Особенности формирования повышенной холодоустойчивости пшеницы под влиянием наночастиц золота

全文:

Сокращения: ЗНЧ – золотые наночастицы, НЧ – наночастицы, ФСА – фотосинтетический аппарат.

ВВЕДЕНИЕ¹

Исследование физиолого-биохимических и молекулярно-генетических механизмов адаптации высших растений к абиотическим факторам среды является одной из центральных задач современной биологии. Яровая пшеница – одна из важнейших сельскохозяйственных культур, повсеместно возделываемая на территории России и широко востребованная во всем мире. Возрастание климатической нестабильности наряду с усилением техногенной нагрузки на природную среду обусловливают необходимость поиска новых подходов к повышению устойчивости пшеницы к абиотическим факторам, прежде всего, к низкой температуре. Перспективным направлением является использование наночастиц (НЧ) металлов, которые в низких концентрациях обладают способностью позитивно влиять на метаболизм и стрессоустойчивость растений. Благодаря малым размерам (менее 100 нм), высокой подвижности, реакционной и адсорбционной способности, а также уникальным оптическим резонансным свойствам НЧ проникают через клеточные барьеры, распространяются по растительному организму, влияя практически на все процессы в нем [1]. На сегодняшний день НЧ находят все большее применение в биологии, медицине и сельском хозяйстве как регуляторы роста и развития растений, компоненты лекарственных препаратов, вещества с гербицидной/пестицидной активностью и наноудобрения [2].

Особое место среди металлических НЧ занимают золотые наночастицы (ЗНЧ). С одной стороны, ЗНЧ быстро и легко синтезируются из недорогих химических реактивов [3, 4]. С другой стороны, ЗНЧ, как правило, нетоксичны для растений, животных и людей при использовании в микродозах до 100 мкг/мл [5]. Анализ литературных источников демонстрирует, что эффекты ЗНЧ на растения носят преимущественно позитивный характер [3, 4]. Повышение интенсивности ростовых процессов под влиянием ЗНЧ наблюдали на целом ряде растительных объектов [6–11]. Под воздействием ЗНЧ отмечено усиление интенсивности фотосинтеза и изменения параметров флюоресценции хлорофилла [11, 12], содержания фотосинтетических пигментов [6, 10, 11] и ультраструктуры хлоропластов [10, 13]. Наличие уникальных оптических свойств, связанных с возбуждением локализованных плазмонных резонансов при взаимодействии со светом, обусловливает мировой научный интерес к применению ЗНЧ в медицине, биологии и сельском хозяйстве в качестве фотопротекторов, снижающих риски развития окислительного стресса [3, 5].

В последние годы возрос интерес к ЗНЧ как к адаптогенам, способным повышать стрессоустойчивость. В отношении растений такого рода исследования немногочисленны, а механизмы эффектов ЗНЧ на метаболизм и устойчивость растений остаются не совсем ясными. Показано на ячмене и резуховидке, что ЗНЧ, проникая в растения через корни, изменяли экспрессию генов DGR1 и DGR2, кодирующих белки клеточной стенки [14], а также ее химический состав и жесткость, способствуя повышению стрессоустойчивости [15]. Корневая обработка растений риса нанокомпозитами, содержащими ЗНЧ, снижала токсический эффект ионов Cd, препятствуя их абсорбции клетками корней и нивелируя риски развития окислительного стресса [16, 17]. В условиях засоления ЗНЧ, нанесенные на листья пшеницы, поддерживали ионный баланс, модулировали образование NO как сигнальной молекулы и регулятора многих процессов в организме, повышали активность антиоксидантных ферментов [18]. Исследования в отношении влияния ЗНЧ на устойчивость растений к низким температурам фрагментарны, однако перспективы дальнейшего использования ЗНЧ в этом направлении вполне очевидны.

