ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕРГЕННОСТИ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПЛАСТИН ЛЕКАРСТВЕННЫХ СЕКСТАФАГ®

Полный текст

Введение Проблема местного медикаментозного лечения гнойных ран является актуальной задачей современной фармакологии и хирургии. Количество пациентов с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей не уменьшается и имеет тенденцию к росту, составляя до 35-40% от всего количества хирургических пациентов. С гнойно-воспалительными осложнениями связано до 42% летальных исходов хирургических вмешательств. Для лечения гнойной хирургической инфекции практической медициной используются противомикробные химиотерапевтические препараты, которые у 30% пациентов вызывают побочные реакции и осложнения - от аллергии до анафилактического шока с летальным исходом, оказывают токсическое действие на различные органы и системы [13]. Антибиотикотерапия приводит к изменению видового состава возбудителей инфекций, появлению полирезистентных штаммов микроорганизмов и генерализации инфекции, а также к изменению течения раневого процесса, к учащению хронических форм и рецидивов воспаления [6]. Одним из альтернативных методов воздействия на патогены, устойчивых к антибиотикам, является применение вирусов бактерий - бактериофагов, избирательно поражающих болезнетворные микроорганизмы. Антибактериальный эффект лечебно-профилактических препаратов бактериофагов обусловлен внедрением генома фага в бактериальную клетку с последующим его размножением и лизисом инфицированной клетки. Вышедшие во внешнюю среду в результате лизиса бактериофаги повторно инфицируют и лизируют другие бактериальные клетки, действуя до полного уничтожения патогенных бактерий в очаге воспаления. В условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам интерес у клицинистов вызывают поливалентные комбинированные бактериофаги, содержащие несколько видов бактериофагов [16]. Высокая эффективность жидкого лекарственного препарата Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) наблюдалась при заживлении хирургических ран, осложненных развитием гнойной инфекции [9], при комплексной терапии больных с атопическим дерматитом [1], при лечении хронической анальной трещины [15], при профилактике послеоперационной раневой инфекции при ампутациях нижних конечностей [14], при хирургическом лечении парапротезной инфекции эндопротеза тазобедренного сустава [10]. Перспективным направлением является разработка и применение ранозаживляющих средств на основе иммобилизованных бактериофагов, обладающих стимуляцией регенерации тканей, антибактериальной и дегидратационной активностями. Патогенетически обоснованными современными твердыми лекарственными формами для лечения гнойных раневых процессов являются аппликационные формы на основе полимеров медицинского назначения с включенными в них субстанциями природного и/или синтетического происхождения [12]. Нами разработан лекарственный препарат Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный), пластины лекарственные с иммобилизированным комбинированным поливалентным бактериофагом на биодеградируемом полимере. Оригинальность разработанного состава и технологии Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный), пластины лекарственные подтверждена патентом РФ №2677290 «Биодеградируемые пластины лекарственные и способ их получения». В рамках фармацевтической разработки оригинального лекарственного средства одним из обязательных этапов доклинических исследований является оценка безопасности и эффективности. Безопасность накожного оригинального лекарственного препарата оценивают по показателю аллергенность. Эффективность лекарственного препарата характеризуется степенью положительного влияния лекарственного препарата на течение и продолжительность заболевания. Целью работы являлась оценка аллергезирующих свойств и ранозаживляющего действия пластин лекарственных Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный). Методика Объекты исследования: 1) Пластины лекарственные с иммобилизованным комбинированным поливалентным препаратом Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) на основе биодеградируемого полимера метилцеллюлозы, полученные согласно патенту РФ №2677290 «Биодеградируемые пластины лекарственные и способ их получения». Пластины лекарственные Секстафаг® размером 3×3 см, толщиной 0,5 см, эквивалентны 5 мл жидкого коммерческого препарата Секстафаг®. Специфическая (литическая) активность пластин, установленная по методу Аппельмана, по отношению к Staphylococcus (aureus, epidermidis), Streptococcus (pneumoniae, agalactiae, pyogenes), Proteus (mirabilis, vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, энтеропатогенных Escherichia coli, составляла не менее 10-3. 