Исследование особенностей транспорта вирусного материала SARS-CoV-2 в нейронах неокортекса сирийских хомяков

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. С учетом опыта пандемии новой коронавирусной инфекции COVID-19 в настоящее время значительно возросла актуальность исследований клеточных процессов сборки и транспорта вируса SARS-CoV-2 для обоснования выбора точек фармакологического воздействия. Прослеженная широкая распространенность вируса SARS-CoV-2 в организме и его способность проникать через гематоэнцефалический барьер, определяет возможность морфологической оценки процессов его жизненного цикла в нейронах неокортекса с использованием метода электронной микроскопии, что и стало целью настоящей работы.

Материалы и методы. Вирус SARS-CoV-2 получали от больных, накапливали на культуре клеток Vero(B). Электронномикроскопическое исследование (ЭМИ) транспорта вирусных частиц проводили на самцах сирийских хомяков. Животным интраназально вводили по 26 мкл культуры вируса в количестве 4 × 104 ТЦД50/мл. Эвтаназия животных проводилась на 3, 7 и 28 сутки после заражения. Извлеченный мозг подготавливали для ЭМИ согласно ранее описанным в литературе методикам. Результаты регистрировали с помощью электронного микроскопа FEI Tecnai G2 Spitit BioTWIN.

Результаты. При ЭМИ прослежены морфологические эквиваленты вариантов транспорта вируса в нейронах неокортекса в динамике инфекционного процесса у сирийских хомяков. После синтеза белки вирусной мембраны включаются в транспортные везикулы в терминальных канальцах эндоплазматического ретикулума (ЭР) и поступают в промежуточный компартмент (ПК) — совокупность гладкостенных мембранных везикул между эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) и аппаратом Гольджи (АГ). В первые 3-е суток после заражения вирусные копии включаются в АГ в транспортных везикулах, сформированных мембранами ПК. Из-за больших размеров вирусные частицы ограничены расширенными концами подвижных цистерн АГ. Морфологически выявлена деструкция мембран АГ на 7-е сутки инфекционного процесса, что свидетельствует о взаимодействии везикул ПК с сохранившимися мембранными элементами АГ или о реализации их самостоятельной транспортной функции по доставке вируса к периферии клетки и далее в межклеточное пространство. В отростках нейронов прослежен транспорт зрелых вирусных частиц, ассоциированных с элементами цитоскелета, что не выявляли в других локусах персистирования вируса.

Заключение. По результатам полученных данных можно сформировать представление о накопительном значении для прогрессии и персистирования SARS-CoV-2-инфекции в кортикальных нейронах. Ранние признаки заражения нейрона представлены характерными изменениями ядер, гипертрофией ЭР и формированием «вирусных фабрик» на основе ЭР, ПК и АГ. Внутри нейрона происходит формирование вирусной биомассы, выход вириона из клетки в большей степени сопровождается ее гибелью, нежели при включении вируса в лизосомно-эндосомную систему

Об авторах

С. В. Чепур

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Email: ropsha.home@rambler.ru

д.м.н., профессор, начальник

Россия, Санкт-Петербург

Н. М. Парамонова

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ; ФГУН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: ropsha.home@rambler.ru

старший научный сотрудник, научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

И. А. Мясникова

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: ropsha.home@rambler.ru

к.б.н., старший научный сотрудник научно-исследовательского испытательного центра

Россия, Санкт-Петербург

Н. Н. Плужников

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Email: ropsha.home@rambler.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

М. А. Тюнин

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Email: ropsha.home@rambler.ru

к.м.н., зам. начальника научно-исследовательского испытательного центра

Россия, Санкт-Петербург

Б. А. Каневский

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Email: ropsha.home@rambler.ru

