Получение композита наноалмаз-лизоцим-мирамистин и перспективы его использования в протезах сердечного клапана

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Ксеногенные биологические протезы клапанов сердца близки по гемодинамическим свойствам с клапаном человека, а также, в отличие от механических протезов, не требуют применения длительной антикоагулянтной терапии. Поэтому они широко применяются в хирургии [1–4]. Для изготовления таких протезов используют перикард крупного скота (бычий, лошадиный или свиной), который представляет собой богатую коллагеном соединительную ткань [5]. Поэтому в качестве одного из объектов данного исследования была использована коллагеновая матрица бычьего перикарда.

Для улучшения механических свойств материала могут быть использованы наноалмазосодержащие покрытия [6]. Показано, что наноалмазы не ухудшают состояние крови [7, 8]. Функционально развитая поверхность наноалмазов детонационного синтеза позволяет наносить на их поверхность различные лекарственные средства [9–13], в том числе антибиотики, что критически важно в первое время после операции по пересадке сердечного клапана [10, 14–16]. Показана антимикробная активность карбоксилированных наноалмазов в водной суспензии в отношении Escherichia coli [17], которая может быть усилена использованием антибиотиков. Сильным антимикробным средством является бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммонийхлорид, известный под коммерческим названием Мирамистин^® (структурная формула приведена на рис. 1) [18, 19]. Однако при адсорбции на наноалмазах антисептические свойства мирамистина теряются [20]. Для сохранения антимикробных свойств мирамистина в составе комплекса с наноалмазами предложено провести предварительную модификацию поверхности наноалмазов биополимерами, чтобы изменить центры взаимодействия мирамистина с поверхностью при адсорбции. Одним из возможных биополимеров может быть белок лизоцим, который обладает собственной антимикробной активностью, а также способен образовывать комплексы с мирамистином. Показано, что образование композита лизоцим–мирамистин приводит к усилению бактериолитической активности лизоцима [21].

 

Рис. 1. Структурная формула мирамистина.

 

В данной работе были получены и охарактеризованы комплексы наноалмаз–лизоцим–мирамистин. С помощью меченного тритием мирамистина исследована его адсорбция на композитах наноалмаз–лизоцим. Из комплексов наноалмаз–лизоцим–мирамистин были получены покрытия коллагеновой матрицы бычьего перикарда и исследована антимикробная активность полученных покрытий по отношению к основному возбудителю заболеваний в постоперационный период – золотистому стафилококку (Staphylococcus aureus).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали наноалмазы детонационного синтеза, произведенные компанией PlasmaChem (Германия) и поставляемые в форме порошка марка PL-D-G01 (DND), а также наноалмазы, поставляемые в форме водной суспензии 10 масс.% (SDND). При проведении адсорбционных экспериментов суспензию разбавляли до концентрации 5 мг/мл, а из порошка готовили суспензию (5 мг/мл) диспергированием порошка в воде с помощью ультразвуковой ванны Град.

Наноалмазы были охарактеризованы с помощью ИК-спектрометрии в диапазоне 4000–1100 см^-1, удельную поверхность определяли с помощью анализа изотерм адсорбции/десорбции азота. Для этих экспериментов суспензию наноалмазов высушивали.

Мирамистин^® (Инфамед, Россия) и лизоцим куриного яйца (MP Biomedicals, США) использовали без проведения дополнительной очистки.

Коллагеновые матрицы перикарда биопротезного клапана сердца, стабилизированные 0.625% раствором глутарового альдегида и обработанные 1% раствором додецилсульфата натрия [22] в виде пластин, были предоставлены ЦССХ им. А. Н. Бакулева.

Для приготовления суспензий и растворов использовали воду, очищенную с помощью системы Milli-Q.

Меченные тритием наноалмазы и мирамистин получали с помощью метода термической активации трития [23, 24].