2) Официальная мазь Левомеколь ФС 42-2922-98 (препарат-сравнения), которая широко применяется для лечения местной гнойной раневой инфекции. Для проведения доклинических исследований использовали лабораторных животных: морских свинок альбиносов массой 250-300 г обоего пола в количестве 6 особей, кроликов породы Шиншилла массой 1500-1800 г обоего пола в количестве 16 особей, белых крыс-самцах популяции Wistar массой 180-220 г в количестве 18 особей. Условия карантинирования и содержания подопытных животных соответствовали действующим санитарным правилам ФЗ-И-ВР-03-308.3-В1-2584 «Карантинирование лабораторных животных» по устройству и оборудованию вивариев. Лабораторных животных распределяли по экспериментальным группам, используя рандомизацию [11]. Исследование безопасности разработанного препарата пластины лекарственные Секстафаг® по показателю аллергенность проводили in vivo в тесте накожных аппликаций согласно Методическим рекомендациям «Оценка аллергизирующих свойств фармакологических средств» №98/300, Москва (1998) [2, 7, 8]. Эксперименты выполняли на лабораторных животных двух видов - морских свинках альбиносы в количестве 6 особей и кроликах породы Шиншилла в количестве 6 особей. Исследование сенсибилизирующего действия препарата проводили путем 20 повторных накожных аппликаций на участок депилированной боковой поверхности туловища кроликов и морских свинок размером 3×3 см по 5 раз в неделю в дозе эквивалентной 5 мл жидкого препарата Секстафаг®. Оценку местно-раздражающего действия проводили путем 10 повторных накожных аппликаций. Исследование сенсибилизирующего действия путем 20 повторных накожных аппликаций. В течение эксперимента проводили ежедневное наблюдение за лабораторными животными (заболеваемость и смертность), а также осмотр каждого лабораторного животного (поведение и общее состояние). Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб, представленной в табл. 1. Табл. 1. Оценка кожной реакции на аппликацию исследуемого препарата № Клинические проявления Баллы 1 видимой реакции нет 0 2 очаговая эритема по всему участку аппликации исследуемого препарата 1 3 сплошное бледно-розовое пятно или сливающаяся очаговая эритема (красные пятна на розовом фоне) 2 4 сплошная эритема с ярко-розовым или красным цветом кожи; 3 5 инфильтрация и отёк кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы 4 6 эритема, выраженная инфильтрация, образование корочек 5 Лабораторные животные (белые крысы) распределяли по группам, используя при рандомизации в качестве основного критерия массу тела (отклонение значений массы тела в пределах группы не более 10 %). Количество животных в каждой экспериментальной группе - 6. Контрольная группа №1 - без лечения. Опытная группа №2 - лечение с использованием пластин лекарственных Секстафаг®. Опытная группа №3 - лечение официальной мазью Левомеколь (препарат-сравнения). Крысам под кратковременным эфирным наркозом производили линейный разрез кожи до подкожной клетчатки длиной 5 см и зашивали рану рядом узловых швов. В течение эксперимента проводили ежедневное наблюдение за лабораторными животными, осматривали каждого лабораторного животного (поведение и общее состояние). В контрольной группе №1 обработку ран не проводили. В опытных группах №№2 и 3 ежедневно обрабатывали раны подопытных животных исследуемыми лекарственными препаратами. Животных умерщвляли на пятые и седьмые сутки после операции. Клиническое обследование трупов лабораторных животных включало осмотр рубца на наличие инфекционных осложнений по гнойному отделяемому. Для определения прочности рубца на разрыв линейной ушитой послеоперационной раны использовали ранотензиометрический способ [4]. Прочность рубца рассчитывали по формуле: , где: F - сила разрыва рубца, Н; m - масса груза, необходимая для разрыва рубца; g - ускорение свободного падения, м2/с. Моделирование ранозаживляющего действия планиметрическим методом на модели «линейной» гнойной инфицированной раны. Лабораторным животным кроликам породы Шиншилла массой в количестве 10 особей депилировали боковую поверхность кожи площадью 10×5 см. Гнойно-воспалительную