ИЗМЕНЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К ДОКСИЦИКЛИНУ В ПРИСУТСТВИИ ЦИНКА АСПАРТАТА И ТРИПТОФАНА

Полный текст

Введение На сегодняшний день одной из наиболее острых проблем в области медицины является повышение резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Лечение антибиотиками прочно заняло одно из ведущих мест в комплексном лечении заболеваний, основным этиологическим фактором которых являются патогенные и условно патогенные микроорганизмы. Последствием масштабного применения антибиотиков стало появление возбудителей болезней, обладающих мультирезистентностью [10]. Результаты исследований механизмов резистентности микроорганизмов все чаще указывают на микробные биопленки, как на важнейший аспект формирования устойчивости бактерий к факторам иммунной защиты, ультрафиолету, дегидрации, вирусам, а также к антибактериальным препаратам [1]. Биопленки (Biofilms) - это микробные сообщества, окруженные защитным экзополисахаридным матриксом. 97% бактерий в естественных условиях существуют в составе биопленок. По данным СDC (Centers for Diesease Control), Атланта, в 80% заболеваний бактериальной этиологии речь идет о биопленочных микробных инфекциях: тканевых и ассоциированных с медицинскими устройствами, которые с трудом поддаются лечению. Поэтому рецидивирующую бактериальную инфекцию следует рассматривать как биопленочную инфекцию - полимикробный синдром, характеризующийся значительным увеличением анаэробной нагрузки, с возможным доминирующим патогенным штаммом [3]. О широком распространении биопленок стало известно в 2000-2010 годах, в то время, как изолированные (планктонные) формы микроорганизмов были открыты в 1676 году. В результате информационного пробела большинство накопленных знаний о свойствах микроорганизмов относятся к их планктонным формам. Допустимые значения минимальных подавляющих концентраций (МПК) антибиотиков по 3-м мировым системам глобального мониторинга резистентности также определяются по отношению к изолированным формам микроорганизмов. Отсутствие данных о минимальных биопленкоподавляющих концентрациях (МБПК) в инструкциях по применению антибактериальных средств связано с тем, что для ингибирования микроорганизмов в составе биопленки по исследованиям in vitro требуются до 100 раз большие дозы антибактериальных препаратов по сравнению с их планктонными аналогами [1]. Это переводит антибиотики в неэффективные препараты для лечения биопленочных инфекций по причине токсичности. Антибиотикорезистентность устанавливается на основании МПК, которые в свою очередь являются лишь точками вероятности успеха лечения, независимо от задействованных механизмов резистентности [10]. Существование в составе биопленок является основным механизмом выживания микроорганизмов в неблагоприятных условиях. Таким образом воздействие на микроорганизмы антибиотиками, которые эффективные лишь в отношении изолированных форм, способствует распространению антибиотикорезистентности, а также хронизации и рецидивированию инфекционных процессов. Вышесказанное диктует необходимость поиска средств, усиливающих антибактериальный эффект широко используемых антибиотиков в отношении микроорганизмов в составе биопленок. В качестве средств, способных повышать активность антибиотиков в исследованиях in vitro рассматриваются биологически активные вещества (БАВ), являющихся природными соединениями и обладающих минимальной токсичностью для макроорганизма [9]. В литературе отсутствуют данные о возможном участии аминокислот в разрушении биопленки в синергизме с антибиотиками. Между тем, БАВ способны оказывать подавляющее действие на жизнедеятельность бактерий как самостоятельные вещества (антимикробные препараты), а также в качестве адъювантов при антибактериальной терапии. Данные эффекты могут заключаться в