Определение адсорбции мирамистина на поверхности наноалмазов. К водной суспензии наноалмазов, содержащей 1 мг твердой фазы, добавляли раствор меченного тритием мирамистина с концентрацией от 0.02 до 2 мМ, удельная радиоактивность мирамистина менялась от 1.4 до 0.014 ТБк/моль. Суспензии инкубировали при 25°C в течение 2 суток, затем суспензии центрифугировали в течение 10 мин при 12100×g, отбирали раствор над осадком и измеряли его радиоактивность с помощью метода жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Рассчитывали значения равновесной концентрации (С) и адсорбции (Γ) по уравнениям (1) и (2) соответственно.

$C=\frac{I}{\epsilon \times V_1\times {а}_{уд}}$, (1)

$Г=\frac{\left(C_0-C\right)\times V}{m}$, (2)

где I – скорость счета, ε – эффективность регистрации β-излучения трития, V₁ – объем аликвоты раствора над осадком наноалмазов, а_уд – удельная радиоактивность мирамистина, С₀ – начальная концентрация мирамистина, V – объем суспензии, m – масса наноалмазов.

Для определения количества мирамистина (Г₁), связанного с наноалмазами, осадок декантировали, промывали водой, добавляли сцинтилляционную жидкость и проводили измерение радиоактивности.

${Г}_1=\frac{I_1}{\epsilon \times {а}_{уд}\times m}$, (3)

где I₁ – регистрируемая скорость счета, величины ε, а_уд и m – описаны в уравнениях (1) и (2).

При исследовании адсорбции мирамистина на модифицированных лизоцимом наноалмазах к суспензии наномалмазов с концентрацией 1 мг/мл добавляли лизоцим до конечной концентрации 4.7 мг/мл. Суспензии инкубировали при 25°C в течение 48 ч, затем центрифугировали при 12100×g, осадок декантировали, промывали водой. Полученные наноалмазы использовали при исследовании адсорбции мирамистина по методике, описанной выше.

Измерение ферментативной активности лизоцима. Определение ферментативной активности лизоцима на поверхности наноалмазов по отношению к грамположительным бактериальным клеткам Micrococcus luteus проводили с использованием турбидиметрического метода. Для построения калибровочной зависимости активности лизоцима от его содержания готовили серию растворов лизоцима с концентрациями от 0.05 до 0.25 мг/мл. Навеску лиофилизированных клеток M. luteus (Sigma, США) массой 4.9 ± 0.2 мг растворяли в 1 мл воды. Для определения оптической плотности исследуемых растворов использовали спектрофотометр UV-5100 (Hitachi, Япония), оптическое поглощение регистрировали при 650 нм. Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 1 мл. В кювету вносили 950 мкл воды и 30 мкл суспензии клеток и регистрировали оптическое поглощение в течение 5 мин, а затем добавляли 20 мкл раствора лизоцима. Получали калибровочную кривую зависимости изменения оптической плотности от количества лизоцима, которую использовали для расчета количества фермента на поверхности наноалмазов при их модифицировании лизоцимом.

Изучение распределения наноалмазов и комплексов наноалмаз–лизоцим in vivo. Эксперимент проводили на мышах–самках линии BALB/c (25–30 г) из питомника Столбовая (Московская область, Россия). Животных содержали в индивидуально-вентилируемых клетках Т2 при искусственном освещении с 12-часовым режимом, со свободным доступом к полнорационному корму (ООО “Лабораторкорм”, Россия) и воде. Все исследования биораспределения проводились в одних и тех же экспериментальных условиях с тремя животными на группу. Каждой мыши вводили через хвостовую вену водную суспензию наноалмазов или комплекса наноалмаз–лизоцим в дозе по наноалмазам 5 мг/кг массы тела и радиоактивности наноалмазов 740 кБк. Через 30 мин выполняли эвтаназию гильотинированием, кровь отбирали в пробирки, содержащие K₃EDTA. Далее немедленно проводили аутопсию с изъятием органов целиком: сердце, легкие, печень, селезенка, почки, головной мозг, тимус, яичники, хвостовая вена. Органы растворяли в Solvable liquid (PerkinElmer) по методике, рекомендованной производителем. После полного растворения органа аликвоту раствора вносили в сцинтилляционную жидкость UltimaGold scintillation cocktail (PerkinElmer) и измеряли радиоактивность с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра.