рану моделировали в асептических условиях под местным наркозом раствора новокаина 0,5% для инъекций путем разреза кожи длиной 2 см, формирования подкожного кармана с введением 1 мл тест-культуры - штамм Sthaphylococcus aureus с концентрацией 109 микробных тел (концентрация определялась по стандарту мутности). Края раны ушивались полисорбом 00. Через 48 ч. после введения тест-культуры у экспериментальных животных формировалось гнойное воспаление мягких тканей, характеризующееся отеком краев раны, гиперемией с обильным гнойным отделяемым (рис. 1). Рис. 1. Моделирование гнойно-воспалительного процесса (А - до снятия шва, Б - после снятия шва), увеличение объектива - 1Х Исходные раны выглядели следующим образом: отмечалась гиперемия, отек окружающих тканей и краев ран, наблюдалось обильное гнойное отделяемое (рис. 1.Б). После удаления швов рану обрабатывали изотоническим раствором натрия хлорида и удаляли некротические ткани. Лабораторных животных (кроликам породы Шиншилла) распределяли по группам (по 5 особей в группе). Опытная группа №1 - лечение проводили путем обработки ран изотоническим раствором натрия хлорида и накладывания биодеградируемых пластин лекарственных Секстафаг®. Опытная группа №2 - лечение путем обработки ран изотоническим раствором натрия хлорида и накладывания стерильной повязки с официальной мазью Левомеколь (препарат-сравнения). Аппликации исследуемых препаратов наносили каждые 2 суток, продолжительность лечения и наблюдения составила 22 суток. Оценка фармакотерапевтической эффективности лечения в экспериментальных группах проводилась методом сравнительного наблюдения и планиметрического анализа. Метод сравнительного наблюдения позволяет визуально оценить фармакотерапевтическую эффективность лечения в экспериментальных группах путем систематического осмотра состояния раневой поверхности и окружающих тканей (гнойное отделяемое, экссудация, перифокальное воспаление, грануляция, краевая эпителизация, рубцевание). Метод сравнительного наблюдения даёт возможность сравнения динамики уменьшения признаков воспаления, появления и быстроты регенерационных процессов. Планиметрический анализ позволяет расчетным способом оценить фармакодинамику in vivo изменения площади ран и скорости заживления раневой поверхности (тест Л.Н. Поповой) [5]. Скорость уменьшения площади ран (V) рассчитывали по формуле: , где: S - площадь раны исходная, St - площадь раны через t дней, t - количество дней наблюдения. Индекс ускорения заживления ран (Iv) по сравнению с препаратом сравнения рассчитывали по формуле: Статистическую обработку результатов проводили и анализировали методами вариационной статистики в соответствии с ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний». Достоверность различий между группами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 [3]. Результаты статистической обработки многократных измерений одного показателя представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (М±m). Компьютерная обработка проводилась с использованием электронных таблиц «Exсel» и программы «Biostat» для Windows, версия 4.03. Результаты исследования и их обсуждение В рамках фармацевтической разработки референтного накожного лекарственного препарата - пластины лекарственные Секстафаг®, одним из этапов доклинических исследований являлась оценка аллергических реакций на введение препарата. В тесте накожных аппликаций установлено, что ежедневное нанесение на депилированный участок кожи препарата не вызывало у кроликов и морских свинок изменений кожного покрова. Клинические проявления местно-раздражающего действия (гиперемия, отек, шелушения, зуд и пр.) у подопытных лабораторных животных за весь период эксперимента не наблюдались. Болезненная реакция у животных при пальпации выстриженных участков кожи отсутствовала. При нанесенных 20 аппликациях композиции сенсибилизация у кроликов и морских свинках не проявилась. Степень аллергизирующего действия, определенная по верифицированной 5-бальной шкале, была равна 0. Таким образом, в результате изучения аллергенного действия препарата показано, что пластины лекарственные Секстафаг® не обладают аллергизирующими свойствами в тесте накожных апликаций у лабораторных животных. На следующем этапе работы изучали влияние пластин лекарственных с иммобилизованным бактериофагом на заживление линейных кожных ран у экспериментальных животных (белые крысы). В качестве эталона сравнения