детергентном воздействии БАВ на структурные элементы капсулы и/или цитоплазматической мембраны, либо другие функциональные компоненты бактериальных клеток [8]. В настоящее время D-аминокислоты, рассматриваются как составляющие элементы бактериальной клеточной стенки, что отражает их контроль над различными формами существования микроорганизмов (планктонными и биопленочными) [7]. Бактериальный пептидогликан, важный функциональный элемент в биосинтезе стенки бактериальной клетки, содержит в себе аминокислотные составляющие (триптофан). Кроме того, экзогенные аминокислоты, такие как метионин, триптофан и фенилаланин, при включении в бактериальный пептидогликан заменяют L-аланин в положении 1 и D-аланин в положении 4 и 5 в концевом положении, что приводит к гибели бактерий [8]. Один из возможных механизмов действия аминокислот и АМП (антимикробных препаратов) на биопленки заключается в том, что аминокислоты диспергируют микробную биопленку, высвобождая сидячие клетки, тем самым обеспечивая антибиотику более эффективное проникновение и уничтожение микроорганизмов. Бактерии связаны с биопленкой через волокна целлюлозы, встроенные в пептидогликан клеточной стенки. Было обнаружено, что аминокислоты предотвращают образование биопленок у Staphylococcus aureus и Streptococcus mutans. Включение аминокислот в пептидогликан (во время его биосинтеза) нарушает связь между микроволокнами и микробными клетками [6]. Изучение бактериостатических эффектов биологически активных веществ по отношению к широкому спектру бактериальных патогенов и механизмов их реализации имеет первостепенное значение, с помощью которого можно повышать активность антибактериальной терапии. Цель исследования - оценить эффекты L- триптофана и цинка аспартата на антибактериальную активность доксициклина по отношению к клиническим штаммам S. aureus и S. haemolyticus в состоянии планктона и в составе биопленок. Методика Все эксперименты выполнялись в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 для применения в микробиологических лабораториях. Интерпретацию исследований выполняли в соответствии с клиническими рекомендациями определения чувствительности микроорганизмов (версия 2018-03), основанном на стандарте, предложенном Европейским комитетом по определению чувствительности к антибиотикам (EUCAST) EDef 7.2. Используемые в исследовании штаммы были изолированы у пациентов с клиническими признаками вагинита УЗ «Гродненская университетская клиника». Идентификация и типирование микроорганизмов производилось на микробиологическом анализаторе Vitek 2 Compact фирмы «BioMérieux». Для приготовления рабочего раствора воздействующих веществ использовали доксициклин в капсулах по 100 мг ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов». По воздействию на планктонные формы исследованы 4 варианта десятикратных разведений: 1 - доксициклин в концентрации (1000 - 0,1 мкг/мл); 2 - доксициклин (1000 - 0,1 мкг/мл) и триптофан (2000 - 0,2 мкг/мл); 3 - доксициклин (1000 - 0,1 мкг/мл) и цинка аспартат (2000 - 0,2 мкг/мл); 4 - доксициклин (1000 - 0,1 мкг/мл) и смесь триптофана (2000 - 0.2 мкг/мл) и цинка аспартата (2000 - 0.2 мкг/мл). МПК90 доксициклина и его комбинаций с триптофаном и цинка аспартатом по отношению к планктонным формам микроорганизмов S. aureus 2738 и S. haemolyticus 2642 определяли методом серийных разведений в бульоне [5]. Использовали суточную культуру S. aureus и S. haemolyticus выращенную на скошенном мясопептонном агаре в концентрации 1.5 x 108 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл ед. (0,5 ед. МакФарланда) в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. Концентрацию микробных тел контролировали измерением оптической плотности растворов по шкале MсFаrlаnd на детекторе мутности суспензий DЕN-1 Biоsаn до и после инкубации 