Оптимизация условий трансформации Saccharomyces cerevisiae для повышения разрешающей способности скрининга белок-синтезирующих библиотек в дрожжевой двугибридной системе

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Метод анализа белок-белковых взаимодействий с помощью дрожжевой двугибридной системы в клетках Saccharomyces cerevisiae используют для поиска корегуляторов белков. С помощью этого метода также проводят массовые скрининги библиотек клонированных фрагментов комплементарной ДНК (кДНК), которые транслируются в клетке. Ключевым фактором успешности такого скрининга становится уровень эффективности трансформации дрожжевых клеток, так как на этом основывается разрешающая способность анализа.

Цель — провести поиск оптимальных параметров химической трансформации дрожжевых клеток для повышения разрешающей способности скрининга библиотек кДНК.

Материалы и методы. Для трансформации штамма дрожжей S. cerevisiae pJ69-4A химическим способом использовали плазмиды pDEST22 и pDEST32. Для скрининга применяли библиотеку кДНК, полученную на основе мРНК, выделенной из корней гороха Pisum sativum сорта Finale, инокулированных ризобией.

Результаты. Выявлены факторы, влияющие на эффективность трансформации. Среди них молекулярная масса используемого для трансформации полиэтиленгликоля, а также количество циклов деления клеток, которые претерпевает культура. Показано влияние количества и размера плазмид, используемых при трансформации. С помощью оптимизированного протокола успешно проведен скрининг библиотеки кДНК для поиска корегуляторов транскрипционного фактора NIN.

Заключение. На основе полученных данных определены оптимальные параметры, позволяющие добиться высокого уровня компетентности дрожжевых клеток. Применение описанного протокола позволило успешно провести скрининг библиотеки для выявления корегуляторов транскрипционного фактора NIN.

Об авторах

Алина Михайловна Дымо

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Email: dymoalina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5919-2487
ResearcherId: AAF-3244-2021
Россия, Санкт-Петербург

Елизавета Степановна Канцурова

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Email: rudaya.s.e@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3081-9880
SPIN-код: 4752-1910
Россия, Санкт-Петербург

Александра Вячеславовна Долгих

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Email: sqshadol@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1845-9701
SPIN-код: 2602-1514
Scopus Author ID: 5719038282
ResearcherId: ABC-2930-2020
Россия, Санкт-Петербург

Елена Анатольевна Долгих

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: dol2helen@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-5375-0943
SPIN-код: 4453-2060
Scopus Author ID: 6603496335
ResearcherId: G-6363-2017