Получение покрытий наноалмаз–лизоцим–мирамистин на поверхности коллагеновых матриц. Получали комплекс наноалмаз–лизоцим–мирамистин согласно методике, описанной выше. При определении количества наноалмазов на поверхности матриц использовали меченные тритием наноалмазы. После получения комплексов готовили их суспензии с конечной концентрацией наноалмазов 1 мг/мл и помещали в них коллагеновые матрицы. Матрицы в суспензиях выдерживали сутки, далее помещали в физиологический раствор. После их высушивали до постоянной массы (m_м), растворяли в азотной кислоте при кипячении. Охлаждали в морозильной камере при –20°C в течение 20 мин, разбавляли водой, переносили в пробирки типа Eppendorf, центрифугировали 15 мин при 12100×g и проводили измерение скорости счета осадка (I_осадок) и раствора над осадком (I_{раствор}).

Количество наноалмазов на поверхности биоткани (Г_ND) определяли по уравнению (4)

,${Г}_{ND}=\frac{I_{осадок}+I_{раствор}}{\epsilon \times {а}_{уд}\times m_{м}}$, (4)

где а_уд – удельная радиоактивность наноалмазов, ε – эффективность регистрации.

Для характеристики полученных покрытий методами сканирующей электронной микроскопии и определения антимикробных свойств покрытий использовали нерадиоактивные компоненты.

Определение антимикробной активности покрытий. Оценку адгезии бактерий к модифицированным и контрольным образцам коллагеновых матриц перикарда проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11737-1–2000 [25]. В качестве тест-культур были выбраны клинические штаммы бактерий Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), вызывающие осложнения после проведения операции по замене клапана. Все подготовительные работы и исследования проводили в стерильных условиях при температуре окружающей среды: 20–22°C.

Из суточных культур готовили суспензии по Мак–Фарланду с концентрацией 10⁶ клеток/мл. Исследуемые образцы коллагеновых матриц с нанесенным наноалмазосодержащим покрытием погружали в подготовленные суспензии культур и инкубировали в термостате при 37°C в течение 4 ч. По окончании экспозиции образцы извлекали и отмывали с целью удаления излишков суспензии и неадгезированных клеток культур, отмывали стерильным 0.9% NaCl и высушивали на стерильной фильтровальной бумаге. Далее делали отпечатки с опытных и контрольных образцов, последовательно прикладывая гладкую и ворсинчатую стороны коллагеновых пластин к поверхности питательной среды Хинтона–Мюллера с последующим растиранием досуха полученных отпечатков.

После проведенной аппликации каждую пластину растирали в 1 мл стерильного физиологического раствора со стерильной стеклянной крошкой. Полученные гомогенаты по 0.5 мл без разведения и с 10-кратным разведением помещали на плотную питательную среду Хинтона–Мюллера и растирали досуха стерильным шпателем. Посевы опытных и контрольных образцов на среде Хинтона–Мюллера инкубировали в термостате в течение суток при температуре 37°C. По окончании инкубации подсчитывали количество колоний жизнеспособных клеток тест-микроорганизмов на исследуемых и контрольных образцах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика и анализ комплексов наноалмаз–лизоцим. В данной работе проведено детальное исследование комплекса наноалмаз–лизоцим и наноалмаз–лизоцим–мирамистин. В работе использовали наноалмазы, по функциональному составу идентичные тем, которые использовались ранее [26] (рис. 2). Удельная поверхность, определенная с помощью анализа изотерм адсорбции/десорбции азота и рассчитанная по методу БЭТ, составила 250 и 390 м²/г. Используемые в данной работе наноалмазы также отличаются зарядом поверхности: в водной суспензии значение электрокинетического потенциала DND составило +21 ± 2 мВ, а SDND –41 ± 5 мВ. Адсорбция лизоцима на поверхности наноалмазов привела к увеличению электрокинетического потенциала положительно заряженных DND, который составил +39 ± 1 мВ. В случае отрицательно заряженного SDND произошло изменение заряда поверхности и электрокинетический потенциал составил +26 ± 3 мВ.