35±1⁰С, 24 часа. Затем проводили посев из пробирок на мясопептонный агар в чашки Петри для регистрации минимальной бактерицидной концентрации и оценки возможной нежелательной мутности исследуемых соединений. Экспозиция 24 ч. при 35±1⁰С. Биопленки выращивали в системе иммунологических планшетов в статических условиях 5 суток, при 35±1⁰С, время экспозиции 24 ч. по адаптированной методике, описанной Caiazza и O'Toole, для микропланшетов Qu et al., 2016. В каждую лунку вносили по 100 мкл питательного бульона Мюллера-Хинтона, 20 мкл взвеси микроорганизмов и медные сеточки для формирования биопленки и последующей просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Медные сеточки диаметром 3,5 мм, покрывали формваровой плёнкой [2]. Использовали суточную культуру микроорганизмов в концентрации 0,5 ед. МкФ. Ежедневно производили удаление планктонных форм: извлекали бульон, промывали лунки фосфатным буферным раствором (рН 7,2-7,4) затем вносили свежую питательную среду и продолжали инкубировать, а также делали отбор сеточек для исследования ультраструктуры биопленки с помощью электронного микроскопа JЕM 1011 (JЕОL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 KV. Для изучения активности препаратов на микроорганизмы в составе биопленки на 4-е сутки после промывки поставили двойные разведения доксициклина и его комбинаций с триптофаном и цинка аспартатом: 1 - доксициклин в двойных разведениях (5000-600 мкг/мл); 2 - доксициклин в двойных разведениях (5000-600 мкг/мл) + триптофан 1000 мкг/мл; 3 - доксициклин в двойных разведениях (5000-600 мкг/мл) + цинка аспартат 1000 мкг/мл (Macia et al., 2014). Через 24 часа каждую лунку промывали буферным раствором. Производили отбор 10 препаратов-сеточек, для каждого образца и делали по 10 фотографий в последовательно случайном поле зрения электронного микроскопа. После забора сеточек, вносили свежую питательную среду и 1% раствор резазурина, регистрировали МИК. Для определения МИК исследуемых веществ на микроорганизмы в составе биопленки применяли модификацию метода определения метаболической активности биопленок с использованием анализа восстановления XTT (2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -5- [карбонил (фениламино)] - 2H-гидроксид тетразолия) на основе 1% резазурина (Alamar Blue) по методике, описанной Pierce et al. Величины МИК воздействующих веществ по отношению к планктонным формам и микроорганизмам в составе биопленок выражали в мкг/мл. Показатели бактериального роста выражали в ед. МкФ (при необходимости результаты могут быть переведены в КОЕ). Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 10 с использованием многофакторного дисперсионного анализа. Различия между сравниваемыми параметрами считали достоверными при p<0,05. Результаты исследования и их обсуждение Эффекты присутствия триптофана и цинка аспартата на чувствительность планктонных форм S. aureus и S. haemolyticus к доксициклину представлены на рис. 1 и 2. Доксициклин ингибирует рост планктонной формы S. aureus в концентрациях 1000-100 мкг/мл. При снижении концентрации до 10-0,1 мкг/мл наблюдается обратный эффект, стимуляция роста бактериальной культуры (до 3,0 ед. МкФ) (9×108 КОЕ) (р<0,05) при контроле 1,9 ед. МкФ. Триптофан и цинка аспартат оказывают модулирующее действие на чувствительность к доксициклину, во всех исследуемых концентрациях (рис. 1). Наиболее значимые различия в эффектах присутствия триптофана и цинка аспартата на чувствительность S. aureus наблюдаются при воздействии доксициклина 1 мкг/мл и БАВ 2 мкг/мл (рис.1). S. aureus проявляет наибольшую чувствительность в данной концентрации к доксициклину в присутствии цинка аспартата, мутность бактериальной культуры 0,54 [0.44; 0.54] ед. МкФ или 1,5×108 КОЕ/мл (р<0,05) в сравнении с контролем 1,9 ед.; к доксициклину в присутствии триптофана 1,62 [0.52; 0.72] ед. МкФ или 4.5×108 КОЕ/мл (р<0,05) в сравнении с контролем 1.9 ед. МкФ.; к доксициклину в присутствии смеси триптофана и цинка аспартата 1,86 [1, 76; 1, 96] ед. МкФ или 5×108 КОЕ/мл (р<0,05) в сравнении с контролем 1,9 ед. МкФ; в присутствии доксициклина рост S. aureus составил 3,02 [2, 92; 3, 12] ед. МкФ или 9×108 КОЕ/мл (р<0,05) в сравнении с контролем 1,9 ед. МкФ (рис.1). Самой эффективной среди 4-х комбинаций препаратов в концентрации доксициклин/БАВ 1/2 мкг/мл является доксициклин с цинка аспартатом, в сравнении с доксициклином данная комбинация эффективнее на 83%; комбинация с триптофаном увеличивает эффективность доксициклина по отношению к S. aureus на 47%; комбинация со смесью триптофана и цинка аспартата на 39% (рис. 1) Рис. 1. График зависимости роста S. aureus от комбинаций препаратов и их концентраций На рост планктонной формы S. haemolyticus доксициклин проявляет ингибирующий эффект в концентрации 100 мкг/мл (таб. 1). Наиболее значимые эффекты БАВ также наблюдается в концентрации 2 мкг/мл. S. haemolyticus проявляет наибольшую чувствительность в данной концентрации к доксициклину в присутствии смеси триптофана и цинка, мутность бактериальной культуры 0,76 ед. [0, 70; 0, 80] ед. МкФ (р<0,05) в сравнении с контролем 2,33 [2, 20; 2, 46] ед. МкФ; на втором месте по эффективности комбинация доксициклин + смесь триптофана и цинка аспартата 0,88 [0, 80; 0, 90] ед. МкФ (р<0,05) в сравнении с контролем 2,33 ед. МкФ; в присутствии цинка аспартата, мутность бактериальной культуры 1,20 [0, 44; 0, 54] ед. МкФ (р<0,05) в сравнении с контролем 2,33 ед. МкФ; в присутствии доксициклина рост составил 1,38 [1,30; 1.40] ед. МкФ (р<0,05) в сравнении с контролем 2,33 ед. МкФ (рис. 2). Рис. 2. График зависимости роста S. haemolyticus от комбинаций препаратов и их концентраций Наиболее выраженный антибактериальный эффект триптофана и цинка аспартата по отношению к S. haemolyticus наблюдается в комбинации доксициклина со смесью триптофана и цинка аспартата в концентрации 2 мкг/мл. является. В сравнении с доксициклином данная комбинация эффективнее на 45%; комбинация с триптофаном увеличивает эффективность доксициклина на 37%; комбинация с цинка аспартатом увеличивает эффективность доксициклина на 14% (рис. 2). Эффекты присутствия триптофана, цинка аспартата, а также смеси (триптофан+ цинка аспартат) на чувствительность S. aureus и S. haemolyticus в составе моно- и микст-биопленок отражены на рисс. 3 и 4, в табл. 1. Электронно-микроскопическое изучение микроорганизмов: S. aureus 2738 и S. haemolyticus 2642 показало, что они способны образовывать биопленки (рис. 3). Рис. 2. Образцы 5-дневных биоплёнок; А - монобиопленка S. aureus + доксициклин 600 мкг/мл; Мерный отрезок равен 1 мкм; B - монобиопленка S. aureus + доксициклин 600 мкг/мл + триптофан 1000 мкг/мл; Мерный отрезок равен 2 мкм Очевидно образование электронноплотных структур с обильным количеством клеток, адгезированных к поверхности формваровой пленки и друг к другу. Кокки в биопленке объединены рыхлым внеклеточным веществом (полисахаридные фибриллы и внеклеточная ДНК). Признаками образования истинной биопленки в отличие от колоний микроорганизмов на агаре является наличие внеклеточного матрикса, а также адгезия - образование биопленки (обратимая и необратимая стадии) [3]. Данные признаки обнаруживаются и при микроскопии моделей биопленок (рис. 3). Морфологические исследования показывают, что образцы биопленок, которые культивировали с доксициклином в присутствии 1000 мкг/мл БАВ (2, 3 препараты) имеют признаки более обширного разрушения по сравнению с биопленками, подвергшимися воздействию только доксициклина. Доксициклин в присутствии триптофана и цинка аспартата вызывал выраженную деградацию биопленки, деформацию бактериальных клеток, отсутствие клеток в стации деления и исчезновение экзополисахаридного матрикса. XTT тест выявил следующие закономерности: МИК доксициклина для биопленок S. aureus, S. haemolyticus 1200 мкг/мл; МИК доксициклина с триптофаном 1000 мкг/мл ≤ 600 мкг/мл; МИК доксициклина с цинка аспартатом 1000 мкг/мл ≤ 600 мкг/мл; МИК доксициклина в присутствии смеси триптофана 1000 мкг/мл и цинка аспартата 1000 мкг/мл ≤ 600 мкг/мл. Комбинация доксициклина с триптофаном, цинка аспартатом, смесью триптофана и цинка аспартата 1000 мкг/мл в 2 раза повышает чувствительность S. aureus, S. haemolyticus в составе биопленок (рис. 4, табл. 1). Результаты данного исследования показывают, что БАВ (триптофан и цинка аспартат) напрямую или через адьювантный эффект повышают активность доксициклина по отношению к планктонным и их биопленочным формам S. aureus и S. haemolyticus. Степень повышения чувствительности к доксициклину зависит от вида микроорганизма, его формы существования (планктонная или биопленочная), комбинации БАВ (триптофан, цинка аспартат, смесь) и концентрации БАВ. Также необходимо отметить отсутствие синергетических эффектов триптофана и цинка аспартата (комбинация 4) в повышении эффективности антибактериального эффекта доксициклина по отношению к планктонной форме S. aureus и его вероятное наличие по отношению к планктонной форме S. haemolyticus Рис. 4. XTT анализ в модификации с 1% резазурином при экспозиции 3 часа Таблица 1. Эффект добавления БАВ (1000 мкг/мл) на чувствительность к доксициклину S. aureus, S. haemolyticus в составе биопленок при экспозиции 60 минут Состав биопленки Контроль (м/о без препаратов) 1. Dox 1200/600 мкг/мл 2. Dox+Trр 1200/600 мкг/мл 3. Dox+ZА 1200/600 мкг/мл 4. Dox+Trр+ZА 1200/600 мкг/мл N 3 3 3 3 3 S.aureus Р С*/Р# С*/С* С*/С* С*/С* S.haemolyticus Р С*/Р# С*/С* С*/С* С*/С* S.aureus + S.haemolyticus Р С*/Р# С*/С* С*/С* С*/С* Примечание: Р - розовый цвет; С - синий цвет; достоверные изменения в сравнении с контролем (*); с группой 2, 3, 4 мкг/мл (#) Установленные закономерности могут быть использованы в качестве теоретической основы для разработки способов повышения эффективности АМП в терапии бактериальных инфекций, биопленочных инфекций (непосредственно тканевых и опосредованных инфекций, связанных с колонизацией патогенов на поверхности медицинских устройств и катетеров). А также для более четкого понимания функционирования и роли микробных биопленок в течении инфекционных процессов. Выводы 1. Исследуемые клинические изоляты: S. aureus 2738 и S. haemolyticus 2642 способны образовывать биопленки. 2. Триптофан и цинка аспартат в концентрации 2 мкг/мл повышают антимикробную активность доксициклина по отношению к планктонным формам S. aureus и S. haemolyticus. 3. Триптофан и цинка аспартат в концентрации 1000 мкг/мл по результатам изображений ПЭМ и ХТТ анализа способствуют разрушению биопленок S. aureus и S. haemolyticus.

Об авторах

Татьяна Валерьевна Артюх

Гродненский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
магистр медицинских наук, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. С.И. Гельберга, Гродненский Государственный Медицинский Университет 230009, Республика Беларусь, Гродно, ул. Горького, 80

Владимир Михайлович Шейбак

Гродненский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. С.И. Гельберга, Гродненский Государственный Медицинский Университет 230009, Республика Беларусь, Гродно, ул. Горького, 80

Оксана Борисовна Островская

Гродненский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. С.И. Гельберга, старший научный сотрудник группы морфологии с электронной микроскопией научно-исследовательской лаборатории, Гродненский Государственный Медицинский Университет 230009, Республика Беларусь, Гродно, ул. Горького, 80

Список литературы

Дополнительные файлы