Цель работы – изучить влияние ЗНЧ на холодоустойчивость яровой пшеницы и ряд физиолого-биохимических и молекулярно-генетических показателей, свидетельствующих о ее формировании, таких как интенсивность ростовых процессов, активность фотосинтетического аппарата (ФСА), интенсивность темного дыхания, содержание в листьях растворимых сахаров и уровень экспрессии некоторых фотосинтетических и COR генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Схема эксперимента. Экспериментальная работа проводилась по следующей схеме (рис. 1). В качестве способа обработки растений растворами ЗНЧ мы выбрали нанопрайминг (замачивание семян) в течение 24 ч. Нанопрайминг считается простой, эффективной, рентабельной и экологически безопасной стратегией работы с НЧ [2]. Основываясь на литературных данных о том, что ЗНЧ в концентрациях до 50 мкг/мл чаще всего оказывают стимулирующий эффект на растительный организм [5, 14], мы использовали растворы с концентрациями ЗНЧ от 5 до 50 мкг/мл. После процедуры нанопрайминга семена проращивали в контролируемых условиях до достижения проростками возраста 10 сут. Затем часть растений из каждой группы отбирали и закаливали при температуре 4°С в течение 7 сут. Холодоустойчивость незакаленных и закаленных растений оценивали методом прямого промораживания. Основные физиолого-биохимические и молекулярно-генетические механизмы влияния ЗНЧ на растения пшеницы изучали, используя вариант с концентрацией ЗНЧ, показавший максимальный стимулирующий эффект на устойчивость к промораживанию.

 

Рис. 1. Схема эксперимента. ЗНЧ – золотые наночастицы.

 

Синтез ЗНЧ. Золотые наносферы получены цитратным методом [4] в реакции восстановления золотохлористоводородной кислоты (Sigma-Aldrich, США) цитратом натрия (Fluka, Швейцария). Восстановление проводили путем нагревания 250 мл 0.01% водного раствора золотохлористоводородной кислоты в колбе Эрленмейера на магнитной мешалке с обратным водяным холодильником до 100°С и последующего добавления 7.75 мл 1% водного раствора цитрата натрия. Кипячение продолжали в течение 30 мин до образования золя красного цвета. Свежеприготовленные растворы разливали в стерильные стеклянные флаконы с плотно закрывающимися крышками и хранили при температуре 4°С.

Полученные ЗНЧ были охарактеризованы методами трансмиссионной электронной микроскопии, спектрофотометрии и динамического светорассеяния [19]. По данным измерений, средний диаметр ЗНЧ составил 15.3 нм, число НЧ в 1 мл – 1.6 × 10¹². Максимальная концентрация золота в растворе составила 57 мкг/мл. В опытах использовали растворы с концентрациями ЗНЧ 5, 10, 20 и 50 мкг/мл, полученные путем разбавления исходного раствора дистиллированной водой непосредственно перед применением. В качестве контрольного варианта использовали растения, выращенные из семян, обработанных дистиллированной водой (концентрация ЗНЧ 0 мкг/мл).

Растительный материал и условия выращивания. Прайминг семян яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Злата (Федеральный исследовательский центр “Немчиновка”, Россия) проводили в растворах ЗНЧ в течение 24 ч. Далее семена (400 шт./вариант) проращивали на дистиллированной воде при 22°С, относительной влажности воздуха 60–70%, освещенности 100 мкмоль/(м² с) и 16-часовом фотопериоде.

Низкотемпературное закаливание растений. Через 10 сут. половину растений из каждого варианта закаливали в климатической камере KBW-240 (Binder, Германия) при температуре 4°С в течение 7 сут, сохраняя прочие условия неизменными.

Устойчивость к низким температурам. Устойчивость закаленных и незакаленных растений пшеницы к низкой температуре оценивали методом прямого промораживания. Из каждого варианта опыта брали по 30 растений и последовательно промораживали их в бумажных конвертах при температурах –3 и –5°С в течение 24 ч в климатической камере MIR-153 (Sanyo, Япония). Затем растения в течение 24 ч выдерживали при температуре 4°С в темноте, после чего переносили в обычные условия (22°С, дневной свет) на 72 ч. Об устойчивости к низким температурам судили по количеству неповрежденных проростков в процентах от общего числа промороженных растений.

Содержание золота. Определение содержания золота в семенах, корнях и листьях 10-дневных проростков пшеницы проводили на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Agilent (Agilent Technologies, США) и масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Bruker 820-MS ICP-MS (Bruker, Германия).

Ростовые параметры. Длину первого листа у проростков измеряли на 10 и 17 сутки выращивания, т.е. до и после низкотемпературного закаливания.

Интенсивность СО₂ газообмена. Скорость видимой ассимиляции СО₂ и темного дыхания у растений пшеницы определяли при 22 и 4°С, используя установку открытого типа с инфракрасным газоанализатором URAS 2T (Hartmann & Braun, Германия), и выражали в мг СО₂/г сухой массы в ч.

Содержание фотосинтетических пигментов. Концентрацию хлорофилла a (Хл a), хлорофилла b (Хл b) и каротиноидов (Кар) в листьях определяли с помощью спектрофотометра Genesys 10 UV (Termo Electron Corporation, США) при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения пигментов в 80% растворе ацетона – 663, 646 и 470 нм соответственно [20]. Содержание пигментов выражали в мг/г сухой массы листьев.

Долю хлорофиллов в светособирающем комплексе (ССК) рассчитывали по формуле: ССК (%) = (Хл b + 1.2 × Хл b)/(Хл а + Хл b) × 100, исходя из того, что весь Хл b находится в ССК, а соотношение Хл а/Хл b в нем равно 1.2.

Содержание сухого вещества в листьях. Интенсивность накопления сухой биомассы листьев высчитывали в процентах от сырого веса после высушивания образцов в термостате при температуре 100–105°С до постоянного веса.

Содержание растворимых сахаров. Для оценки содержания глюкозы в листьях использовали набор Глюкоза-Ольвекс (ООО “Ольвекс диагностикум”, Россия). Содержание сахарозы и фруктозы в листьях определяли методом Рое [21]. Содержание сахаров выражали в мг/г сухой массы листьев.

Выделение РНК и проведение ПЦР-РВ (qRT-PCR). Тотальную РНК выделяли из навески листьев (50 мг), используя набор Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich, США) с модификацией стадии гомогенизации. Качество и количество очищенной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) и анализировали электрофоретически в 2% агарозном геле. Для удаления остаточных примесей геномной ДНК препараты тотальной РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США). Для синтеза кДНК использовали наборы для обратной транскрипции RevertAid (Thermo Fisher Scientific, США), в том числе с входящими в состав праймерами оligo (dT) 21 для генов ядерного кодирования и random 6 для генов хлоропластного кодирования [22].

ПЦР-РВ (RT-qPCR) проводили на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США), используя интеркалирующий краситель SYBR Green I (ЗАО “Евроген”, Россия). Реакционная смесь для количественной ПЦР в объеме 25 мкл содержала 5 мкл qPCRmix HS SYBR (ЗАО “Евроген”, Россия), 0.2 мкмоль каждого праймера и 15 нг матрицы кДНК. Использовали следующие условия амплификации: 95°C – 5 мин, далее 40 циклов: 95°C – 15 с, 60°C – 30 с и 72°C– 30 с.

Для амплификации целевых (Wcor726, Wcor15) и референсного (TaRP15) генов были подобраны праймеры с использованием онлайн-ресурсов Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) и OligoAnalyzer™ Tool (https://eu.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer). Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации целевых генов малой (rbcS) и большой (rbcL) субъединиц РБФК/О и референсного гена TaAct7 (актин) были заимствованы из публикаций [23, 24]. Используемые праймеры представлены в таблице S1 (Дополнительные материалы).

Уровни экспрессии мРНК генов-мишеней нормализовали по отношению к гену TaAct7 и TaRP15 (RNA polymerase I, II, III; 15 кД). Результаты амплификации обрабатывали методом Pfaffl [25].

Статистический анализ. Все эксперименты проводили в 3–6 биологических и 3–4 аналитических повторностях. В таблицах и на графиках представлены среднеарифметические значения и их стандартные ошибки. Статистическую значимость различий между средними значениями оценивали с помощью ANOVA (применяли критерий Тьюки), встроенного в графический математический пакет Microcal Origin. В статье обсуждаются только величины, статистически значимые при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние ЗНЧ на холодоустойчивость

На первом этапе исследования была проведена оценка влияния различных концентраций ЗНЧ (5–50 мкг/мл) на холодоустойчивость к низкой температуре незакаленных и закаленных (4°С, 7 сут) проростков пшеницы. Для этого применили метод прямого промораживания, основанный на определении выживаемости растений после тестирующего действия низких температур (–3 и –5°С) в течение 24 ч.

Установлено, что нанопрайминг семян увеличивал холодоустойчивость как незакаленных, так и закаленных проростков пшеницы (табл. 1). У незакаленных растений ЗНЧ в концентрациях 5 и 10 мкг/мл вызывали 2–3-кратное увеличение холодоустойчивости после промораживания при температуре –3°С. При этом максимальный положительный эффект на холодоустойчивость отмечен при использовании ЗНЧ в концентрации 10 мкг/мл (рис. 2а, б). Cнижение температуры промораживания до –5°С вызывало гибель незакаленных растений независимо от варианта опыта.

 

Таблица 1. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на холодоустойчивость незакаленных и закаленных (4°С, 7 сут.) проростков пшеницы после промораживания, %

Концентрация ЗНЧ (мкг/мл)	Температура промораживания
	–3°С	–5°С
Незакаленные проростки
0	15 ± 3	0
5	30 ± 5*	0
10	50 ± 5*	0
20	10 ± 3	0
50	10 ± 3	0
Закаленные проростки
0	60 ± 3	7 ± 3
5	90 ± 3*	50 ± 3*
10	97 ± 3*	67 ± 3*
20	90 ± 3*	50 ± 3*
50	90 ± 3*	50 ± 3*

Примечание. Устойчивость пшеницы к низкой температуре определяли по выживаемости (%) после промораживания при температуре –3 и –5°С в течение 24 ч. * – статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

Рис. 2. Незакаленные проростки пшеницы после промораживания при температуре –3°С в течение 24 ч: а – контроль, б – проростки, обработанные ЗНЧ в концентрации 10 мкг/мл.

 

Низкотемпературное закаливание приводило к увеличению холодоустойчивости пшеницы. Так, если выживаемость незакаленных растений после промораживания при температуре –3°С составляла 15%, то после закаливания она увеличивалась в 4 раза (табл. 1). При этом обработка ЗНЧ во всех использованных концентрациях вызывала у растений дополнительный (на 30–40%) прирост холодоустойчивости. Важно отметить, что в отличие от незакаленных растений, у проростков пшеницы, подвергнутых низкотемпературному закаливанию, эффект ЗНЧ сохранялся при снижении температуры до –5°С и был максимальным для концентрации ЗНЧ 10 мкг/мл (рис. 3а, б).

 

Рис. 3. Закаленные (4°С, 7 сут.) проростки пшеницы после промораживания при –5°С в течение 24 ч: а – контроль, б – проростки, обработанные ЗНЧ в концентрации 10 мкг/мл.

 

Поскольку концентрация ЗНЧ 10 мкг/мл оказывала максимальный эффект на холодоустойчивость как незакаленных, так и закаленных растений пшеницы, именно эта концентрация была отобрана для дальнейшего изучения физиолого-биохимических и молекулярно-генетических показателей, важных для формирования повышенной устойчивости растений к низкой температуре.

Содержание золота

Следующим этапом исследования было определение содержания золота в семенах (после нанопрайминга), а также в корнях и листьях 10-дневных растений пшеницы, выращенных из семян, обработанных ЗНЧ (10 мкг/мл). Данные о содержании золота в семенах и органах растений представлены в таблице 2. Установлено, что наибольшее количество золота содержали семена; более того, оно было обнаружено в корнях и даже (в следовых количествах) в листьях растений, выращенных из обработанных ЗНЧ семян (табл. 2).

 

Таблица 2. Содержание золота в семенах, корнях и листьях пшеницы после нанопрайминга золотыми наночастицами

Объект	Золото, мг/кг сухой массы
Семена	3.9 ± 0.2
Корни	1.6 ± 0.1
Листья	0.28 ± 0.01

 

Влияние ЗНЧ на ростовые параметры

Одним из важнейших интегральных показателей, отражающих состояние растительного организма в условиях длительного действия низкой температуры, является рост. Проведенные опыты показали, что в варианте с обработкой ЗНЧ (10 мкг/мл) наблюдалось увеличение длины первого листа у незакаленных проростков пшеницы (рис. 4а). В условиях низкотемпературного закаливания рост листьев практически полностью прекращался, причем как у проростков, выращенных из необработанных семян, так и у тех, семена которых были обработаны ЗНЧ (рис. 4б).

 

Рис. 4. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на ростовые параметры (а, б), интенсивность видимого фотосинтеза (в, г) и темнового дыхания (д, е) пшеницы до (а, в, д) и после (б, г, е) низкотемпературного закаливания (4°С, 7 сут). * – Статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

Влияние ЗНЧ на интенсивность CO₂ газообмена

Важным этапом исследования было определение эффектов ЗНЧ на интенсивность CO₂-газообмена у пшеницы. Установлено, что обработка ЗНЧ существенно увеличивала интенсивность видимой ассимиляции CO₂ незакаленных проростков (рис. 4в). В условиях низкотемпературного закаливания интенсивность видимой ассимиляции CO₂ снижалась почти в 2 раза, но достоверных различий по этому показателю между контрольными и обработанными ЗНЧ растениями не обнаружено (рис. 4г). Следует отметить, что в варианте с обработкой ЗНЧ в условиях закаливания интенсивность видимой ассимиляции CO₂ была немного выше, чем в контрольном варианте. Достоверных эффектов ЗНЧ на интенсивность темнового дыхания не обнаружено, но она снижалось в период закаливания в обоих вариантах опыта (у обработанных и необработанных ЗНЧ проростков) почти в 3 раза (рис. 4д, е).

Влияние ЗНЧ на содержание фотосинтетических пигментов

Под влиянием ЗНЧ в контрольных условиях существенно увеличивалось содержание хлорофиллов в листьях пшеницы (табл. 3), при этом содержание каротиноидов и доля хлорофиллов в ССК не изменялись. У закаленных проростков пшеницы содержание хлорофиллов было меньше, при этом достоверных изменений между вариантами в содержании фотосинтетических пигментов не обнаружено (табл. 3).

 

Таблица 3. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на содержание фотосинтетических пигментов в листьях пшеницы до и после низкотемпературного закаливания (4°С, 7 сут)

Показатели	Концентрация ЗНЧ (мкг/мл)
	0	10
Незакаленные проростки
Хл a + b, мг/г сухой массы	14.6 ± 0.1	15.7 ± 0.2*
Каротиноиды, мг/г сухой массы	2.2 ± 0.1	2.5 ± 0.1
Хлорофилл в ССК, %	53 ± 1	50 ± 1
Закаленные проростки
Хл a + b, мг/г сухой массы	11.2 ± 0.3	11.3 ± 0.3
Каротиноиды, мг/г сухой массы	2.2 ± 0.1	2.1 ± 0.1
Хлорофилл в ССК, %	48 ± 1	47 ± 1

Примечание. * – Статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

Влияние ЗНЧ на накопление сухого вещества и сахаров

Исследования показали, что нанопрайминг семян ЗНЧ не влиял на накопление сухой биомассы побегов пшеницы (табл. 4). Кроме того, в их листьях содержание моносахаров (глюкоза, фруктоза) было ниже, а накопление сахарозы – выше, чем в контрольном (без нанопрайминга) варианте (табл. 4). По суммарному содержанию этих сахаров обработанные ЗНЧ растения не отличались от контрольных.

 

Таблица 4. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на сухую биомассу побегов и содержание сахаров в листьях пшеницы до и после низкотемпературного закаливания (4°С, 7 сут.)

Показатели	Концентрация ЗНЧ (мкг/мл)
	0	10
Незакаленные проростки
Сухой вес побегов	13.2 ± 0.2	13.3 ± 0.2
Глюкоза (мг/г сухой массы)	49.9 ± 1.2	38.9 ± 1.5*
Фруктоза (мг/г сухой массы)	5.2 ± 0.5	3.8 ± 0.6*
Сахароза (мг/г сухой массы)	4.4 ± 0.2	7.6 ± 0.2*
Закаленные проростки
Сухой вес побегов	17.8 ± 0.3	19.1 ± 0.4*
Глюкоза (мг/г сухой массы)	37.1 ± 1.2	33.3 ± 1.3
Фруктоза (мг/г сухой массы)	8.0 ± 0.5	10.9 ± 0.6*
Сахароза (мг/г сухой массы)	14.1 ± 0.2	24.5 ± 0.2*

Примечание. * – Статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

После низкотемпературного закаливания содержание сухого вещества в листьях пшеницы возрастало на треть, а обработка ЗНЧ дополнительно стимулировала этот процесс (табл. 4). При этом под влиянием ЗНЧ наблюдали усиленное накопление закаленными растениями фруктозы и сахарозы.

Влияние ЗНЧ на уровень экспрессии генов ФСА

Мы проанализировали влияние ЗНЧ на уровень экспрессии генов ФСА – rbcS и rbcL, кодирующих, соответственно, малую и большую субъединицы РБФК/О. Установлено, что у растений, обработанных ЗНЧ, был увеличен уровень экспрессии rbcS и rbcL (по сравнению с растениями, необработанными ЗНЧ) в контрольных условиях (рис. 5а, б). Достоверных эффектов ЗНЧ на уровень экспрессии этих генов в условиях низкотемпературного закаливания не обнаружено (рис. 5в, г).

 

Рис. 5. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на экспрессию генов rbcS и rbcL в листьях пшеницы до (а, в) и после (б, г) низкотемпературного закаливания (4°С, 7 сут.). * – Статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

Влияние ЗНЧ на уровень экспрессии COR генов

Нами проведена оценка влияния ЗНЧ на уровень экспрессии COR генов – Wcor726 и Wcor15, кодирующих защитные белки, играющие важную роль в формировании повышенной холодоустойчивости. Показано, что в листьях незакаленных растений уровень экспрессии гена Wcor15 под влиянием ЗНЧ повышался в 8 раз (рис. 6в), тогда как уровень экспрессия гена Wcor726 не изменялся (рис. 6а). В условиях низкотемпературного закаливания обработка ЗНЧ не влияла на уровень экспрессии изученных генов (рис. 6б, г).

 

Рис. 6. Влияние золотых наночастиц (ЗНЧ) на экспрессию Wcor726 и Wcor15 генов в листьях пшеницы до (а, в) и после (б, г) низкотемпературного закаливания (4°С, 7 сут.). * – Статистически значимые при P < 0.05 отличия обработанных ЗНЧ растений от варианта 0 (необработанные растения).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение механизмов стрессоустойчивости важных сельскохозяйственных культур, как и поиск инновационных подходов к проблеме ее повышения, относятся к наиболее актуальным проблемам современной биологии. Яровая пшеница – холодостойкая культура, способная выдерживать непродолжительное действие отрицательных околонулевых температур. Более того, в процессе низкотемпературного закаливания многие сорта пшеницы могут развивать комплекс адаптивных реакций и механизмов, позволяющих им переносить более низкие отрицательные температуры. Поэтому при изучении эффектов ЗНЧ на холодоустойчивость пшеницы важно рассматривать их влияние как в контрольных условиях (на незакаленных растениях), так и после низкотемпературного закаливания. Более того, большое значение имеют такие факторы как способ внесения НЧ в растительный организм и используемая концентрация НЧ.

Известно, что НЧ могут поступать в растения через корни, листья или семена. Предполагают, что в корневую систему НЧ попадают вместе с поглощаемой водой через боковые корни и корневые волоски. Основным способом проникновения НЧ в листья считают устьица [2]. Видимо, благодаря своей амфифильности, НЧ “просачиваются” через липофильный кутикулярный слой или разрушают восковый слой кутикулы и проникают в лист. Оказавшись внутри растения, НЧ могут перемещаться по ксилеме и флоэме, а также накапливаться в клетках [2]. В наших опытах был использован метод нанопрайминга – семена пшеницы замачивали в растворах ЗНЧ различных концентраций. Этот способ обработки НЧ широко применяется в экспериментах с растениями и считается наиболее рентабельным и безопасным [26]. При нанопрайминге НЧ проникают внутрь семян пассивно с молекулами воды и через разрушенные участки семенной оболочки. Механизм дальнейшей “работы” НЧ в растительном организме не совсем ясен. В ряде исследований установлено, что ЗНЧ не просто адсорбируются в семенных оболочках, но и перемещаются в проростки и распространяются по тканям, проникая в клетки. Например, методами флуоресцентной микроскопии и оптической эмиссионной спектроскопии показано, что ЗНЧ содержались не только в семенах, но и в листьях проростков, выращенных из семян, обработанных ЗНЧ [10, 27]. В наших опытах методами атомно-эмиссионной и масс-спектроскопии золото также было обнаружено не только в семенах, но и в корнях, а также (в следовых количествах) в листьях растений пшеницы, выращенных из обработанных ЗНЧ семян (табл. 2). Важно отметить, что эти растения не только отличались от контрольных (необработанных) по ряду физиолого-биохимических и молекулярно-генетических показателей, но и развивали повышенную устойчивость к низким температурам (табл. 2). В результате проведенных нами концентрационных тестов с применением ЗНЧ установлено, что максимальный эффект на холодоустойчивость растений достигался при использовании очень низкой концентрации – 10 мкг/мл. Поэтому в последующих экспериментах по изучению механизмов стресспротекторного влияния ЗНЧ на растения пшеницы была использована именно эта концентрация.

Наши исследования показали, что растения пшеницы, выращенные в оптимальных условиях из семян, обработанных ЗНЧ, отличались от контрольных повышенной интенсивностью роста и активностью ФСА, более высоким содержанием хлорофиллов в листьях, а также повышенным уровнем экспрессии генов, кодирующих большую и малую субъединицы РБФК/О (рис. 4, 5; табл. 3). Схожие результаты по стимулирующему влиянию низких концентраций ЗНЧ на рост растений были получены на кукурузе, резуховидке и горчице [6–8, 10]. Стимулирующее действие НЧ на ростовые процессы связывают с их способностью улучшать поглощение воды и питательных элементов, предположительно, за счет активации генов, регулирующих работу аквапоринов, и генов, ответственных за клеточный цикл [28]. Показано, что под влиянием ЗНЧ изменялся химический состав клеточной стенки в корнях ячменя, в частности, увеличивалось количество белков-галактанов, вследствие чего возрастала жесткость клеточной стенки, а следовательно, стрессоустойчивость растений [14, 15]. Кроме того, ЗНЧ влияли на гены DGR1 и DGR2, кодирующие белки клеточной стенки, участвующие в удлинении корней [14]. Показано влияние ЗНЧ на дифференцировку клеток через микроРНК – малые некодирующие РНК, контролирующие, в том числе, рост растения и его стрессовый ответ [7].

В ряде исследований отмечено увеличение интенсивности фотосинтеза и содержания хлорофиллов под влиянием ЗНЧ [6, 10, 11]. Установлено, что другие НЧ также изменяют интенсивность синтеза фотосинтетических пигментов и активность ФСА посредством регуляции экспрессии генов, задействованных в его работе. Например, НЧ оксида цинка повышали экспрессию генов, кодирующих структурные единицы фотосистем (PSAD2, PSAE2, PSAK) и генов синтеза фотосинтетических пигментов (CAO, CHLG, GGPS6, PSY, PDS, ZDS) [29]. НЧ оксида кремния усиливали экспрессию генов PsbH, PsbB и PsbD, кодирующих белки сборки ФС II [23]. НЧ оксида титана усиливали экспрессию генов, участвующих в синтезе РБФК/О [30].