зам. начальника научно-исследовательского отдела

Россия, Санкт-Петербург

Н. С. Ильинский

ФГБУ Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны РФ

Email: ropsha.home@rambler.ru

зам. начальника научно-исследовательского отдела

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: Мир, 1974. 488 с. [Geyer G. Electronic histochemistry. Moscow: Mir, 1974. 488 p. (In Russ.)]
  2. Макаренко И.Е., Авдеева О.И., Ванатиев Г.В., Рыбакова А.В., Ходько С.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Возможные пути и объемы введения лекарственных средств лабораторным животным // Международный вестник ветеринарии. 2013. № 3. С. 72–78. [Makarenko I.E., Avdeeva O.I., Vanati G.V., Rybakova A.V., Khodko S.V., Makarova M.N., Makarov V.G. Possible ways of administration and standard drugs in laboratory animals. Mezhdunarodnyi vestnik veterinarii = International Bulletin of Veterinary Medicine, 2013, no. 3, pp. 72–78. (In Russ.)]
  3. Матвеев Ю.А. Система ангиотензина II коры мозжечка и ее значение в нейрососудистой регуляции // Вестник новых медицинских технологий. 2020. № 1. С. 90–95. [Matveev Yu.A. Angiotensin II system in cerebellum cortex and its role in neuro-vascular regulation. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologii = Journal of New Medical Technologies, 2020, no. 1, pp. 90–95. (In Russ.)] doi: 10.24411/2075-4094-2020-16498
  4. Чепур С.В., Тюнин М.А., Мясников В.А., Алексеева И.И., Владимирова О.О., Ильинский Н.С., Никишин А.С., Шевченко В.А., Смирнова А.В. Поражение органов и тканей SARS-CoV-2: биологическая модель на сирийских хомяках Mesocricetus auratus для экспериментальных (доклинических) исследований // Клиническая и экспериментальная морфология. 2021. Т. 10, № 4. С. 25–34. [Chepur S.V., Tyunin M.A., Myasnikov V.A., Alekseeva I.I., Vladimirova O.O., Iljinskiy N.S., Nikishin A.S., Shevchenko V.A., Smirnova A.V. Damage to organs and tissues of SARS-CoV-2: a biological model on Syrian hamsters for experimental (preclinical) studies. Klinicheskaya i eksperimental’naya morfologiya = Clinical and Experimental Morphology, 2021, vol. 10, no. 4, pp. 25–34. (In Russ.)] doi: 10.31088/CEM2021.10.4.25-34
  5. Fehr A.R., Perlman S. Coronaviruses: an overview of their replication and pathogenesis. Methods Mol. Biol., 2015, vol. 1282, pp. 1–23. doi: 10.1007/978-1-4939-2438-7_1
  6. Ghosh S., Dellibovi-Ragheb T.A., Kerviel A., Pak E., Qiu Q., Fisher M., Takvorian P.M., Bleck C., Hsu V.W., Fehr A.R., Perlman S., Achar S.R., Straus M.R., Whittaker G.R., de Haan C.A.M., Kehrl J., Altan-Bonnet G., Altan-Bonnet N. β-coronavirus use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell, 2020, vol. 183, no. 6, pp. 1520–1535. doi: 10.1016/j.cell.2020.10.039
  7. Griffiths G., Ericsson M., Krijnse-Locker J., Nilsson T., Goud B., Söling H.D., Tang B.L., Wong S.H., Hong W. Localization of the Lys, Asp, Glu, Leu tetrapeptide receptor to the Golgi complex and the intermediate compartment in mammalian cells. J. Cell. Biol., 1994, vol. 127, no. 6, pt. 1, pp. 1557–1574. doi: 10.1083/jcb.127.6.1557
  8. Hanus C., Geptin H., Tushev G., Garg S., Alvarez-Castelao B., Sambandan S., Kochen L., Hafner A.S., Langer J.D., Schuman E.M. Unconventional secretory processing diversifies neuronal ion channel properties. Elife, 2016, vol. 5. doi: 10.7554/eLife.20609
  9. Hartenian E., Nandakumar D., Lari A., Ly M., Tucker J.M., Glaunsinger B.A. The molecular virology of coronaviruses. J. Biol. Chem., 2020, vol. 295, no. 37, pp. 12910–12934. doi: 10.1074/jbc.REV120.013930
  10. Horstmann H., Ng C.P., Tang B.L., Hong W. Ultrastructural characterization of endoplasmic reticulum-Golgi transport containers (EGTC). J. Cell. Sci., 2002, vol. 115, no. 22, pp. 4263–4273. doi: 10.1242/jcs.00115
  11. Klein S., Cortese M., Winter S.L., Wachsmuth-Melm M., Neufeldt C.J., Cerikan B., Stanifer M.L., Boulant S., Bartenschlager R., Chlanda P. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat. Commun., 2020, vol. 11, no. 5885. doi: 10.1038/s41467-020-19619-7