 

Рис. 2. ИК-спектр наноалмазов до и после модификации лизоцимом (а) DND, PlasmaChem и (б) SDND, PlasmaChem.

 

Расшифровку ИК-спектров проводили согласно работе [27]. В ИК-спектрах присутствует широкая полоса при 3400 см^-1, обусловленная наличием поверхностных гидроксильных групп и адсорбированной воды. Сигнал в области 2900 см^-1 указывает на С_sp3Н-связи. Полоса в области 1630 см^-1 связана с адсорбированной на поверхности водой. Сигналы 1723 см^-1 обусловлены растяжением связи С=О карбонильных групп, а в области 1790 см^-1 – растяжение С=О связей карбоксильных групп и ангидридов. Сдвиг полосы 1776 см^-1 в область 1782 см^-1 (рис. 2б) свидетельствует об участии во взаимодействии лизоцим–наноалмаз карбоксильных групп на поверхности наноалмазов. Полосы в области 1450 см^-1 обусловлены асимметрическими изгибами СН_х-групп. Сигналы в области 1320–1370 см^-1 обусловлены симметричным растяжением С=О связей. Полоса 1254 см^-1 обусловлена изгибом С-О связей. Полосы 1117–1120 см^-1 и 1063 см^-1 получаются из-за асимметрических изгибов связей С-О-С и растяжений связи С-О. Интенсивность второго сигнала усиливается при адсорбции лизоцима на алмазе.

В образцах, модифицированных лизоцимом, появляются полосы в области 1660 и 1525 см^-1, соответствующие областям амид I и амид II соответственно.

Известно, что при адсорбции на наноалмазах как на положительных, так и на отрицательных, происходит изменение структуры белка [28]. Как следует из ИК-спектров, количество лизоцима на поверхности SDND больше, по сравнению с DND, что согласуется с данными работы [26], в которой с помощью меченного тритием лизоцима показали, что адсорбция лизоцима на наноалмазах с положительным ζ-потенциалом достигает 320 ± 30 мг/г, а на отрицательных – 2060 ± 100 мг/г. ИК-спектры, полученные для положительных и отрицательных наноалмазов Aldrich [26], полностью совпадают с результатами этой работы. Поэтому для лизоцима, адсорбированного на наноалмазах PlasmaChem, мы также можем предположить конформационные изменения в петлях белка.

Поскольку данные комплексы предполагается использовать для получения антимикробных покрытий клапанных протезов, то актуален вопрос о сохранении антибактериальной активности лизоцима после его адсорбции на поверхности наноалмазов. По этому вопросу в литературе имеются достаточно противоречивые данные: с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния и сканирующей электронной микроскопии показано сохранение активности лизоцима по отношению к E. coli после связывания с наноалмазами [29, 30]. Однако с помощью специального набора для анализа на основе флуоресценции (EnzChek Lysozyme Assay Kit) показано уменьшение активности лизоцима после его адсорбции на наноалмазах, причем обнаружена зависимость активности от размеров наноалмазов – снижение на 80–85% для частиц 5 и 50 нм и на 30–40% для крупных частиц [31]. В нашей работе для определения ферментативной активности использовался турбодиметрический метод, который хорошо зарекомендовал себя при определении активности лизоцима в объеме раствора [32–34]. С помощью турбодиметрического метода определили количество лизоцима на поверхности наноалмазов по его ферментативной активности. Показано, что на отрицательно заряженных наноалмазах количество активного лизоцима составляет 150 ± 60 мг/г, а на положительно заряженных – 170 ± 80 мг/г. Как отмечалось выше, количество лизоцима на отрицательных наноалмазах больше, чем на положительных, а по активности количества практически одинаковые. Таким образом, активность фермента наблюдается только в поверхностном слое. Усиление антибактериальных свойств лизоцима может быть достигнуто при образовании комплекса с катионными поверхностно-активными веществами, например, мирамистином [21].

Зависимости адсорбции мирамистина на наноалмазах, модифицированных лизоцимом, от его равновесной концентрации приведены на рис. 3.

