Уникальный геном вируса и альтернативные стратегии его реализации

Полный текст

Посвящается 130-летию открытия русским ученым

Д.И. Ивановским новой формы биологической жизни – царства вирусов.

130 лет назад выдающийся русский ученый Д.И. Ивановский описал новую форму биологической жизни, так называемых фильтрующихся контагиозных корпускулярных микроорганизмов («contagium vivum fixum») [1, 2], которая впоследствии была выделена в отдельное царство вирусов [3, 4]. По современной классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses; Current ICTV Taxonomy Release: https://ictv.global/taxonomy) в домене вирусов выделяют шесть надцарств, 65 отрядов, 233 семейства и 2606 родов и более 10 тысяч вариантов (штаммов) вирусов [5].

Согласно общепризнанной классификации D. Baltimore [6], основанной на характеристике геномной нуклеиновой кислоты (НК) и стратегии ее реализации в инфицированной клетке, вирусы были разделены на семь генетических классов: I. Двухцепочечные ДНК-вирусы; II. Вирусы с одноцепочечной (+) смысловой ДНК; III. Двухцепочечные РНК-вирусы; IV. Вирусы с одноцепочечной (+) смысловой РНК; V. Вирусы с одноцепочечной (-) смысловой РНК; VI. Одноцепочечные (+) смысловые РНК-вирусы с промежуточной ДНК в жизненном цикле; VII. Двухцепочечные ДНК-вирусы с промежуточной РНК. Центральное место в классификации занимает понятие о положительной полярности вирусных мРНК, т.е. молекул РНК, способных транслироваться клеточными рибосомами с образованием вирусных белков [7, 8]. Напротив, НК негативной полярности способны кодировать и транслировать белки через промежуточный синтез комплементарной (положительно полярной) цепочки мРНК. Для геномных вирусных ДНК принято считать положительной цепочку, идентичную последовательности транслируемой молекулы плюс-мРНК, и, наоборот, цепочку, комплементарную мРНК, обозначают как отрицательно полярную.

Различия в структуре вирусного генома и вариации схем его реализации в инфицированной клетке (т.е. стратегий реализации вирусного генома) порождают разнообразие вирусов, пантропную адаптацию вирусов к различным организмам, будь то бактерии, грибы, растения, рыбы, животные, включая человека, и обеспечивают глобальное распространение вирусов на земле, а, возможно, и в космосе, и на других планетах [6].

Генетическое разнообразие вирусов, положенное в основу классификации D. Baltimore, рассматривалось с позиции: один уникальный вирусный геном – одна стратегия генома, т.е. один геном имеет одну схему репликации и направляет образование одного структурно-функционального класса вирионов (т.е. один тип репродукции вируса). При этом подразумевается однотипный и унифицированный процесс синтеза вирусных частиц (вирионов) в рамках одного рода (или семейства) вирусов [7, 8]. Однако обнаружение нами у РНК вирусов уникальных генов, локализованных в геномной РНК по принципу стопки (так называемый «genes stacking») и кодирующих белки в противоположных (амбиполярных) направлениях, приводит к идее о возможном существовании нескольких альтернативных стратегий реализации генома у одного вируса, ведущих к образованию различных структурных классов вирусных частиц.

 

