Быстрый метод оценки in vitro гиперчувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови

Цель работы. Применение в клинике методов оценки гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови, может быть усовершенствовано путем применения для определения гистамина современной автоматизированной методики обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемным масс-спектрометром (ОФ-ВЭЖХ-МС/МС). Целью данного исследования являлась оценка возможности определения in vitro гиперчувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови с использованием ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Материалы и методы. Принцип метода: гепаринизированная цельная кровь после замещения плазмы PIPES буфером инкубируется при 37 °С с различными концентрациями тестируемых субстанций (аллергены, лекарственно-диагностические препараты, химические вещества, пищевые продукты и др.), которые подозреваются как вызывающие реакции гиперчувствительности. Высвобождение гистамина происходит в основном из базофильных лейкоцитов в зависимости от их чувствительности к стимулирующим субстанциям (аллергенам и др.). Высвободившийся гистамин после центрифугирования образца крови по завершении инкубации напрямую определяется в супернатанте с использованием технологии ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Гепаринизированную цельную кровь (8 мл) получали от пациентов с сенсибилизацией к клещам домашней пыли D. pteronyssinus (D1), пыльце березы (T3) персику (F95), подтвержденной аллергологическим анамнезом, кожными пробами и/или наличием аллерген-специфического IgE в сыворотке. После замены плазмы на PIPES буфер аликвоты «восстановленной» крови помещали по 300-450 мкл в отдельные пробирки (макрометод) или по 150-200 мкл в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном (микрометод), где уже находились различные концентрации (разведения) гистамина (стандарт для калибровки), анти-IgE антител, аллергенных экстрактов D1, T3, F95, включая их химически модифицированные формы sD1 и sF95. Через час инкубации при 37 °С пробирки или планшеты центрифугировали и в супернатантах напрямую определяли содержание гистамина путем ОФ-ВЭЖХ-МС/МС. Результаты. Показано, что уровни гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови больного с сенсибилизацией к D. pteronyssinus в ответ на стимуляцию немодифицированным экстрактом D1, значительно выше тех, которые наблюдаются при стимуляции модифицированным sD1, что свидетельствует о блокаде В-клеточных эпитопов в процессе модификации аллергенов экстракта D1. Данный метод определения гистамина может быть полезен не только для выявления гиперчувствительности к конкретному аллергену, но также и для оценки аллергенности модифицированных аллергенов (аллергоидов). Также показано значительное (на 60%) снижение уровня высвобождения гистамина из лейкоцитов крови больного с сенсибилизацией к пыльце березы после аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) по сравнению с уровнем гистамина до АСИТ, что позволяет рассматривать данный метод как удобный тест in vitro для мониторинга и оценки эффективности АСИТ. Изучено высвобождение гистамина из лейкоцитов цельной крови больного с сенсибилизацией к аллергенам персика, подтвержденной аллергологическим анамнезом и наличием сывороточного аллерген-специфического IgE. Показано, что инкубация цельной крови этого пациента с экстрактом персика (F95) стимулирует высвобождение гистамина, сравнимое с таковым при стимуляции анти-IgE антителами, что также коррелирует с уровнем аллерген-специфического сывороточного IgE. Кроме того, инкубация лейкоцитов крови этого пациента с модифицированным экстрактом sF95 индуцирует высвобождение гистамина в значительно меньшей степени, что свидетельствует о существенном снижении аллергенности модифицированного sF95. Данная методология выявления повышенной чувствительности по высвобождению гистамина из лейкоцитов цельной крови может быть применима для диагностики пищевой аллергии с использованием лабораторно приготовленных аллергенных экстрактов. Заключение. Быстрота и простота исполнения метода оценки гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов цельной крови, а также малые количества крови для анализа делают этот подход, использующий для определения гистамина технологию ОФ-ВЭЖХ-МС/МС, полезным не только для научных исследований (определение аллергенности модифицированных аллергенов, пептидов и др.), но и для практического применения при оценке степени сенсибилизации пациентов к аллергенам (включая тех, кто получал медикаментозное антиаллергическое лечение или АСИТ), при анализе патофизиологического ответа организма на лекарства, химические соединения и другие субстанции, подозрительные в отношении побочных эффектов.

гистамин, цельная кровь, обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, в сочетании с тандемным масс-спектрометром