Адсорбция мирамистина на исходных наноалмазах приводила к изменению седиментационной устойчивости водных суспензий: в случае DND электрокинетический потенциал оставался положительным и возрастал от +20 до +40 мВ; в случае SDND (ζ-потенциал немодифицированных наноалмазов –30 мВ) при адсорбции около 100 мкмоль/г значение электрокинетического потенциала приближалось к нулю, что объясняется полной компенсацией заряда поверхности наноалмаза. С ростом поверхностной концентрации мирамистина происходила смена заряда на положительный и при адсорбции свыше 120 мкмоль/г наблюдалось образование устойчивых суспензий, электрокинетический потенциал которых составлял +25 мВ.

Для наноалмазов, предварительно модифицированных лизоцимом, найдено, что адсорбция мирамистина (в области плато на изотерме) на комплексе наноалмаз–лизоцим приводит к сильному снижению электрокинетического потенциала для SDND–лизоцим от 26 ± 3 до 5 ± 3 мВ. Для комплекса DND–лизоцим уменьшение электрокинетического потенциала было не столь сильным: от 39 ± 1 до 34 ± 2 мВ.

Для сравнения результатов по адсорбции мирамистина на разных типах наноалмазов зависимости адсорбции мирамистина от его равновесной концентрации описали уравнением, аналогичным уравнению адсорбции Ленгмюра.

${Г}_1={Г}_{\max }\frac{КС}{1+КС}$, (5)

где Г_max – значение максимальной адсорбции, K – константа, аналогичная константе адсорбционного равновесия в уравнении Ленгмюра.

Аппроксимация полученных зависимостей, показанная на рис. 3 пунктирными линиями, получена с помощью подбора параметров методом наименьших квадратов. Рассчитанные параметры и коэффициенты корреляции приведены в табл. 1.

 

Рис. 3. Зависимость адсорбции мирамистина от его равновесной концентрации в суспензии на наноалмазах DND (а) и SDND (б). ○ – исходные наноалмазы; ● – наноалмазы с адсорбированным лизоцимом.

 

Таблица 1. Параметры уравнения (5) для адсорбции мирамистина на разных типах наноалмазов

Параметр уравнения адсорбции	Тип наноалмазов
	DND	DND–лизоцим	SDND	SDND–лизоцим
Гмах, моль/г	4.3×10–6	8.0×10–6	2.1×10–4	4.5×10–5
K, л/ммоль	2.6×103	2.6×103	2.6×103	2.6×103
R (α=0.05; n=3)	0.951	0.954	0.875	0.958

 

Показано, что предварительное модифицирование поверхности наноалмазов DND лизоцимом повышает адсорбцию мирамистина, в то время как на модифицированных лизоцимом SDND адсорбция мирамистина снижается по сравнению с немодифицированным SDND. Однако адсорбция мирамистина на SDND даже после нанесения лизоцима все равно выше, чем на DND.

Поскольку образование комплексов мирамистин–лизоцим в объеме раствора приводит к увеличению ферментативной активности лизоцима [20], в данной работе проверили изменение активности, когда фермент находится на поверхности наноалмазов с помощью турбодиметрического метода. Измерение проводили для максимальной поверхностной концентрации мирамистина (табл. 2). Полученный комплекс наноалмаз–лизоцим–мирамистин был использован для получения покрытия коллагеновой матрицы бычьего перикарда.

 

Таблица 2. Состав наноалмазного покрытия коллагеновой матрицы

Состав слоя на поверхности матрицы	Наноалмазы
	SDND	DND
мг наноалмаза/ г матрицы	4.2 ± 2.0	1.6 ± 0.5
мг лизоцима*/ г матрицы	0.017 ± 0.010	0.48 ± 0.07
моль мирамистина/ г матрицы	(1.9±0.4) × 10–7	(1.3±0.3) × 10–8

* Приведено содержание активного фермента.

 

Количественный состав покрытия (табл. 2) был определен с помощью меченых соединений (наноалмаз, мирамистин) и бактериолитической активности (лизоцим).

При сравнении результатов с ранее полученными данными [35] было отмечено, что присутствие слоя лизоцим–мирамистин снижает количество DND (положительные наноалмазы) на поверхности матрицы по сравнению с немодифицированным наноалмазом; напротив, адсорбция SDND (отрицательные наноалмазы) на поверхности наноалмазов возрастает.

Матрицы с нанесенным наноалмазным слоем были проанализированы с помощью сканирующей электронной микроскопии (рис. 4), которая выявила образование крупных агрегатов на обеих сторонах коллагеновой ткани. Показано, частицы алмаза покрывают обе стороны коллагеновой матрицы, причем покрытие DND оказалось более равномерным по сравнению с SDND, о чем также свидетельствует большой доверительный интервал при определении количества по радиоактивности (табл. 2).

 

Рис. 4. СЭМ-изображения наноалмазсодержащих покрытий коллагеновой ткани бычьего перикарда: (а, в) – ворсистая сторона, (б, г) – гладкая сторона. (а, б) – DND, (в, г) – SDND.

 

Антимикробную активность полученных покрытий проверяли по отношению к Staphylococcus aureus – самому распространенному возбудителю инфекций в постоперационном периоде. Антимикробную активность характеризовали по двум параметрам: “адгезия” – инкубирование тест-объектов в суспензиях клеток в течение 4 ч и “выживаемость” – бактерии, выжившие на исследуемых коллагеновых матрицах за 24 ч.

На рис. 5 приведены изображения образцов с бактериями золотистого стафилококка Staphylococcus aureus после антибактериального теста.

 

Рис. 5. Изображения образцов с бактериями Staphylococcus aureus после антибактериального теста. Слева показан контрольный образец – матрица без покрытия. 1 – SDND, 2 – SDND–лизоцим–мирамистин, 3 – DND, 4 – DND–лизоцим–мирамистин.

 

Результаты измерения представлены в табл. 3. Показано, что при использовании комплекса наноалмаз–лизоцим–мирамистин бактерии адгезировались на коллагеновую матрицу на 2–4 порядка меньше, чем на контрольный образец без покрытия. Количество выживших бактерий также снизилось на 1–2 порядка. Необходимо отметить, что мирамистин при адсорбции на наноалмазы теряет токсичность по отношению к различным возбудителям [21]. Причина того, что комплекс наноалмаз–мирамистин нетоксичен, вероятно, связана с особенностью адсорбции катионных ПАВ на наноалмазах: адсорбция происходит за счет электростатического притяжения положительно заряженной группы четвертичного аммониевого основания и отрицательно заряженных центров на поверхности наноалмазов [36]. Дополнительное модифицирование поверхности наноалмазов лизоцимом привело к изменению ориентации молекулы мирамистина на поверхности, что позволяет ему проявлять антисептические свойства.

 

Таблица 3. Антимикробная активность покрытий коллагеновой матрицы бычьего перикарда

Образец покрытия	Параметр антимикробности, lg KOE
	Адгезия*	Выживаемость**
матрица без покрытия	5.0	5.0
SDND	4.1	2.4
SDND–мирамистин	4.2	2.7
SDND–LSZ–мирамистин	3.1	1.5
DND	3.9	2.0
DND–мирамистин	4.4	2.5
DND–LSZ-мирамистин	2.7	1.7

* Наименее значимое различие (α=0.05) LSD=0.8.

** Наименее значимое различие (α=0.05) LSD=0.7.

 

Известно, что покрытия бычьего перикарда наноалмазами практически не подвергаются разрушению длительное время в организме животного в условиях максимально приближенных к применению [35]. Тем не менее необходимо определить судьбу наноалмазов, если они будут высвобождаться из покрытия и попадать в кровоток. Для проверки вопроса о миграции наночастиц по организму в случае разрушения покрытия был проведен анализ распределения комплекса наноалмаз–лизоцим в организме мыши при внутривенном введении, обеспечивающем максимальную биодоступность материала. Вводили суспензии положительно и отрицательно заряженных [³H] наноалмазов, а также их адсорбционные комплексы с лизоцимом, распределение наночастиц в органах мышей показано на рис. 6.

 

Рис. 6. Процент введенной дозы на грамм ткани через 30 мин после внутривенного введения положительно (+) и отрицательно (–) заряженных наноалмазов и комплексов наноалмазы–лизоцим.

 

Большая часть наноалмазов и комплекса наноалмаз–лизоцим остается в хвостовой вене. Значительное количество наноалмазов как исходного, так и модифицированного было обнаружено в печени и селезенке. Модифицирование поверхности наноалмаза лизоцимом приводит к снижению концентрирования “положительного” наноалмаза в хвостовой вене, однако такого эффекта не было в случае “отрицательного” образца. Некоторое количество наноалмазов и их комплексов с лизоцимом обнаружено в печени, селезенке и в меньшем количестве в легких и почках. Было обнаружено меньшее количество отрицательно заряженных наноалмазов во всех тканях, в том числе наблюдалось снижение в 3.5 раза для легких и печени, а для селезенки уменьшение концентрации наночастиц в случае отрицательного наноалмаза было в 11 раз. Модифицирование лизоцимом влияло только на концентрирование исходного наноалмаза в месте введения, как отмечалось выше, и не влияло на концентрирование в других тканях. Таким образом, показано, что лизоцим может быть использован как модифицирующий агент поверхности наноалмазов для снижения их агрегирования в месте введения и подавления адсорбции компонентов биологических жидкостей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе получены комплексы наноалмазов с лизоцимом и мирамистином. Показано, что в комплексах наноалмаз–лизоцим бактериолитическая активность сохраняется в поверхностном слое, но может быть усилена при адсорбции мирамистина. При анализе распределения комплексов наноалмаз–лизоцим в организме животного найдено, что модифицирование наноалмазов лизоцимом влияет только на его концентрирование в месте введения и не сказывается на концентрировании в других тканях. Более того, обнаружено снижение концентрации наночастиц в случае отрицательно заряженного материала.

Показано, что предварительное модифицирование поверхности наноалмазов лизоцимом существенно влияет на адсорбцию мирамистина: для DND адсорбция возрастает, для SDND снижается. Изотермы адсорбции описаны уравнением, аналогичным уравнению Ленгмюра. Установлено, что адсорбция мирамистина (в области плато на изотерме) на комплексе наноалмаз–лизоцим приводит к сильному снижению электрокинетического потенциала для SDND–лизоцим от 26 ± 3 до 5 ± 3 мВ, что свидетельствует от его низкой агрегационной устойчивости в суспензии и, как следствие, лучшему удерживанию на поверхности коллагеновой матрицы. Для комплекса DND–лизоцим уменьшение электрокинетического потенциала было не столь сильным: от 39 ± 1 до 34 ± 2 мВ. Полученные комплексы наноалмаз–лизоцим–мирамистин обладают антимикробной активностью. При введении этих комплексов в состав коллагеновых матриц в 100–10 000 раз уменьшается адгезия бактерий золотистого стафилококка Staphylococcus aureus и 10–100 раз падает выживаемость этих бактерий.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант 22–23–00019).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с мышами проводили согласно Приложению A “Руководство по уходу за лабораторными животными и их использованию” Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (СЕД 123). Протокол исследования был одобрен Локальным этическим комитетом НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова (№ 14 от 30 октября 2018 г).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

М. Чернышева

МГУ имени М. В. Ломоносова

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: chernyshevamg@my.msu.ru

Химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 10

Г. Бадун

МГУ имени М. В. Ломоносова

Email: chernyshevamg@my.msu.ru

Химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 10

А. Попов

МГУ имени М. В. Ломоносова

Email: chernyshevamg@my.msu.ru

Химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 10

И. Чащин

ФГБУ НМИЦ ССХ им. А. Н. Бакулева Минздрава России; ИНЭОС РАН

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Ресей, 121552, Москва, Рублевское ш., д. 135; 119334 , Москва, ул. Вавилова, д. 28, стр. 1

Н. Анучина

ФГБУ НМИЦ ССХ им. А. Н. Бакулева Минздрава России

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Ресей, 121552, Москва, Рублевское ш., д. 135

А. Панченко

ФГБУ “НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова” Минздрава России

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Ресей, 197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар