержания пероксида водорода в воде, то известно, что оно зависит от многих факторов и варьирует в широких пределах. Отсутствие пероксида водорода в среде, содержащей RbTe_1.5W_0.5O₆ и WO₃, может быть связано с рядом причин: недостаточная чувствительность используемой методики определения пероксида водорода, что не позволяет определить малые концентрации данного соединения; известно, что в зависимости от природы металла в сложных оксидах в ряде случаев супероксидный анион радикал может не образовываться в процессе воздействия света, и в таком случае продукция H₂O₂ невозможна (Fukina et al., 2022a).

Далее нами было изучено влияние частиц оксидов тяжелых металлов в условиях света и темноты на содержание гидроперекисей в среде при культивировании грибов Aspergillus niger и Penicillium chrysogenum (рис. 1, 2).

 

Рис. 1. Содержание гидроперекисей в среде культивирования Aspergillus niger (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Рис. 2. Содержание гидроперекисей в среде культивирования Penicillium chrysogenum (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Показано, что данные грибы способны выделять во внешнюю среду пероксид водорода, причем P. chrysogenum в большей степени по сравнению с Aspergillus niger. Известно, что грибы могут синтезировать эндогенные и экзогенные формы пероксида водорода, используя для этого различные ферменты. В частности, внутри клетки работают эндоферменты, такие как супероксиддисмутаза, глюкозооксидаза и некоторые другие. При этом образующийся H₂O₂ может выделяться в окружающую среду. Образование внеклеточного пероксида водорода может катализироваться некоторыми экзоферментами, в частности, с помощью внеклеточных изоформ глюкозооксидазы (Hernández-Ortega et al., 2012; Daou, Faulds, 2017; Dzambi, Mangoyi, 2020; Martínez-Ruiz et al., 2022).

При добавлении в среду культивирования грибов A. niger и Penicillium chrysogenum изучаемых оксидов тяжелых металлов содержание пероксида водорода в культуральных жидкостях значительно снижалось по сравнению с контролем. При этом в условиях действия света на WO₃ содержание H₂O₂ в культуральной среде Aspergillus niger было больше, нежели в темноте, что может быть связано с продукцией пероксида водорода оксидом вольфрама в процессе фотокатализа, а в случае Penicillium сhrysogenum содержание H₂O₂ было больше в условиях темноты, что может говорить о более стойком к воздействию данного оксида процессе синтеза пероксида водорода указанного гриба в темноте.

Установлено, что при введении RbTe_1.5W_0.5O₆ продукция пероксида водорода полностью блокировалась как в темноте, так и на свету у обоих видов грибов.

Соединение CsTeMoO₆ оказало меньший эффект, чем другие вещества в случае Aspergillus niger, на что указывает примерно одинаковое по сравнению с WO₃ количество пероксида водорода в среде культивирования как на свету, так и в темноте. Тот же оксид при сохранении своего пероксид-образующего эффекта в чистой среде оказал значительно больший ингибирующий эффект как в условиях темноты, так и света на продукцию внеклеточного пероксида водорода у Penicillium chrysogenum, что говорит о более слабой устойчивости систем, нужных для нормального протекания всех процессов, способствующих синтезу этим грибом внеклеточного H₂O₂. В основе указанных выше ингибирующих эффектов могут лежать как световые механизмы, так и темновые. В настоящее время темновой механизм ингибирующего действия нано- и субмикронных частиц оксидов металлов на метаболизм микроорганизмов связывают с тем, что эти вещества разрушают мембраны, легко проникают в микробную клетку и связываются с SH-группами в активных центрах ряда ферментов, вызывая инактивацию последних. В результате нарушается проницаемость мембран и дыхание живых организмов (Zakharova, Gusev, 2019). Ингибирующие механизмы данных частиц под воздействием света обусловлены синтезом АФК, которые могут негативно влиять на клеточную мембрану, обеспечивающую транспорт как самого пероксида водорода, так и экзоферментов, необходимых для его продукции снаружи клетки, а также нарушение поступления и выведения различных органических и неорганических веществ. Кроме того, АФК могут негативно влиять и на сами экзо- и эндоферменты, взаимодействуя с их активными центрами, а также изменяя пространственную структуру ферментов. Более того, АФК могут негативно влиять на генетический аппарат клетки, нарушая процессы экспрессии различных белков, а также различных РНК (Sirelkhatim et al., 2015).

Далее нами было исследовано влияние оксидов тяжелых металлов на активность внеклеточных (секретируемых) ферментов (каталазы и пероксидазы) у грибов Aspergillus niger и Penicillium chrysogenum (рис. 3—6). На рис. 3 и 4 показано, что активность экзокаталазы Aspergillus niger значительно возросла по сравнению с контролем при добавлении CsTeMoO₆, причем на свету эта активность больше, чем в темноте. Однако введение этого же оксида в среду культивирования Penicillium chrysogenum полностью блокировало активность данного фермента в случае с указанным грибом.

 

Рис. 3. Активность внеклеточной каталазы в культуральной жидкости Aspergillus niger (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Рис. 4. Активность внеклеточной каталазы в культуральной жидкости Penicillium chrysogenum (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Рис. 5. Активность внеклеточной пероксидазы в культуральной жидкости Aspergillus niger (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Рис. 6. Активность внеклеточной пероксидазы в культуральной жидкости Penicillium chrysogenum (К) и при внесении в нее субмикронных частиц оксидов металлов WO₃ (1), RbTe_1.5W_0.5O₆ (2), CsTeMoO₆ (3) в условиях воздействия света (C) и в условиях темноты (Т).

 

Также было обнаружено, что при введении WO₃ активность каталазы снижалась у обоих видов грибов только под действием света, тогда как в условиях темноты она практически не изменялась. Соединение RbTe_1.5W_0.5O₆ не оказывало никакого воздействия на активность экзокаталазы Aspergillus niger как в условиях действия света, так и в темноте. В то же время активность данного фермента у Penicillium chrysogenum при введении данного оксида повышалась в темноте и не изменялась при действии света.

На рис. 5 и 6 продемонстрировано влияние субмикронных частиц оксидов металлов на активность экзопероксидазы Aspergillus niger и Penicillium chrysogenum.

Показано, что соединение CsTeMoO₆, как и в случае экзокаталазы, увеличивало активность экзопероксидазы Aspergillus niger. Обнаружено, что активность экзопероксидазы Penicillium chrysogenum также существенно увеличивалась, хотя в случае экзокаталазы наблюдался ингибирующий эффект. Отмечено, что под воздействием света активность экзопероксидазы обоих видов увеличивалась в большей степени по сравнению с темновыми условиями.

Соединения WO₃ и RbTe_1.5W_0.5O₆ так же изменяли активность данного энзима у Aspergillus niger и Penicillium chrysogenum, но в меньшей степени.

Неоднозначность действия исследуемых материалов на содержание пероксида водорода в среде культивирования может быть связана как с различным химическим строением оксидов металлов, так и с физиолого-биохимическими особенностями исследуемых культур микромицетов. Следует также заметить, что изменение активности экзоферментов может быть связано с рядом причин: действием соединений на структуру и активный центр исследуемых ферментов, воздействием оксидов тяжелых металлов на механизмы синтеза фермента в клетках грибов de novo, транспортом эндооксидоредуктаз из клетки в среду культивирования. Детальное выяснение конкретных механизмов требует дополнительных исследований.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что исследуемые соединения WO₃, RbTe_1.5W_0.5O₆ и CsTeMoO₆ в разной степени способны снижать содержание пероксида водорода в среде культивирования как в условиях действия света, так и в темноте для обоих штаммов грибов. Превалирующий эффект снижения содержания пероксида водорода в среде культивирования в условиях воздействия света по сравнению с темнотой наблюдался только в случае WO₃ для P. chrysogenum. Достоверное снижение активности экзокаталазы наблюдалось под действием WO₃ для обоих грибов и под действием CsTeMoO₆ у P. chrysogenum. Было отмечено, что внесение в среду культивирования исследуемых препаратов в большинстве случаев вызывало увеличение активности экстрацеллюлярной пероксидазы у обоих видов грибов.

Возможность использования данных соединений в качестве средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, вызываемых микромицетами, основанная на ингибировании экзометаболитов, участвующих в процессе биодеструкции, на наш взгляд, требует дифференцированного подхода.

В основе этого подхода должны лежать знания о возможных механизмах процесса биодеградации того или иного материала (роль конкретных экзометаболитов грибов, участвующих в начальных стадиях биоразрушения). Следует обратить внимание, что факт увеличения активности грибных экзооксидоредуктаз под воздействием оксидов тяжелых металлов может быть использован в биотехнологических процессах, связанных с наличием высокой активности исследуемых энзимов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (базовая часть Госзадания, проект FSWR-2023-0024) с использованием оборудования ЦКП “Новые материалы и ресурсосберегающие технологии” (ННГУ им. Н.И. Лобачевского).

About the authors

N. А. Anikina

Lobachevsky Nizhegorod State University

Author for correspondence.
Email: undinaf@gmail.com
Russian Federation, Nizhny Novgorod

R. V. Baryshkov

Lobachevsky Nizhegorod State University

Email: romanbariskov1000@mail.ru
Russian Federation, Nizhny Novgorod

A. Yu. Shishkin

Lobachevsky Nizhegorod State University

Email: uandshi@yandex.ru
Russian Federation, Nizhny Novgorod

O. N. Smirnova

Lobachevsky Nizhegorod State University

Email: protectfun@mail.ru
Russian Federation, Nizhny Novgorod

V. F. Smirnov

Lobachevsky Nizhegorod State University

Email: biodeg@mail.ru
Russian Federation, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files