Видовая идентификация бактерий рода Clostridium, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Обоснование. Болезни, вызываемые клостридиями, широко распространены у крупного рогатого скота. В организме животных помимо патогенных  клостридий, постоянно обитают непатогенные виды и для постановки правильного диагноза необходимо дифференцировать выделенные культуры этих бактерий. Перспективным направлением для решения этой задачи является поиск высоко специфичных и чувствительных  методов генетического анализа. Основанных на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, которые дают возможность в короткие сроки выявлять и определять видовую принадлежность микроорганизмов.

Цель. Разработать  мультиплексную полимеразную цепную реакцию в реальном времени, позволяющую выявлять токсигенные виды клостридий: Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii в смешанных и чистых бактериальных культурах, определить ее чувствительность и специфичность.

Материалы и методы. В своих исследованиях использовали пробы биологического материала от больных животных, из которых выделяли культуры клостридий  на искусственных питательных средах с последующей их идентификацией  по результатам изучения культуральных и биохимических свойств. Праймеры и зонды разрабатывали с использованием инструмента PrimerQuest, затем определяли чувствительность и специфичность ПЦР с использованием референтных штаммов и изолятов бактерий.

Результаты. В период с 2023 г. по 2024 г.  исследовали 90 проб биоматериала от крупного рогатого скота, отобранных в животноводческих хозяйствах Новосибирской области. В результате бактериологических исследований было получено 44 изолята клостридий девяти видов рода Clostridium. Для осуществления подбора праймеров и зондов провели анализ, в результате которого выбрали  три пары праймеров и зондов, которые использовали для обнаружения  у  C. sporogenes гена gerKA, C. perfringens –  plc, C. sordelli –  NanS. Кроме того в работе использовали пару праймеров для выявления видов рода Clostridium по гену 16S РНК. С целью определения рабочих концентраций праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность анализа, была проведена серия исследований, которые позволили оптимизировать условия его проведения. Анализируя результаты исследований, определили чувствительность реакции, которая составила  для чистых культур бактерий видов C. sporogenes, C. perfringens и C. sordelli   не менее 102 КОЕ/мл, а для других видов Clostridia spp. 101 КОЕ/мл.

Заключение. Разработанная мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет в короткие сроки проводить диагностику клостридиозов крупного рогатого скота и видовую идентификацию возбудителей. В этиологии клостридиозов крупного рогатого скота помимо C. perfringens,  C. sporogenes, C. sordellii могут принимать участие и другие виды Clostridium spp. Необходимо совершенствовать методы диагностики клостридиозов и расширять спектр выявляемых видов клостридий.

Об авторах

Алексей Васильевич Нефедченко

СФНЦА РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: nefedchenkoav@sfsca.ru
ORCID iD: 0000-0002-4181-4268
SPIN-код: 1583-5776
Scopus Author ID: 56662231300
ResearcherId: Q-2568-2016

д.в.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии-диагностический центр ИЭВСиДВ

 

Россия, р.п. Краснообск, Новосибирская область, 630501, Российская Федерация

Татьяна Евгеньевна Судоргина

СФНЦА РАН

Email: tatjana177@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4226-5421
SPIN-код: 3697-6010
ResearcherId: LIF-9100-2024

к.в.н., старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии-диагностический центр ИЭВСиДВ

 

Россия, р.п. Краснообск, Новосибирская область, 630501, Российская Федерация

Татьяна Ивановна Глотова

СФНЦА РАН

Email: t-glotova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3538-8749
SPIN-код: 7488-5915
Scopus Author ID: 7003677877
ResearcherId: A-5596-2014

д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории биотехнологии-диагностический центр ИЭВСиДВ

 

Россия, р.п. Краснообск, Новосибирская область, 630501, Российская Федерация

Светлана Владимировна Котенева

СФНЦА РАН

Email: koteneva-sv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2649-7505
SPIN-код: 7545-7206
Scopus Author ID: 57191955208
ResearcherId: Q-7924-2016

к.в.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии-диагностический центр ИЭВСиДВ

 

Россия, р.п. Краснообск, Новосибирская область, 630501, Российская Федерация

Александр Гаврилович Глотов

СФНЦА РАН

Email: glotov_vet@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2006-0196
SPIN-код: 5020-6503
Scopus Author ID: 7004340265
ResearcherId: L-7720-2017

д.в.н., профессор, заведующий лабораторией, главный научный сотрудник лаборатории биотехнологии-диагностический центр ИЭВСиДВ

 

Россия, р.п. Краснообск, Новосибирская область, 630501, Российская Федерация

Список литературы

  1. Батаева, Д. С., Махова, А. А., Зайко, Е. В., & Cатабаева, Д. М. (2020). Ускоренная диагностика клостридий в пищевых продуктах с использованием ПЦР в реальном времени. Все о мясе, 2, 50-53. https://doi.org/10.21323/2071-2499-2020-2-50-53. EDN: https://elibrary.ru/TRLXAC
  2. Безбородова, Н. А. (2020). Современный подход к проблеме клостридиозов в животноводстве: отбор проб, лабораторная диагностика, профилактика. Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», 3(35), 392-402. https://doi.org/10.36871/vet.san.hyg.ecol.202003016. EDN: https://elibrary.ru/JHUVAH
  3. Глотова, Т. И., Судоргина, Т. И., Котенева, С. В., Глотов, А. Г., Велькер, Д. А., & Нефедченко, А. В. (2023). Патогенные виды анаэробных бактерий и их роль в патологии крупного рогатого скота. Успехи медицинской микологии, XXV, 14-19. EDN: https://elibrary.ru/NTPITW
  4. Данилюк, А. В., & Капустин, А. В. (2019). Распространенность и видовое разнообразие клостридий — возбудителей анаэробных инфекций крупного рогатого скота. Труды всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко, 81, 19-26. https://doi.org/10.30917/ATT-PRINT-2019-10(3)
  5. Колесникова, Ю. Н., Пименов, Н. В., & Капустин, А. В. (2016). Этиология анаэробных инфекций крупного рогатого скота и сравнительная характеристика выделенных штаммов клостридий. Российский журнал сельскохозяйственных и социально-экономических наук, 8, 39-48. https://doi.org/10.18551/rjoas.2016-08.07. EDN: https://elibrary.ru/WIBLWP
  6. Наумова, Н. Б., Батурина, О. А., Локтева, А. С., Плешакова, В. И., Лешева, Н. А., Лоренгель, Т. И., Золотова, Н. С., Алексеева, И. Г., & Кабилов, М. Р. (2023). Влияние декстраналя на бактериобиом кишечника телят. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(6), 197-221. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-6-956. EDN: https://elibrary.ru/UVVYIJ
  7. Нефедченко, А. В., Глотов, А. Г., Глотова, Т. И., Судоргина, Т. Е., & Котенева, С. В. (2023). Использование молекулярно-генетических методов для типирования клостридий видов C. sporogenes, C. perfringens и C. sordellii. В Сборник трудов XI Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика» (с. 354-355). Москва. EDN: https://elibrary.ru/DTRHTW
  8. Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Нефедченко, А. В., Котенева, С. В., Велькер, Д. А., & Глотов, А. Г. (2024). Частота выделения бактерий Clostridium spp. и их ассоциаций при различных формах клостридиоза крупного рогатого скота. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 54(3), 55-62. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2024-3-6. EDN: https://elibrary.ru/ZZVDGV
  9. Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Котенева, С. В., Нефедченко, А. В., & Глотов, А. Г. (2023). Современные представления о возбудителях клостридиальной анаэробной инфекции крупного рогатого скота. В Актуальные проблемы инфекционной патологии животных и пути их решения: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной Дню Белорусской науки и 95-летию кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (с. 109-111). Витебск. EDN: https://elibrary.ru/ELNBCW
  10. Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Котенева, С. В., Нефедченко, А. В., Велькер, Д. А., & Глотов, А. Г. (2023). Клостридиозы крупного рогатого скота: характеристика основных возбудителей, меры профилактики и борьбы. Часть 1. Ветеринария, 5, 3-9. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2023.26.5.03-09. EDN: https://elibrary.ru/QLUFXE
  11. Сунцова, О. В., Рар, В. А., Лисак, О. В., Мельцов, И. В., Дорощенко, Е. К., Савинова, Ю. С., Тикунов, А. Ю., & Козлова, И. В. (2023). Эпизоотическая ситуация в отношении гемопаразитарных заболеваний сельскохозяйственных животных в Иркутской области. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(4), 210-235. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-4-210-235. EDN: https://elibrary.ru/RFJMLR
  12. Abreu, C. C., Edwards, E. E., Edwards, J. F., Gibbons, P. M., Leal de Araújo, J., Rech, R. R., & Uzal, F. A. (2017). Blackleg in cattle: A case report of fetal infection and a literature review. Journal of veterinary diagnostic investigation, 29(5), 612-621. https://doi.org/10.1177/1040638717713796
  13. Abusnina, W., Shehata, M., Karem, E., Koc, Z., & Khalil, E. (2019). Clostridium sporogenes bacteremia in an immunocompetent patient. IDCases, 15, e00481. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2019.e00481
  14. Awad, M. M., Singleton, J., & Lyras, D. (2016). The Sialidase NanS Enhances Non-TcsL Mediated Cytotoxicity of Clostridium sordellii. Toxins (Basel), 8(6), 189. https://doi.org/10.3390/toxins8060189
  15. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3: The Firmicutes (2nd ed.). (2009). New York: Springer-Verlag. pp. 1309-1329. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5_2
  16. Chean, R., Kotsanas, D., Francis, M. J., Palombo, E. A., Jadhav, S. R., Awad, M. M., Lyras, D., Korman, T. M., & Jenkin, G. A. (2014). Comparing the identification of Clostridium spp. by two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry platforms to 16S rRNA PCR sequencing as a reference standard: a detailed analysis of age of culture and sample preparation. Anaerobe, 30, 85-89. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2014.09.007
  17. Goossens, E., Valgaeren, B. R., Pardon, B., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Deprez, P. R., & Van Immerseel, F. (2017). Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens-associated enteric diseases: a review on bovine necrohaemorrhagic enteritis. Veterinary research, 48(1), 9. https://doi.org/10.1186/s13567-017-0413-x. EDN: https://elibrary.ru/KMLWKY
  18. Moore, R. J., & Lacey, J. A. (2019). Genomics of the Pathogenic Clostridia. Microbiol Spectr, 7(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec
  19. Rodriguez-Palacios, A., Stämpfli, H. R., Duffield, T., Peregrine, A. S., Trotz-Williams, L. A., Arroyo, L. G., Brazier, J. S., & Weese, J. S. (2006). Clostridium difficile PCR ribotypes in calves, Canada. Emerg. Infect. Dis, 12(11), 1730-1736. https://doi.org/10.3201/eid1211.051581
  20. Seise, B., Pollok, S., Seyboldt, C., & Weber, K. (2013). Dry-reagent-based PCR as a novel tool for the rapid detection of Clostridium spp. J. Med. Microbiol, 62(Pt 10), 1588-1591. https://doi.org/10.1099/jmm.0.060061-0
  21. Silva, R. O. S., Uzal, F. A., Oliveira Jr, C. A., & Lobato, F. C. F. (2016). Clostridial Diseases of Animal. In John Wiley & Sons, Ltd. (pp. 243-254). Hoboken, NJ, USA. https://doi.org/10.1002/9781118728291.ch20
  22. Morandi, S., Cremonesi, P., Silvetti, T., Castiglioni, B., & Brasca, M. (2015). Development of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of Clostridium beijerinckii, Clostridium sporogenes and Clostridium tyrobutyricum in milk. Anaerobe, 34, 44-49. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2015.04.005
  23. Uzal, A., & Songer, J. G. (2019). Clostridial Diseases (pp. 792-806). https://doi.org/10.1002/9781119350927.ch51

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать


Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».