Размножение in vitro перспективных сортов картофеля для возделывания в условиях Республики Коми

Полный текст

В последнее время все большее внимание уделяется экологизации технологии производства продукции растениеводства [1]. Одними из важных задач являются повышение сельскохозяйственной продуктивности, быстрый и точный контроль качества производимой продукции. Создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды, – одно из важных направлений классической селекции. Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью. Решить обозначенную проблему можно за счет включения в процесс классической селекции современных методов биотехнологии, которые позволяют существенно расширить генетическое разнообразие растений и найти уникальные формы, удовлетворяющие по всем признакам потребность селекционера в ценном материале [2, 3].

Среди сельскохозяйственных культур особое место занимает картофель (Solanum tuberosum L.) – важный продовольственный продукт, источник витаминов, минеральных веществ, а также углеводов [4]. Российская Федерация входит в список 25 основных мировых лидеров по объемам производства картофеля. Однако следует отметить, что в промышленных масштабах, как правило, используют сорта картофеля зарубежной селекции. Поэтому в связи со сложившейся обстановкой на мировой арене, вызванной введением санкций и сокращением импорта семенного картофеля, необходимо проводить исследования по получению новых сортов и гибридов отечественной селекции с комплексной устойчивостью к стрессовым факторам и свободных от вируса.

Перспективным направлением таких исследований является сочетание методов классической селекции, биотехнологии, в частности клонального микроразмножения и клеточной селекции in vitro, а также использование современных молекулярно-генетических методов. В настоящее время достигнуты определенные успехи в размножении картофеля in vitro, а разработанные технологии для некоторых сортов используются для массового получения высококачественного посадочного материала в промышленных масштабах. Однако следует отметить, что предлагаемые протоколы клонального микроразмножения определенных сортов картофеля не всегда бывают эффективны для других сортов. Поэтому для каждого сорта, гибрида или новой линии необходимо оптимизировать условия выращивания in vitro на каждом этапе клонального микроразмножения, на основании чего разрабатывать индивидуальные технологии.

Что касается выращивания картофеля в условиях Республики Коми, то, по мнению ученых, назрела необходимость внедрения новых сортов картофеля с высокой продуктивностью и адаптацией, устойчивых к изменениям климата, болезням, и с хорошими вкусовыми качествами. Об этом свидетельствует тенденция понижения урожайности и качества картофеля – до 18 т/га, при потенциальной урожайности 30–40 т/га.

Исходя из вышеизложенного, цель работы – разработать технологию размножения in vitro перспективных сортов картофеля для возделывания в условиях Республики Коми.

Материалы и методы

Объектом исследования служили клубни картофеля трех сортов (Зырянец, Вычегодский, Печорский).

Сорт Зырянец – среднеранний, продовольственного назначения со средней урожайностью 37.8 т/га (максимальная урожайность – 41.5 т/га). Масса товарного клубня – 72–117 г, содержание крахмала – 12.4–17.5 %, лежкость – высокая. Товарность на 60–65-й день составляет 10.9 т (от общей урожайности – 77 %). Площадь листовой поверхности в фазу цветения 40.3 тыс. м²/га, фотосинтетический потенциал – 2617.6 тыс. м² дни/га, чистая продуктивность фотосинтеза – 4.2 г/м² за сутки, суточный прирост сухой биомассы в период цветения – 330.5 кг/га. Сорт устойчив к засухе, возбудителю рака и золотистой картофельной нематоде; высокоустойчив к фитофторозу и абиотическим стрессам в условиях Республики Коми. Сорт получен учеными Института агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН.

Сорт Вычегодский – среднеранний, с урожайностью 36.0 т/га. Максимальная урожайность – 45.3 т/га. Масса товарного клубня – 89–102 г. Содержание крахмала – 13.7–20.9 %. Вкус хороший, сильно разваривается. Лежкость – средняя, хранение – при активном вентилировании. Товарность на 90–95-й день составляет 77 %. Площадь листовой поверхности в фазу цветения – 37.1 тыс. м²/га, фотосинтетический потенциал – 2411.5 тыс. м² дни/га, чистая продуктивность фотосинтеза – 8.8 г/м² за сутки, суточный прирост сухой биомассы в период цветения – 326.4 кг/га. Сорт устойчив к возбудителю рака и золотистой картофельной нематоде; относительно устойчив к фитофторозу и абиотическим стрессам в условиях Республики Коми.

Сорт Печорский – среднеспелый (91–100 дней), столового назначения. Клубни белые, мякоть кремовая, урожайность – 41.8–46.6 т/га. Товарность – 95–97 %. Масса товарного клубня – 59–202 г. Содержание крахмала – 13.1 %. Вкусовые качества: приятный вкус, хорошо развариваемый. Сохранность в зимний период хорошая. Сорт устойчив к раку и золотистой картофельной нематоде; относительно высокая устойчивость по ботве и клубням к фитофторозу, черной ножке, ризоктониозу и парше обыкновенной.

 

Рисунок 1. Певичный эксплант (глазки) картофеля перед введением в культуру in vitro, сорта: а – Печорский; б – Зырянец; в – Вычегодский.

Figure 1. The initial potato explant (eyeholes) before introduction to in vitro culture: a - Pechorsky variety; б - Zyryanets variety; в - Vychegodsky variety.

 

В качестве первичных эксплантов использовали два варианта: 1 - слабо проросшие глазки, изолированные с клубней картофеля (рис. 1), и 2 – черенки и верхушки побегов, изолированные с 14- и 30-суточных растений картофеля, полученных из проросших глазков клубней (рис. 2, 3). В эксперименте придерживались правил работы в стерильных условиях, изложенных в методических рекомендациях, разработанных на кафедре биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева [5].

 

Рисунок 2. 14-суточные растения картофеля, сорта: а – Печорский; б – Вычегодский; в – Зырянец.

Figure 2. 14-day-old potato plants: a - Pechorsky variety; б – Vychegodsky variety; в - Zyryanets variety.

 

Для получения стерильного растительного материала применяли ступенчатую стерилизацию:

Растительные экспланты культивировали в биологических пробирках в условиях световой комнаты при 16-часовом фотопериоде и температуре +25 ºС, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс. лк и относительной влажностью воздуха 70 %.

Учет результатов проводили для изолированных глазков на 30 сут., а для черенков и верхушек побегов – на 20 сут. Учитывали следующие показатели: количество стерильных эксплантов (%), высоту микропобегов (см), индекс роста (I) и удельную скорость роста (µ). I и µ рассчитывали по формулам:

где X_max и X₀ – максимальное и начальное значения высоты микропобегов, см; X₂ и X₁ – высота микропобегов (см) в момент времени t₂ и t₁ (сут.) соответственно.

Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программ MS Excel. В таблицах и диаграммах представлены средние значения (M) и их стандартные отклонения (±SEM). Статистическую значимость различий оценивали по наименьшей существенной разности при 5 %-ном уровне значимости (НСР₀₅).

Результаты и их обсуждение

Первым этапом работы было получение хорошо растущей стерильной культуры изучаемых трех сортов картофеля. Применение ступенчатой стерилизации растительного материала привело к получению асептической культуры в среднем от 10. до 89.3 % (табл. 1). Причем эффективность стерилизации зависела от сорта и типа первичного экспланта.

 

Таблица 1. Влияние сроков изоляции первичных эксплантов на получение асептической культуры картофеля

Table 1. Influence of the isolation terms of initial explants on the production of potato aseptic culture

Сорт	Асептическая культура, %
	Глазки	14-суточные черенки	30-суточные черенки
Зырянец	28.6±0.9	50.8±3.0	54.3±2.9
Печорский	77.6±2.1	89.3±4.6	85.6±4.2
Вычегодский	10.1±0.5	45.8±2.1	50.1±3.3

 

Экспериментально установлено, что наименьшее количество асептической культуры было получено при использовании глазков, в то время как при применении черенков и верхушек побегов, изолированных с 14- и 30-суточных растений, учитываемый показатель увеличился и составил 45.8–89.3 %. Как правило, во всех вариантах снижение стерильной культуры было обусловлено появлением внешней грибной инфекции, которая сохранялась на растительных эксплантах после стерилизации. Вероятно, наименьший выход асептической культуры при использовании глазков связан с нахождением данных эксплантов близко к поверхности самого клубня, на поверхности которого могли сохраняться мелкие частицы почвы – источника грибных патогенов. Скорее всего, при прорастании глазков распространение грибной инфекции на сформировавшихся побегах не происходило, что проявилось в повышении выхода асептической культуры. Следует отметить, что для сортов Вычегодский и Зырянец, независимо от типа первичного экспланта, не удалось получить высокого процента асептической культуры. Это свидетельствует о наличии грибной инфекции как в клубнях, так и в зеленой биомассе данных сортов. Для сорта Печорский были получены стерильные культуры в 77.6–89.3 % случаев при использовании как глазков, так и черенков или верхушек побегов в качестве первичного экспланта. Наши данные согласуются с результатами других исследователей [6, 7].

 

Рисунок 3. 30-суточные растения картофеля, сорта: а – Вычегодский; б – Печорский; в – Зырянец.

Figure 3. 30-day-old potato plants: a - Vychegodsky variety; б - Pechorsky variety; в - Zyryanets variety.

 

Таблица 2. Характеристика микропобегов, полученных из глазков (на 30 сутки с начала культивирования in vitro)

Table 2. Characteristics of micro-shoots produced from eyeholes (on the 30th day of in vitro cultivation)

Сорт	Средняя высота микропобегов, см	Образование корней, %	Индекс роста (I)	Удельная скорость роста (µ)
Зырянец	2.3±0.2	100	13.3	0.080
Печорский	5.0±0.1	100	15.7	0.084
Вычегодский	0.5±0	100	4.0	0.020

 

Таблица 3. Характеристика микропобегов, полученных из черенков и верхушек побегов, изолированных с интактных растений картофеля (на 20 сутки с начала культивирования in vitro)

Table 3. Characteristics of micro-shoots produced from cuttings and shoot tip isolated from the intact potato plants (on the 20th day of in vitro cultivation)

Сорт	Средняя высота микропобегов, см	Образование корней, %	Индекс роста (I)	Удельная скорость роста (µ)
Зырянец	2.5±0.2	35.3±2.3	7, 3	0.11
Печорский	3.9±0.3	21.4±1.7	12.0	0.13
Вычегодский	2.6±0.2	60.0±3.1	7.7	0.12

 

Следует отметить, что изучаемые сорта картофеля проявляли разную морфогенетическую активность в культуре in vitro, которую оценивали по таким показателям, как высота микропобегов (см), образование корней (%), индекс роста (I) и удельная скорость роста (µ) (табл. 2, 3); (рис. 4–7).

 

Рисунок 4. Формирование микропобегов картофеля in vitro из изолированных глазков через семь суток с начала культивирования, сорта: а – Печорский; б – Зырянец; в – Вычегодский.

Figure 4. In vitro formation of potato microshoots from isolated eyeholes in 7 days from the beginning of cultivation: a – Pechorsky variety; б – Zyryanets variety; в – Vychegodsky variety.

 

Рисунок 5. Формирование микропобегов картофеля in vitro из изолированных глазков через 30 суток с начала культивирования, сорта: а – Печорский; б – Зырянец; в – Вычегодский.

Figure 5. In vitro formation of potato microshoots from isolated eyeholes in 30 days from the beginning of cultivation: a – Pechorsky variety; б – Zyryanets variety; в – Vychegodsky variety.

 

Рисунок 6. Формирование микропобегов картофеля in vitro из изолированных черенков через 20 суток с начала культивирования, сорта: а – Вычегодский; б – Зырянец; в – Печорский.

Figure 6. In vitro formation of potato microshoots from isolated cuttings in 20 days from the beginning of cultivation: a – Vychegodsky variety; б – Zyryanets variety; в – Pechorsky variety.

 

Рисунок 7. Формирование микропобегов картофеля in vitro из изолированных верхушек побегов через 20 суток с начала культивирования, сорта: а – Вычегодский, б – Зырянец, в – Печорский.

Figure 7. In vitro formation of potato microshoots from isolated shoot tops in 20 days from the beginning of cultivation: a – Vychegodsky variety; б – Zyryanets variety; в – Pechorsky variety.

 

Показано, что высокая ответная реакция изолированных эксплантов на условия культивирования была характерна для сорта Печорский. Сорта Зырянец и Вычегодский уступали по всем учитываемым показателям. Причем эта особенность проявлялась при использовании как глазков, так и черенков, и верхушек побегов, изолированных с 14- и 30-суточных интактных растений картофеля. Следует отметить, что в процессе последующего культивирования сформировавшиеся микропобеги сортов Зырянец и Вычегодский продолжали уступать по индексу роста (I) и удельной скорости роста (µ) микропобегам сорта Печорский. Кроме того, для сорта Печорский было характерно образование микроклубней, что не отмечено для двух других исследуемых сортов (рис. 8).

 

Рисунок 8. Микроклубни сорта Печорский in vitro.

Figure 8. Microtubers of the Pechorsky variety in vitro.

 

Установлено, что на процесс ризогенеза оказывает влияние на тип первичного экспланта. Так, при использовании в качестве первичного экспланта глазков наблюдали 100 %-ное образование корней. Это можно объяснить тем, что в первичном экспланте помимо зачатков апикальных и латеральных почек, а также листовых примордиев, в основании побега закладываются корневые меристемы (см. рис. 1), которые на питательном субстрате начинают быстро развиваться и формировать хорошую корневую систему. В случае использования черенков и верхушек побегов укоренение не превышало 60 %, а в базальной части часто наблюдали формирование каллусной ткани.

Заключение

Таким образом, отмеченные нами различия по скорости и интенсивности роста изолированных эксплантов in vitro исследуемых сортов картофеля (Зырянец, Вычегодский, Печорский), вероятно, связаны с их физиолого-биохимическими особенностями. Кроме того, в культуре in vitro выделен образец с повышенным морфогенетическим потенциалом (сорт Печорский), который может быть включен в работу по клеточной и генной инженерии, направленную на создание форм картофеля, обладающих комплексной устойчивостью к факторам абиотической и биотической природы, повышенной продуктивностью и качеством урожая. В связи с этим требуется проведение дальнейших исследований как в культуре in vitro, так и сопоставление полученных данных с результатами полевых наблюдений.

Об авторах

Елена Анатольевна Калашникова

Российский государственный аграрный университет-МСХА имени К. А. Тимирязева

Email: kalash0407@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2655-1789

доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии

 

Россия, 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49

Рима Нориковна Киракосян

Российский государственный аграрный университет-МСХА имени К. А. Тимирязева

Email: mia41291@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5244-4311

кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии

Россия, 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49

Владимир Габдуллович Зайнуллин

Институт агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: zainullin.v.g@yandex.ru

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института агробиотехнологий им. А. В. Журавского

Россия, 167023, Сыктывкар, ул. Ручейная, д. 27

Андрей Алексеевич Юдин

Институт агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН

Email: audin@rambler.ru

кандидат экономических наук, директор Института агробиотехнологий им. А. В. Журавского

Россия, 167023, Сыктывкар, ул. Ручейная, д. 27

Список литературы

Дополнительные файлы