Наши исследования показали, что в условиях низкотемпературного закаливания ЗНЧ вызывали дополнительный прирост холодоустойчивости проростков пшеницы (табл. 1). Однако эффекты ЗНЧ на ростовые процессы и активность ФСА практически полностью нивелировались действием низкой закаливающей температуры. При этом процесс повышения холодоустойчивости сопровождался существенным (более чем на 70%) увеличением содержания сахарозы (табл. 4). Известно, что накопление растворимых сахаров – важнейшая неспецифическая реакция растений на многие абиотические стрессоры, необходимая для их выживания, в том числе в условиях длительного действия низкой температуры [31]. С одной стороны, сахара выполняют функции осмолитиков и криопротекторов, защищая растения от обезвоживания, а с другой, стабилизируют мембраны и действуют как антиоксиданты [32]. Кроме того, сахара являются резервными веществами, и их накопление необходимо для энергоемкого процесса низкотемпературной адаптации [33].

Мы изучили влияние ЗНЧ на экспрессию двух важных COR генов – Wcor726 и Wcor15. Известно, что ген Wcor726 относится к семейству Wcs120, специфичному для пшеницы [34, 35]. Гены семейства Wcs120 регулируются низкой температурой и кодируют синтез белков WCS (wheat cold stress), накопление которых коррелирует со способностью растений повышать холодоустойчивость [34]. Белки, кодируемые Wcor726, относятся к дегидринам, объединенным во II группу или семейство D 11 большого класса LEA (Late Embryogenesis Abundant) белков, участвующих в защите растений от обезвоживания при действии различных стрессовых факторов [36]. Белки, кодируемые Wcor15, относятся к III группе белков LEA, транспортируются в хлоропласты [37, 38] и содержат CRT/DRE cis-регуляторные элементы, сходные с Wcs120 [39]. Имеются данные, что белок WCOR15 – продукт гена Wcor15 – локализуется в хлоропластах и снижает риски фотоингибирования ФС II [40]. Как установлено в наших опытах, у незакаленных проростков пшеницы, выращенных из семян, обработанных ЗНЧ, уровень экспрессии Wcor15 увеличивался в 8 раз (рис. 6).

Проведенные эксперименты показали, что эффекты ЗНЧ на растения пшеницы зависели от температурных условий опыта. В оптимальных температурных условиях нанопрайминг семян приводил к стимуляции ростовых процессов у проростков, повышению активности ФСА (за счет усиления экспрессии генов РБФК/О rbcS и rbcL и увеличения содержания хлорофиллов) и уровня экспрессии COR гена Wcor15. В условиях низкотемпературного закаливания ЗНЧ способствовали дополнительному накоплению в листьях растворимых сахаров и, как следствие, существенному повышению холодоустойчивости растений пшеницы. Следовательно, ЗНЧ способны “перепрограммировать” растительный организм, изменяя метаболизм растений и экспрессию генов стрессового ответа, что приводит к существенному увеличению стрессоустойчивости растений. Для детального понимания механизмов действия ЗНЧ на растения необходимы дальнейшие исследования, однако уже сейчас можно утверждать, что ЗНЧ могут быть использованы в биологии и сельском хозяйстве как адаптогены, усиливающие стрессоустойчивость.

Авторы выражают благодарность Дыкману Льву Абрамовичу – д.б.н., ведущему научному сотруднику Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленного структурного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук” – за помощь в синтезе и анализе золотых наносфер, использованных в данном исследовании.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00054 (https://rscf.ru/project/23-26-00054/).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: 10.31857/S0015330324030081

作者简介

Ю. Венжик

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

编辑信件的主要联系方式.
Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

А. Дерябин

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

К. Жукова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

А. Соколов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

В. Попов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

И. Мошков

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Email: jul.venzhik@gmail.com
俄罗斯联邦, Москва

参考

补充文件