Рис. 1. Локализация амбиполярных генов в РНК-геноме вируса гриппа А и коронавируса, формирование амбиполярных вирионов. A – схема кодирования генов в сегменте NS генома вируса гриппа на модели A/Aichi/2/68 (H3N2). Вирус гриппа имеет геном негативной полярности, который кодирует три белка: негативно-полярные NS1 и NEP и позитивно-полярный стекинг-белок NSP8. Показан канонический путь стратегии сегмента № 8 (NS). Данный путь осуществляется посредством синтеза белков NS1 и NEP с образованием классических оболочечных вирионов, содержащих белки PB1, PB2, PA, НА, NP, NA, M1, M2, а также возможный альтернативный путь с образованием неканонического (амбиполярного) белка NSP8 и аналогичных амбиполярных белков позитивно-полярных генов, обнаруженных в сегментах PB1, PB2, PA, NP, M, NS (белки NSP1–NSP8 соответственно нумерации РНК сегментов вирусного генома). Неканонические амбиполярные вирионы, структурированные белками NSP1–NSP8, пока не обнаружены и имеют гипотетический характер (показано пунктирной стрелкой). Б – схема кодирования генов в РНК-геноме коронавируса на модели SARS-CoV2. Коронавирус имеет геном позитивной полярности, кодирующий пять основных структурных (S1/S2, N, E, M) и 16 (nsp 1–16) вспомогательных неструктурных полипептидов. Классический путь позитивно-полярной стратегии ведет к образованию классических оболочечных вирионов, содержащих белки S1/S2, N, E, M (показан сплошной стрелкой). В негативном направлении генома (3’→5’) обнаружены протяженные рамки трансляции со всеми необходимыми элементами, такими, как инициаторный AUG, элемент Козак, структура IRES, стоп-кодоны. Эти трансляционные рамки (гены) обозначены как NGP (Negative Gene Protein) и наиболее протяженные из них, NGP1-NGP5, имели мол. массу в диапазоне 7–20 кДа [17]. Альтернативный путь стратегии генома с образованием неканонических (амбиполярных) вирионов показан прерывистой стрелкой. Белки и направление их кодирования в геноме показаны двойной стрелкой. Синтез амбиполярных полипептидов NGP1–NGP5 возможен посредством образования субгеномной (-) мРНК и ее трансляции (путь I), а также возможен через трансляцию полноразмерной комплементарной геномной (-) кРНК (путь II)

 

В 2007 году при анализе негативно-полярного генома вирусов гриппа А (семейство ортомиксовирусов) мы обнаружили протяженные рамки трансляции (open reading frame – ORF), которые, в отличие от канонических генов вирусов гриппа (РВ1, РВ2, РА, НА, NP, NA, M, NS) c негативной полярностью кодирования в геномной РНК в направлении 3’→5’, имели позитивную полярность кодирования (в направлении 5’ → 3’ геномной молекулы) (рис. 1А). Особенность обнаруженных амбиполярных генов состояла в том, что они локализовались в геноме в участках, перекрывающих соответствующие классические негативно-полярные гены, так называемое стопчатое расположение [9–14]. Позднее, в 2019 году в позитивно-полярном РНК-геноме коронавирусов нами были идентифицированы протяженные открытые рамки трансляции с негативно-полярным направлением кодирования (3’→5’) [15–18] (рис. 1Б). Обнаруженные в геномах ортомиксо- и коронавирусов амбиполярные гены характеризовались наличием всех функциональных элементов, необходимых для экспреcсии данных генетических рамок как трансляционных генов [19, 20]: стартовых кодонов ATG (или альтернативного CUG-кодона), трансляционных стоп-кодонов [21], канонических инициаторных последовательностей Kозак в зоне инициаторного кодона (Kozak element [22]), присутствием в стартовой области амбиполярного гена типичных по вторичной структуре сайтов посадки рибосом (IRES – internal ribosome entry site [23]). Компьютерный анализ алгоритмов первичной структуры вирусных геномов выявил различные структурные и функциональные домены в пока еще гипотетических белковых продуктах амбиполярных генов, в частности, трансмембранных элементов белков ионных каналов, структурных доменов убиквитин-дегидрогеназы, ряда доменов, характерных для белков, способных участвовать в регуляции иммунитета и воспаления [9, 14, 18].

В настоящее время признана точка зрения, согласно которой геном одного вида (рода) вируса имеет одну стратегию, обусловливающую образование вирусных частиц определенного (канонического) строения и характерного круга хозяев. Обнаружение амбиполярных стекинг-генов в геномах РНК-содержащих вирусов наводит на мысль о наличии альтернативных стратегий в геноме одного вида (рода) вируса, реализация которых может (1) направлять синтез нескольких структурно-функциональных классов вирионов, отличающихся как белковым составом, так и структурной формой (полярностью) геномной РНК, и/или (2) формировать несколько различных стратегий репликации вируса и его патогенеза в инфицированном макроорганизме. Наличие нескольких стратегий у одного вирусного генома создает резерв адаптивных свойств вируса, который можно рассматривать как способ (или разновидность) генетического хеджирования (т.е. генетического спасения вирусов).

 

Рис. 2. Альтернативные стратегии генома вируса гриппа, имеющего негативно-полярный геномом, и формирование амбиполярных вирионов. Схема иллюстрирует альтернативные стратегии вирусного генома на модели генома вирусов гриппа (А) и коронавируса (Б) и применима для других вирусов – пневмо-, парамиксо-, рабдо-, филовирусов и т.д., имеющих негативно-полярный РНК-геном (-R). Стратегия генома представлена как путь репликации вирусного генома, приводящий к формированию канонических вирусных частиц определенного строения и состава как в части полярности вирусного генома, так и белкового состава вирусной оболочки. Показано три альтернативных стратегии, возможных для одного уникального вирусного генома. В настоящее время каноническим считается путь I, когда как четыре другие стратегии пока являются гипотетическими. При этом вполне вероятно, что в определенном биохимическом контексте инфицированных клеток могут реализоваться стратегии II–V, когда полноразмерные цепочки геномной РНК ((+)R и (±)R) будут упаковываться белками различного состава (показано различными значками (▮,▯,▲,△), включая белки амбиполярных генов. При этом различные типы вирионов могут иметь различную оболочечную структуру, содержащую либо не содержащую клеточные липиды, так называемые оболочечные и не оболочечные вирионы. Генетическая реализация репликации вирусного генома осуществляется РНК-зависимой полимеразой, которая может включаться в состав вириона и обеспечивать начало репликации вируса в клетке-мишени. (+)R, (-)R, (±)R – три возможных варианта геномной РНК дочерних вирионов: одноцепочечной позитивной и негативной полярности и двухцепочечной структуры соответственно. Возможные пути смены стратегии экспрессии генома у вируса одного вида показаны пунктирными стрелками и знаками (II–V); классический путь негативно-полярной стратегии вируса гриппа показан главной стрелкой (I) соответственно. Для раскрытия стратегий II–V необходимы целенаправленные исследования поиска вирионов, указанных неканонических структурных классов II–V

 

Идея многовариантной стратегии генома у одного вида (рода) вирусов и схемы реализации классической и альтернативной стратегий отображены на рис. 2 на модели вируса гриппа и коронавируса. Для вируса гриппа, имеющего геномную (-)РНК, характерно наличие как классического пути реализации генома (путь I; центральная стрелка на рис. 2А), так и возможность альтернативных стратегий, показанных на рис. 2 цифрами II–V. В результате реализации альтернативных стратегий генома могут формироваться амбиполярные вирионы, которые помимо классических белков (PB1, PA, PB2, HA, NA, NP, M1, M2) могут содержать и белки – продукты амбиполярных генов NSP1–NSP8, соответствующих сегментов геномной РНК (NSP – Negative Strand Protein) (см. рис. 2А). При реализации классической для коронавируса стратегии также формируются вирионы, содержащие канонический (+) РНК-геном и классические структурные белки: N (нуклеокапсидный белок), S (поверхностный гликопротеин), E (мембранный белок), M (белок внутреннего матрикса), и образуется ряд вспомогательных неструктурных регуляторных белков, поддерживающих репликацию вируса в клетках-мишенях и подавление иммунного ответа хозяина. При этом от внимания ускользают продукты основных амбиполярных генов, обозначенных нами NGP1–NGP5 (Negative Gene Proteins, так называемые белки негативно-полярных генов [17]), которые могут формировать новый структурный класс вирионов (так называемых амбиполярных вирионов; показано на рис. 2Б пунктирной стрелкой). Пока такие белки, кодируемые открытыми амбиполярными генами, в инфицированных клетках не обнаружены. Возможная причина кроется либо в минимальном уровне их синтеза, либо строго селективной экспрессии только в специализированных клетках организма, содержащих уникальные факторы, необходимые для экспрессии данных вирусных генов «стекинг»-типа при определенных условиях внутриклеточной и/или окружающей внеклеточной среды. Вместе с тем, имеются косвенные признаки экспрессии амбиполярных генов в инфицированном макроорганизме. У животных, инфицированных вирусом гриппа А, удавалось обнаружить клоны цитотоксических лимфоцитов, распознающих специфические пептидные домены амбиполярных белков вируса гриппа, в частности белка NSP8, кодируемого амбиполярным геном NSP8 сегмента NS вируса гриппа А [24–26].