использовали мазь Левомеколь, широко применяемую для лечения местной гнойной инфекции. Результаты исследования ранозаживляющего действия пластин лекарственных Секстафаг® тензиометрическим методом на модели линейной асептической раны у лабораторных животных представлены в табл. 2. Таблица 2. Ранозаживляющее действие лекарственного препарата Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный), пластины лекарственные Группа животных, n=6 Сила разрыва рубца, Н Количество инфекционных осложнений, % На 5 сутки На 7 сутки 1. Контроль - без лечения 225,0±11,5 493,3±15,4 83,3 2. Опытная - лечение мазью Левомеколь 366,7±19,* 681,6±21,* 33,3 3. Опытная - лечение пластинами лекарственными Секстафаг® 398,3±14,* 711,7±15,* 0 Примечание: * - достоверно относительно контроля p<0,05 по t критерию Стьюдента Пластины лекарственные Секстафаг® и официальная мазь Левомеколь в сравнении с контролем обладают выраженной фармакотерапевтической эффективностью ранозаживления. В сравниваемых опытных группах относительно контроля выявлены достоверные различия по силе разрыва рубца (р<0,05). Количество инфекционных осложнений в контрольной группе без лечения составило 83,3%, в опытной группе с местным лечением ран официальной мазью Левомеколь- 33,3%. В опытной группе при аппликации пластин лекарственных Секстафаг® инфекционные осложнения отсутствовали. Исследование ранозаживляющего действия на модели «линейной» гнойной раны у лабораторных животных показало, что перед началом лечения инфицированных ран кожи у кроликов наблюдали беспокойство, перифокальное воспаление и болезненность тканей, обильное выделение гнойно-гнилостного экссудата. В процессе фармакотерапии происходило очищение поверхности раны от гнойно-некротических масс, купировалось перифокальное воспаление, появлялись грануляции и начиналась краевая эпителизация (рис. 2). Пластины лекарственные Секстафаг® через 2 суток после наложения полностью биодеградировали. Аппликации с мазью Левомеколь прилипали к ране и при смене марлевой повязки происходило травмирование регенерирующих тканей. пластины лекарственные Секстафаг® мазь Левомеколь А Б А Б Рис. 2. Клиническая картина ран после 2 -х суток фармакотерапии (А - после снятия повязки; Б - после обработки 0,9% раствором натрия хлорида), увеличение объектива - 1Х Результаты сравнительного наблюдения по динамике изменения клинических показателей раневого процесса экспериментальных образцов биодеградируемых пластин лекарственных, содержащих комплексный поливалентный препарат Секстафаг® и препарата-аналога Левомеколь мази в опытах in vivo на экспериментальной модели локализованной гнойной раны у кроликов, инфицированной полирезистентным штаммом стафилококка золотистого представлена в табл. 3. Табл. 3. Клиническая характеристика течения раневого процесса у кроликов с моделированной гнойной раной Исследуемый клинический признак Сравниваемые опытные группы Р №1 с применением пластин лекарственных Секстафаг®, n=6 №2 с применением мази Левомеколь, n=6 I фаза воспаления Продолжительность перифокального воспаления, сут. 3,86±0,23 12,75±0,37 <0,05 Продолжительность гнойного отделяемого, сут. 4,00±0,38 13,75±0,31 <0,05 Продолжительность экссудации, сут. 5,75±0,25 16,25±0,45 <0,05 II фаза пролиферации Появление грануляции, сут. 2,25±0,25 6,25±0,39 <0,05 III фаза заживления Начало краевой эпителизации, сут. 4,5±0,33 11,75±0,37 <0,05 Образование рубца, сут. 9,7±1,6 21,3±0,4 <0,05 Местное лечение ран мазью Левомеколь сопровождалось выраженном отеком, гнойным отделяемым и болезненностью в течение 16,25±0,45 суток после начала эксперимента. В дальнейшем с развитием грануляционной ткани и заживления раны воспалительные процессы стихали, а интенсивность регенеративных процессов возрастала. Появление краевой эпителизации у животных происходило к 11,75±0,37 суткам. Дефект оказывался полностью эпителизированным на 21,3±0,4 сутки, в подлежащих тканях формировался гипертрофический рубец. При аппликации пластин лекарственных Секстафаг® по сравнению с эталоном сравнения (мазь Левомеколь) сокращались сроки течения фаз раневого процесса: I фаза воспаления - продолжительность перифокального воспаления в 3,4 раза (3,86±0,23 сут. и 12,75±0,37 сут. соответственно), продолжительность гнойного отделяемого в 3,4 раза (4,00±0,38 сут. и 13,75±0,31 сут. соответственно), продолжительность экссудации в 2,8 раза (5,75±0,25 сут. и 16,25±0,45 сут. соответственно); II фаза пролиферации - появление грануляции в 2,8 раза (2,25±0,25 сут. и 6,25±0,39 сут. соответственно); III фаза заживления - начало краевой эпителизации в 2,6 раза (4,5±0,33сут. и 11,75±0,37 сут. соответственно), образование рубца в 2,2 раза (9,7±1,6 сут. и 21,3±0,4 сут. соответственно). При оценке клинических признаков раневого процесса отмечена положительная динамика ранозаживления в опытной группе с применением пластин лекарственных Секстафаг®. В сравниваемых опытных группах выявлены достоверные различия по клиническим признакам течения раневого процесса первой фазы воспаления, второй фазы пролиферации и третьей фазы заживления (р<0,05). Таким образом, применение пластин лекарственных Секстафаг® способствовало ускорению динамики прохождения фаз раневого процесса в 2,2-3,4 раза в сравнении с лечением официальной мазью Левомеколь, что подтверждает их высокую эффективность и предопределяет рациональность в лечении гнойных ран. Общий срок заживления раны определяется скоростью течения репаративно-регенеративного процесса, направленного на постепенное уменьшение раневой поверхности вплоть до ее полного закрытия. В связи с этим, об эффективность ранозаживляющего действия препарата оценивали по темпам уменьшения площади поверхности раны. Фармакодинамика раневого процесса по показателям площадь раны и скорость заживления ран в зависимости от срока лечения представлена в табл. 4. Табл. 4. Фармакодинамика заживления раневых дефектов Сроки наблюдения за животными, сут. Сравниваемые группы Опытная группа №1 с применением пластин лекарственных Секстафаг®, n=6 Опытная группа №2 с применением мази Левомеколь, n=6 S, % V, %/сут S, % V, %/сут 2 54,00±1,00 23,00 70±1,12 15,00 4 30±0,78 17,50 56±0,80 11,00 6 17±0,27 13,83 44±0,62 9,33 8 2±0,01 12,25 38±0,41 7,75 10 Заживление 10,00 34±0,40 6,60 12 - - 32±0,35 5,67 14 - - 30±0,32 5,00 16 - - 24±0,24 4,75 18 - - 16±0,18 4,67 20 - - 7±0,01 4,65 22 - - Заживление 4,55 Исходные экспериментальные раны у всех лабораторных животных были сопоставимы. В ходе эксперимента наблюдали постепенное уменьшение площади ран в обеих группах в сравнении с предыдущим измерением. В опытной группе №1 репаративно-регенеративные процессы были стабильно высокими на протяжении всего срока наблюдения, что указывает на активность пластин лекарственных Секстафаг® в первую, вторую и третью фазу раневого процесса. В опытной группе №2 наиболее высокие темпы репаративно-регенеративных процессов отмечались в ранние сроки, что указывает на максимальную активность официальной мази Левомеколь в первую фазу раневого процесса. При лечении пластинами лекарственными Секстафаг® полное ранозаживление наблюдалось на 10 сутки, а при лечении мазью Левомеколь - на 22 сутки. Скорость заживления ран в опытной группе №1 в 1,5-1,6 раза выше, чем в опытной группе №2. Индекс ускорения заживления ран при терапии пластинами лекарственными Секстафаг® по сравнению с группой, в которой животных лечили препаратом мазью Левомеколь, составил 213,18%. Таким образом, пластины лекарственные с иммобилизированным комбинированным поливалентным препаратом Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) на биодеградируемом полимере обладают выраженным ранозаживляющим и антибактериальным действием при терапии гнойно-воспалительных ран. Заключение Доклинические исследования в тесте накожных аппликаций показали, что пластины лекарственные Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) не обладают аллергизирующими свойствами, а также способствуют сокращению основных фаз течения раневого процесса в 2,2-3,4 раза, более эффективно сокращают переход первой фазы раневого процесса во вторую фазу, повышают скорость заживления ран в 1,5-1,6 раза по сравнению с лечением официальной мазью Левомеколь. Индекс ускорения заживления ран составляет 213,18 %. Экспериментальные данные свидетельствуют, что использование биодеградируемых покрытий с комбинированным бактериофагом Секстафаг® (Пиобактериофаг поливалентный) в качестве ранозаживляющих средств - перспективное направление современной медицины при лечении инфицированных ран, ожогов, язв, абсцессов.

Об авторах

Наталья Анатольевна Ковязина

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Алевтина Максимовна Николаева

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
доктор биологических наук, профессор кафедры промышленной технологии с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Список литературы

Дополнительные файлы