  12. Klumperman J., Locker J.K., Meijer A., Horzinek M.C., Geuze H.J., Rottier P.J. Coronavirus M proteins accumulate in the Golgi complex beyond the site of virion budding. J. Virol., 1994, vol. 68, no. 10, pp. 6523–6534. doi: 10.1128/jvi.68.10.6523-6534.1994
  13. Plutner H., Cox A.D., Pind S., Khosravi-Far R., Bourne J.R., Schwaninger R., Der C.J., Balch W.E. Rab1b regulates vesicular t-ransport between the e-ndoplasmic reticulum and successive Golgi compartments. J. Cell. Biol., 1991, vol. 115, no. 1, pp. 31–43. doi: 10.1083/jcb.115.1.31
  14. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol., 1938, vol. 27, no. 3, pp. 493–497. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408
  15. Ritchie G., Harvey D.J., Feldmann F., Stroeher U., Feldmann H., Royle L., Dwek R.A., Rudd P.M. Identification of N-linked carbohydrates from severe acute respiratory syndrome (SARS) spike glycoprotein. Virology, 2010, vol. 399, no. 2, pp. 257–269. doi: 10.1016/j.virol.2009.12.020
  16. Sannerud R., Marie M., Nizak C., Dale H.A., Pernet-Gallay K., Perez F., Goud B., Saraste J. Rab1 defines a novel pathway connecting the pre-Golgi intermediate compartment with the cell periphery. Mol. Biol. Cell, 2006, vol. 17, no. 4, pp. 1514–1526. doi: 10.1091/mbc.E05-08-0792
  17. Saraste J., Prydz K. Assembly and cellular exit of Coronaviruses: hijacking an unconventional secretory pathway from the pre-golgi intermediate compartment via the Golgi ribbon to the extracellular space. Cells, 2021, vol. 10, no. 3: 503. doi: 10.3390/cells10030503
  18. Schoeman D., Fielding B.C. Coronavirus envelope protein: current knowledge. Virol. J., 2019, vol. 16, no. 1: 69. doi: 10.1186/s12985-019-1182-0
  19. Stertz S., Reichelt M., Spiegel M., Kuri T., Martinez-Sobrido L., Garcia-Sastre A., Weber F., Kochs G. The intracellular sites of early replication and budding of SARS-coronavirus. Virology, 2007, vol. 361, no. 2, pp. 304–315. doi: 10.1016/j.virol.2006.11.027
  20. Sturman L.S., Holmes K.V. The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res., 1983, vol. 28, pp. 35–112. doi: 10.1016/S0065-3527(08)60721-6
  21. TaŞtan C., Yurtsever B., Sir KarakuŞ G., Dilek KanÇaĞi D., Demİr S., Abanuz S., Seyİs U., Yildirim M., Kuzay R., Elibol Ö., Arbak S., Açikel E., Birdoğan S., Sezerman U.O., Kocagöz A.S., Yalçin K., Ovali E. SARS-CoV-2 isolation and propagation from Turkish COVID-19 patients. Turk. J. Biol., 2020, vol. 44, no. 3, pp. 192–202. doi: 10.3906/biy-2004-113
  22. Tooze S.A., Tooze J., Warren G. Site of addition of N-acetyl-galactosamine to the E1 glycoprotein of mouse hepatitis virus-A59. J. Cell. Biol., 1988, vol. 106, no. 5, pp. 1475–1487. doi: 10.1083/jcb.106.5.1475
  23. Ulasli M., Verheije M.H., de Haan C.A., Reggiori F. Qualitative and quantitative ultrastructural analysis of the membrane rearrangements induced by coronavirus. Cell. Microbiol., 2010, vol. 12, no. 6, pp. 844–861. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01437.x
  24. Volchuk A., Amherdt M., Ravazzola M., Brugger B., Rivera V.M., Clackson T., Perrelet A., Söllner T., Rothman J.E., Orci L. Megavesicles implicated in the rapid transport of intracisternal aggregates across the Golgi stack. Cell, 2000, vol. 102, no. 3, pp. 335–348. doi: 10.1016/S0092-8674(00)00039-8
  25. Westerbeck J.W., Machamer C.E. The infectious bronchitis coronavirus envelope protein alters Golgi pH to protect the spike protein and promote the release of infectious virus. J. Virol., 2019, vol. 93, no. 11: e00015-19. doi: 10.1128/JVI.00015-19
  26. Yao P., Zhang Y., Sun Y., Gu Y., Xu F., Su B., Chen C., Lu H., Wang D., Yang Z., Niu B., Chen J., Xie L., Chen L., Zhang Y., Wang H., Zhao Y., Guo Y., Ruan J., Zhu Z., Fu Z., Tian D., An Q., Jiang J., Zhu H. Isolation and growth characteristics of SARS-CoV-2 in Vero cell. Virol. Sin., 2020, vol. 35, no. 3, pp. 348–350. doi: 10.1007/s12250-020-00241-2

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Свободные соразмерные коронавирусу (80–100 нм) опушенные белками везикулы в отростках (А, Б) и в перикарионах (В–Г) нейронов, часто вблизи измененных полостей ЭР или АГ, после заражения SARS-CoV-2 4 ×104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). Электроннограммы. Увеличение: А — 105 000, Б — 135 000, В — 43 000, Г — 16 500

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Варианты пиноцитоза соразмерных вирусам «опушенных» частиц в нейропиле неокортекса после заражения SARS-CoV-2 4 × 104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). Формирование декорированных белком пиноцитозных везикул (А–Б), содержащих окруженный мембраной материал межклеточного пространства. Неспецифические процессы пиноцитоза и экзоцитоза в том числе вирусного материала структур сосудистых стенок (В) и поверхностных клеток мозга (Г). Электроннограммы. Увеличение: А — 105 000, Б — 60 000, В — 26 500, Г — 60 000

Скачать (1MB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Ультраструктура нейронов после заражения SARS-CoV-2 4 ×104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). В кариоплазме нейронов прослежены многочисленные ядрышки, локализующиеся примембранно; контур ядер часто изменен с округлого на лопастной (А–В) с расширением перинуклеарного пространства (Б) и скоплением рибосом в прилежащей к ядру цитолемме (А–В). Канальцы ЭР нередко соединены с ядерной мембраной, цистерны АГ набухшие и слипаются (Г). Электроннограммы. Увеличение: А — 6000, Б — 20 500, В — 9900, Г — 26 500

Скачать (1MB)
Метаданные
5. Рисунок 4. Формирование вирусных «фабрик» на основании деформационных изменений структур ЭР после заражения SARS-CoV-2 4 × 104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). Расширение концевых участков тонких канальцев ЭР (А), с «опушением» вирусным белком на «ампульных» расширениях (Б). Гипертрофия и слипание расширенных канальцев ЭР (В). Слияние мембран ЭР с образованием вирусных «фабрик» и отпочкованием вирусных частиц (Г). Электроннограммы. Увеличение: А — 43 000, Б — 60 000, В и Г — 26 500

Скачать (1MB)
Метаданные
6. Рисунок 5. Изменения АГ после заражения SARS-CoV-2 4 × 104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). Неравномерное набухание цистерн АГ (А), кольцеобразный АГ с потерей цис-/ транс-полярности (Б); гипертрофия АГ в перикарионной области нейрона (В); модифицированный АГ простирается внутри дендрита на отдаленном расстоянии от сомы (Г); слипание разбухших цистерн АГ (Б), образовавшийся конгломерат вирусной фабрики (Е) тотальная пролиферация соразмерных вирусу CoV «опушенных» везикул на основе реорганизаций пластинчатого комплекса (А–Е). Электроннограммы. Увеличение: А — 60 000, Б — 20 500, В — 16 500, Г — 26 500, Д — 43 000, Е — 60 000

Скачать (1MB)
Метаданные
7. Рисунок 6. Мультивезикулярные тельца в нейронах неокортекса после заражения SARS-CoV-2 4 × 104 ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально). Комплексы мультивезикулярных телец с элементами цитоскелета (А, Г), их представительство в составе измененного АГ (Б) и в участках цитозоля с повышенной белоксинтетической активностью (В). Электроннограммы. Увеличение: А — 105 000, Б — 26 500, В — 20 500, Г — 43 000

Скачать (1MB)
Метаданные

© Чепур С.В., Парамонова Н.М., Мясникова И.А., Плужников Н.Н., Тюнин М.А., Каневский Б.А., Ильинский Н.С., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».