Можно предположить, что такие неканонические белки будут способны декорировать вирусный геном, формируя новый класс вирусных частиц, а также выполнять уникальные регуляторные функции и изменять поведение вируса в пораженном организме, например, переключая продуктивный тип инфекции на скрытую персистентную (низко репродуктивную) вирусную инфекцию. Более того, не исключена альтернативная возможность использования в качестве геномной молекулы цепочки РНК, комплементарной (амбиполярной реплики) каноническому геному: минус-цепочки РНК коронавирусов или плюс-РНК у вирусов гриппа (рис. 2). Таким образом амбиполярные вирусные частицы могут содержать как амбиполярные белки, так и амбиполярные реплики геномной РНК, обеспечивая альтернативный путь стратегии вирусного генома. В результате, на одном уникальном вирусном геноме может реализоваться несколько альтернативных стратегий: с участием и без участия амбиполярных генов, а сами вирусы могут иметь несколько возможных жизненных путей в зависимости от контекста окружающих клеточных процессов. Эта идея отражена на рис. 2. Такой мультивариантный механизм стратегии уникального вирусного генома можно рассматривать как способ хеджирования (от английского bet-hedging – спасение) вирусов, способствующий формированию альтернативных путей размножения вирусов и созданию резервных адаптивных потенций у вирусов различных семейств. В этом аспекте РНК-вирусы могут иметь сходство с ДНК-вирусами и РНК-содержащими ретровирусными (вирус-подобными) транспозонами, имеющими двойной образ жизни – в форме ДНК-провируса и зрелого вируса, соответственно, который определяет вертикальный (в форме интегрированной в клеточный геном ДНК-копии вирусного генома) и горизонтальный (в форме зрелых вирионов) пути их существования в хозяине в зависимости от условий среды размножения и круга хозяев [27–29].

Амбиполярные гены вирусов обладают высокой популяционной стабильностью. В частности, в природной популяции высоковариабельных вирусов гриппа данные гены сохраняются в геноме со всеми необходимыми регуляторными элементами на протяжении более 100 лет, несмотря на заметную популяционную вариабельность как канонических, так и выявленных амбиполярных генов с характерным высоким коэффициентом dN/dS, показывающим выраженное иммунологическое давление со стороны макроорганизма-хозяина [14]. Эволюционная стабильность сохранения амбиполярных генов в природной популяции вирусов подчеркивает их необходимость для вируса и, как следствие, устойчивость к естественному селективному отбору. Присутствие амбиполярных генов в геноме РНК-содержащих вирусов открывает новый путь формирования вирусного разнообразия, когда вирионы, имеющие идентичный геном, могут отличаться схемой реализации (стратегией) генома и иметь различные типы, отличающиеся как по составу белков, экспрессированных «положительными» или «негативными» генами (так называемые амбиполярные вирионы), так и по полярности генома [17]. Наличие альтернативных стратегий генома и смена профиля синтезируемых белков и вирусной оболочки дают вирусу дополнительные возможности адаптации к новому хозяину и расширению круга хозяев. При этом вирус может не только использовать разные стратегии экспрессии своего генома, но и способен менять эти стратегии в зависимости от хозяина, что отражено на рис. 2 (показано пунктирными стрелками). Пока такой путь множественной реализации вирусного генома остается гипотетическим и скрытым от нас, подобно «темной стороне луны». Экспериментальная проверка данного предположения позволит оценить возможность существования амбиполярных классов вирионов-невидимок, скрытых пока от пытливого ока исследователей. На сегодняшний момент пока не выявлено образование в инфицированном организме зрелых белковых продуктов, кодируемых обнаруженными амбиполярными вирусными генами. Но это не означает, что процесс экспрессии вирусных генов данного «стекинг»-класса не реализуется в природе. Для идентификации экспрессии генов данного типа потребуется целенаправленный поиск с применением оригинальных подходов и высокочувствительных методов идентификации белков в различных органах и специфических клетках инфицированного макроорганизма-хозяина. Не исключено, что раскрытие альтернативных стратегий вирусных геномов может иметь важное значение для понимания эволюции вирусов и патогенеза вирусных инфекций, как, например, при ковиде-2019, когда отдаленные и тяжелые осложнения вирусной инфекции могут быть обусловлены формированием амбиполярных вирионов, скрытых пока от внимания ученых и практикующих медиков.