д-р биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Berggård T., Linse S., James P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions // Proteomics. 2007. Vol. 7, N 16. P. 2833–2842. doi: 10.1002/pmic.200700131
  2. Zhou M., Li Q., Wang R. Current experimental methods for characterizing protein–protein interactions // ChemMedChem. 2016. Vol. 11, N 8. P. 738–756. doi: 10.1002/cmdc.201500495
  3. Cuéllar A.P., Pauwels L., De Clercq R., Goossens A. Yeast two-hybrid analysis of jasmonate signaling proteins. В кн.: Jasmonate signaling. Methods in molecular biology. Vol. 1011 / A. Goossens, L. Pauwels, editors. Totowa, NJ: Humana Press. P. 173–185. doi: 10.1007/978-1-62703-414-2_14
  4. Caufield J.H., Sakhawalkar N., Uetz P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems // Methods. 2012. Vol. 58, N 4. P. 317–324. doi: 10.1016/j.ymeth.2012.12.001
  5. Yang F., Lei Y., Zhou M., et al. Development and application of a recombination-based library versus library high-throughput yeast two-hybrid (RLL-Y2H) screening system // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46, N 3. P. e17–e17. doi: 10.1093/nar/gkx1173
  6. Erffelinck M.-L., Ribeiro B., Perassolo M., et al. A user-friendly platform for yeast two-hybrid library screening using next generation sequencing // PLOS ONE. 2018. Vol. 13, N 12. ID e0201270. doi: 10.1371/journal.pone.0201270
  7. Elmore J.M., Velásquez-Zapata V., Wise R.P. Next-generation yeast two-hybrid screening to discover protein–protein interactions. В кн.: Protein-protein interactions. Methods in molecular biology. Vol. 2690 / S. Mukhtar, editor. New York: Springer US, 2023. P. 205–222. doi: 10.1007/978-1-0716-3327-4_19
  8. Kawai S., Hashimoto W., Murata K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: Methods and possible underlying mechanism // Bioeng Bugs. 2010. Vol. 1, N 6. P. 395–403. doi: 10.4161/bbug.1.6.13257
  9. Chen P., Liu H.-H., Cui R., et al. Visualized investigation of yeast transformation induced with Li+ and polyethylene glycol // Talanta. 2008. Vol. 77, N 1. P. 262–268. doi: 10.1016/j.talanta.2008.06.018
  10. Yamakawa M., Hishinuma F., Gunge N. Intact cell transformation of Saccharomyces cerevisiae by polyethylene glycol // Agric Biol Chem. 1985. Vol. 49, N 3. P. 869–871. doi: 10.1080/00021369.1985.10866817
  11. Gietz R.D., Schiestl R.H., Willems A.R., Woods R.A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure // Yeast. 1995. Vol. 11, N 4. P. 355–360. doi: 10.1002/yea.320110408
  12. Schiestl R.H., Gietz R.D. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier // Curr Genet. 1989. Vol. 16, N 5–6. P. 339–346. doi: 10.1007/BF00340712
  13. Pham T.A., Kawai S., Murata K. Visualization of the synergistic effect of lithium acetate and single-stranded carrier DNA on Saccharomyces cerevisiae transformation // Curr Genet. 2011. Vol. 57, N 4. P. 233–239. doi: 10.1007/s00294-011-0341-7
  14. Hayama Y., Fukuda Y., Kawai S., et al. Extremely simple, rapid, and highly efficient transformation method for the yeast saccharomyces cerevisiae using glutathione and early log phase cells // J Biosci Bioeng. 2002. Vol. 94, N 2. P. 166–171. doi: 10.1263/jbb.94.166
  15. Gietz R.D., Schiestl R.H. Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method // Nat Protoc. 2007. Vol. 2, N 1. P. 35–37. doi: 10.1038/nprot.2007.14
  16. Gietz R.D., Schiestl R.H. Large-scale high-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method // Nat Protoc. 2007. Vol. 2, N 1. P. 38–41. doi: 10.1038/nprot.2007.15
  17. Gietz R.D., Schiestl R.H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method // Nat Protoc. 2007. Vol. 2, N 1. P. 31–34. doi: 10.1038/nprot.2007.13
  18. James P., Halladay J., Craig E.A. genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast // Genetics. 1996. Vol. 144, N 4. P. 1425–1436. doi: 10.1093/genetics/144.4.1425
  19. Hahn-Hägerdal B., Karhumaa K., et al. Role of cultivation media in the development of yeast strains for large scale industrial use // Microb Cell Fact. 2005. Vol. 4. P. 31. doi: 10.1186/1475-2859-4-31
  20. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nat Methods. 2012. Vol. 9, N 7. P. 671–675. doi: 10.1038/nmeth.2089
  21. Wickham H. Data analysis. В кн.: ggplot2: Use R!. Springer-Verlag: New York, 2016. doi: 10.1007/978-3-319-24277-4_9
  22. Singh M.V., Weil P.A. A method for plasmid purification directly from yeast // Anal Biochem. 2002. Vol. 307, N 1. P. 13–17. doi: 10.1016/S0003-2697(02)00018-0
  23. Kreplak J., Madoui M.-A., Cápal P., et al. A reference genome for pea provides insight into legume genome evolution // Nat Genet. 2019. Vol. 51. P. 1411–1422. doi: 10.1038/s41588-019-0480-1
  24. Camacho C., Coulouris G., et al. BLAST+: architecture and applications // BMC Bioinformatics. 2009. Vol. 10. P. 421. doi: 10.1186/1471-2105-10-421
  25. Gietz R.D., Schiestl R.H. Applications of high efficiency lithium acetate transformation of intact yeast cells using single-stranded nucleic acids as carrier // Yeast. 1991. Vol. 7, N 3. P. 253–263. doi: 10.1002/yea.320070307
  26. Долгих А.В., Долгих Е.А. Поиск регуляторов, взаимодействующих с транскрипционным фактором BELL1 и необходимых для контроля развития бобово-ризобиального симбиоза // Экологическая генетика. 2021. Т. 19, № 1. C. 37–45. EDN: OOVLSJ doi: 10.17816/ecogen51489
  27. Tripp J.D., Lilley J.L., Wood W.N., Lewis L.K. Enhancement of plasmid DNA transformation efficiencies in early stationary-phase yeast cell cultures: Enhancement of DNA transformation in yeast cells // Yeast. 2013. Vol. 30, N 5. P. 191–200. doi: 10.1002/yea.2951
  28. Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations // J Bacteriol. 1983. Vol. 153, N 1. P. 163–168. doi: 10.1128/jb.153.1.163-168.1983
  29. Klebe R.J., Harris R.J., Sharp Z.D., Douglas M.G. A general method for polyethylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast // Gene. 1983. Vol. 25, N 2–3. P. 333–341. doi: 10.1016/0378-1119(83)90238-X
  30. Németh T., Nosanchuk J.D., Vagvolgyi C., Gacser A. Enhancing the chemical transformation of Candida parapsilosis // Virulence. 2021. Vol. 12, N 1. P. 937–950. doi: 10.1080/21505594.2021.1893008
  31. Chan V., Dreolini L.F., Flintoff K.A., et al. The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli // J Exp Microbiol Immunol. 2002. Vol. 2. P. 207–223.
  32. Szostková M., Horáková D. The effect of plasmid DNA sizes and other factors on electrotransformation of Escherichia coli JM109 // Bioelectrochem Bioenerg. 1998. Vol. 47, N 2. P. 319–323. doi: 10.1016/S0302-4598(98)00203-7
  33. Bonett D.G., Price R.M. Confidence intervals for ratios of means and medians // J Educ Behav Stat. 2020. Vol. 45, N 6. P. 750–770. doi: 10.3102/1076998620934125
  34. Yu S.-C., Dawson A., Henderson A.C., et al. Nutrient supplements boost yeast transformation efficiency // Sci Rep. 2016. Vol. 6, N 1. ID 35738. doi: 10.1038/srep35738
  35. Causier B., Davies B. Analysing protein-protein interactions with the yeast two-hybrid system // Plant Mol Biol. 2002. Vol. 50, N 6. P. 855–870. doi: 10.1023/A:1021214007897

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема проведения скрининга белок-синтезирующей библиотеки в дрожжевой двугибридной системе. 1 — Клонирование пула кДНК в вектор pDEST22; 2 — трансформация дрожжевых клеток S. cerevisiae плазмидой pDEST32, содержащей кодирующую последовательность гена NIN гороха P. sativum; 3 — рассев клеток после трансформации на селективную среду без лейцина для отбора колоний, содержащих плазмиду pDEST32 c геном биосинтеза лейцина LEU2; 4 — приготовление компетентных дрожжевых клеток, содержащих плазмиду pDEST32; 5 — трансформация клеток, содержащих плазмиду pDEST32, плазмидой pDEST22, для которой селекция проводится на среде без триптофана; 6 — рассев клеток после трансформации на селективную среду без лейцина, триптофана и гистидина, а также среду с добавлением 3-аминотриазола для отбора колоний, содержащих плазмиды pDEST22 и pDEST32 и показавших возможность взаимодействия синтезируемых белков

Скачать (170KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Оценка влияния среды, используемой для выращивания дрожжевой культуры (a) и количества циклов деления, которые претерпевает культура в процессе роста, на эффективность трансформации дрожжевых клеток (b). Оценка статистической достоверности наблюдаемых различий проводилась с помощью критерия Уилкоксона (критерий Манна–Уитни) (a) и с помощью однофакторного анализа One-way ANOVA с пост-хок-тестом Тьюки (b). Разные буквы (a, b) означают статистически различающиеся значения (p < 0,05) на основе данных пост-хок-теста. Для оценки нормальности распределения данных использован критерий Шапиро–Уилка

Скачать (61KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Определение оптимального времени инкубации при повышенной температуре (a), а также влияния таких компонентов смеси для трансформации, как ПЭГ со средними молекулярными массами 3350, 4000, 6000 и 20000 (b) и балластная одноцепочечная ДНК в количестве 50, 100 и 200 мкг (c) на эффективность трансформации штамма дрожжей pJ69-4A. Для оценки статистической значимости использовали однофакторный дисперсионный анализ (One-Way ANOVA) в сочетании с пост-хок-тестом Тьюки (a, b) и однофакторный анализ Краскела–Уоллиса (с), для оценки нормальности распределения данных — критерий Шапиро–Уилка. Разные буквы (a, b) означают статистически различающиеся значения (p < 0.05) на основе данных пост-хок-теста, а двойные буквы (ab) указывают на то, что значения в этой группе статистически не отличаются от a и b, но отличаются от c

Скачать (86KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Оценка эффективности трансформации дрожжевых клеток при использовании плазмид разного размера pDEST22 (8,9 т. п. о.) и pGBT9 (5,5 т. п. о.) с геном биосинтеза триптофана TRP1. Оценка статистической значимости наблюдаемых различий проводилась с помощью Т-критерия Уилкоксона (критерий Манна–Уитни). Для оценки нормальности распределения данных использован критерий Шапиро–Уилка

Скачать (58KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Результаты ПЦР-анализа плазмид, выделенных из 10 трансформантов, несущих пустую плазмиду pDEST32 и плазмиды библиотеки на основе pDEST22 c разными вставками. В реакции ПЦР использованы праймеры, фланкирующие вставку в плазмиде pDEST22

Скачать (128KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2024


 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».