 

Рис. 3. Схема биполярной (амбисенс) стратегии генома аренавируса (семейство Arenaviridae; род Mammarenavirus). Представлен геном аренавируса (вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV); ас.n. AY847350; AY847351). Семейство объединяет возбудителей особо опасных для человека геморрагических лихорадок Ласса, Луйо, Мачупо, Хунин, Чапаре, Гуанарито, Сабиа и др. Геном аренавирусов содержат четыре гена, которые кодируют: А – белок полимеразы (L, 110 кДа) и неструктурный белок (Z, 11 кДа); Б – нуклеокапсидный белок (N, 55 кДа) и поверхностный гликопротеид (GPC; 90 кДа) [31]. Как показано на схеме, кодирование генов L и N имеет негативную, а генов GPC и Z противоположную (позитивную) полярности соответственно. Все четыре гена разобщены в геноме аренавируса и не имеют перекрываний, а для экспрессии каждого из генов в инфицированных клетках необходим синтез индивидуальных кепированных на 5’-конце мРНК

 

Очевидно, что обнаруженный у РНК-содержащих вирусов амбиполярный стекинг генов дает вирусу, во-первых, увеличение информационной емкости генома. Во-вторых, определяет сцепленную (реципрокную) эволюцию вирусных генов, когда мутации в одном гене будут порождать изменение в стекинг-гене и, таким образом, представлять собой разновидность генетической синтении. В-третьих, белковые продукты стопчатых генов могут быть сцеплены функционально и иметь предопределенное структурное соответствие друг другу, что пока остается гипотетическим предположением и требует экспериментального подтверждения [14, 17]. Признак стекинга генов отличает указанные вирусы от уже известных в настоящее время четырех родов амбиполярных вирусов (тоспо-, флебо-, арена- и буньявирусов), у которых амбиполярные гены локализованы в геноме раздельно, не перекрывая другие гены, и функционируют как основные гены, направляющие синтез главных структурных и регуляторных вирусных белков [30]. Данная стратегия вирусного генома с разделенными амбисенс-генами, т.е. лишенными стекинг-локализации, показана на рис. 3 на модели аренавирусов (семейство Arenaviridae, род Mammarenavirus). В этой связи различие по признаку стекинга позволяет рассматривать две группы амбиполярных вирусов. На текущий момент представляется логичным следующее разделение: у первой группы вирусов (вирусы гриппа, коронавирусы), имеющих стекинг генов в вирусном геноме, реализация амбиполярных стратегий генома может иметь альтернативный (необязательный) характер, тогда как для вирусов, лишенных стекинга генов (тоспо-, флебо-, арена- и буньявирусов), реализацию амбисенс-стратегии генома следует рассматривать как облигатный (обязательный) характер для репликации вируса. Дальнейший целенаправленный поиск реализации альтернативных стратегий генома у одного вирусного вида и идентификация пока гипотетического класса амбиполярных вирионов позволят ответить на вопрос о существовании данной разновидности многообразия вирусной жизни и ее роли в эволюции вирусов различных родов и применить эти знания в разработке новых типов вакцин и противовирусных лекарств, а также для понимания молекулярных основ патогенеза вирусных болезней.

Автор выражает благодарность А.И. Чернышовой за помощь в подготовке настоящей статьи.

Об авторах

Олег Петрович Жирнов

Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского; Русско-немецкая академия медико-социальных и биотехнологических наук, Инновационный центр Сколково

Автор, ответственный за переписку.
Email: zhirnov@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-3192-8405
Россия, 123098, Москва; 121205, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы