Physiological and biochemical parameters of Erythrocytes in White Sea bearded seals Erignathus barbatus barbatus Erxleben, 1777 (Phocidae) across different age groups

Толық мәтін

Морской заяц атлантического подвида (Erignathus barbatus barbatus Erxleben, 1777) является одним из наименее изученных морских млекопитающих Арктики, несмотря на его широкое распространение. Исследованиям этого вида уделяется меньше внимания, чем другим представителям ластоногих. Отдельные работы посвящены изучению распределения, численности, репродуктивной биологии и некоторым аспектам физиологии дыхания (Andersen et al., 1999; Charrier et al., 2013; Светочева и др., 2017; Charmain et al., 2018; Светочев, Кавцевич, 2019). В литературе практически отсутствуют сведения о метаболических характеристиках крови этих животных. В последние годы появились данные о составе крови морских зайцев Белого моря (Минзюк и др., 2015; Erokhina, Kavtsevich, 2019), Аляски (Goertz et al., 2019) и Шпицбергена (Tryland et al., 2021) в связи с оценкой физиологического состояния животных. Развитие такого рода исследований обусловлено интересом к вопросу использования морских млекопитающих, наряду с другими гидробионтами, в качестве видов – индикаторов состояния морских экосистем. Многочисленные публикации (Fair, Becker, 2000; Johannessen, Miles, 2011; Рожнов, 2015; Goertz et al., 2019) называют поиск чувствительных индикаторов экологического неблагополучия одним из центральных вопросов в мониторинге природных популяций животных. Неотъемлемой составляющей подобных работ является исследование крови как один из доступных и эффективных методов прижизненной оценки состояния животных в естественной среде обитания. Полученные физиолого-биохимические параметры принимаются в качестве референтных и в дальнейшем используются в системе оценки уровня нагрузки на животных различных природных и антропогенных факторов.

Ранее нами были получены данные о биохимическом составе плазмы крови у морских зайцев, обитающих в Белом море (Erokhina, Kavtsevich, 2019). Цель данной работы – характеристика показателей метаболизма эритроцитов этих животных.

Материалы и методы

Кровь морских зайцев была получена во время экспедиций в Онежский залив Белого моря в июле 2014‒2015 гг. у животных следующих возрастных групп: 3 года (молодые, n = 4), 5 лет (половозрелые, n = 4), 10 лет (взрослые, n = 3). С животными обращались в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (1986). Тюлени были пойманы на линии морского побережья вручную с помощью обручной сетки, без предварительной иммобилизации. Все животные были в адекватном состоянии здоровья (без внешних признаков болезни). Возраст тюленей оценивался по размеру тела и состоянию когтей на передних ластах. Образцы крови брали из экстрадуральной внутрипозвоночной вены с помощью спинальной иглы (1.2 × 90 мм), а затем сразу же помещали в пробирки для сбора крови, используя гепарин в качестве антикоагулянта. Эритроциты получали через 2–4 часа после взятия крови. Плазму отделяли центрифугированием в течение десяти минут со скоростью 1500 об/мин. Эритроциты троекратно отмывали охлажденным изотоническим раствором хлористого натрия. Для этого к осадку эритроцитов добавляли двукратный объем физиологического раствора. Пробы центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость. Осмотическую стойкость эритроцитов определяли в день отбора проб. В этот же день получали гемолизаты эритроцитов и замораживали их. Определение метаболитов в гемолизатах после размораживания проводили в стационарных лабораторных условиях через 2‒3 недели.

Осмотическую стойкость эритроцитов оценивали методом, основанным на определении степени гемолиза в среде с разным объемным содержанием изотонических растворов хлористого натрия и мочевины (Камышников, 2000). Гемолизаты эритроцитов получали по методу Драбкина (Drabkin, 1949). Биохимические показатели в гемолизатах эритроцитов определяли на анализаторе ROKI (Беларусь), используя наборы реагентов для биохимических исследований производства НПФ “Абрис+” (Россия). Содержание глюкозы и молочной кислоты определяли энзиматическими колориметрическими методами, кальция – по реакции с хромогеном Арсеназо III, фосфора – реакцией с молибдатом аммония, магния – реакцией с ксилидиловым синим, натрия – реакцией с уранилацетатом, калия – турбидиметрическим методом реакцией с тетрафенилборатом (Энциклопедия…, 1997).

Статистическую обработку цифрового материала проводили методами вариационной статистики с использованием программ Microsoft Excel Windows XP и Statistica 6.0. О нормальности распределения судили по показателям асимметрии и эксцесса. Достоверность различий между средними величинами оценивали при помощи критерия Стьюдента, различия при р < 0.05 рассматривались как статистически значимые.

Результаты и обсуждение

Осмотическая стойкость эритроцитов (ОСЭ) является интегральным тестом, характеризующим изменение антиоксидантного статуса организма, и претерпевает сдвиги в сторону снижения при многих физиологических и патологических состояниях, сопровождающихся активацией свободнорадикального окисления липидов. Полученные показатели осмотической стойкости эритроцитов морских зайцев представлены в виде кривых гемолиза, характеризующих зависимость степени гемолиза (%) от концентрации гемолизирующего агента (рис. 1).

Рис. 1. Осмотическая стойкость эритроцитов морских зайцев различного возраста

Эритроциты морских зайцев так же, как и у других видов морских млекопитающих (Ерохина, Кавцевич, 2007), более чувствительны к гемолизирующим воздействиям по сравнению с наземными животными и человеком, что выражается в сдвиге кривой гемолиза влево. Количество гемолизированных эритроцитов достигает от 18 до 50% в разных возрастных группах даже при минимальном содержании гемолизирующего агента, тогда как для эритроцитов человека этот показатель в норме не более 3% (Камышников, 2000). При этом ОСЭ изменяется в процессе развития животных, повышаясь с возрастом (рис. 1). В наибольшей степени возрастные различия в чувствительности эритроцитарных мембран к гемолизу проявляются при низких концентрациях гемолизирующего агента (40‒50% по объему). Повышение с возрастом устойчивости эритроцитов к гемолизу вполне объяснимо известным фактом совершенствования процессов регуляции, направленных на контролирование метаболизма с целью быстрой приспособляемости его к условиям окружающей среды.

Особенности реагирования эритроцитарных мембран морских млекопитающих на гемолизирующие воздействия объясняют химическим составом, в частности высоким содержанием лецитина, что способствует повышенной проницаемости клеток и более активному обмену эритроцитов с окружающей средой (Гелетюк и др., 1972). Кроме того, в процессе гемолиза определенное значение может иметь содержание гемоглобина в эритроцитах и его способность связывать кислород (Куликов и др., 1988). Представляется, что появляющиеся в крови супероксидные анионы взаимодействуют с оксигемоглобином, в результате чего происходит образование метгемоглобина и перекиси водорода. Образующийся комплекс обладает свойствами сильного окислителя и отвечает за гемолиз эритроцитов. Повышенное по сравнению с наземными животными содержание гемоглобина в эритроцитах морских млекопитающих (особенно ластоногих) в свете вышеупомянутых представлений может частично объяснять низкую осмотическую стойкость эритроцитов последних.

Состояние мембран зависит и от внутриэритроцитарного метаболизма. Глюкоза является основным субстратом, а молочная кислота – конечным продуктом гликолиза, единственного пути получения энергии в этих клетках. Содержание глюкозы в эритроцитах морских зайцев находится в пределах 0.40‒0.71 ммоль/л, что существенно ниже, чем у дельфинов-афалин соответствующего возраста, в эритроцитах которых уровень глюкозы достигает 5.06 ± 0.08 ммоль/л (Каганова и др., 2002), и у наземных млекопитающих (4.42 ± 0.55 ммоль/л у крыс) (Скверчинская и др., 2013). Не исключено, что такое низкое содержание связано с выходом глюкозы из эритроцитов для поддержания ее нормального уровня в плазме крови. Однако сведений об этом в литературе не найдено. К тому же известно о роли адсорбционно-транспортной функции эритроцитов в поддержании уровня метаболитов плазмы, когда избыточная часть отдельных соединений адсорбируется на мембране эритроцита и по мере необходимости может транспортироваться обратно в плазму. Наши исследования смывов с эритроцитарных мембран у морских зайцев показали присутствие глюкозы в пределах 0.2‒0.4 ммоль/л (неопубликованные данные), что сопоставимо с данными у других видов млекопитающих. Маловероятно, что для предотвращения критического снижения уровня глюкозы в плазме происходит транспорт ее из внутриэритроцитарного пула. К тому же острой необходимости в этом нет, судя по содержанию глюкозы в плазме исследованных животных (1.9‒5.2 ммоль/л) (Erokhina, Kavtsevich, 2019), сопоставимому с данными (Tryland et al., 2021) для взрослых морских зайцев (2.89‒10.71 ммоль/л). Очевидно, этот вопрос требует дальнейшего изучения. При этом возрастные изменения данного показателя имеют однонаправленный характер – как и у представителя китообразных, у представителя ластоногих морского зайца в старшем возрасте концентрация глюкозы в эритроцитах снижается (p < 0.001) (рис. 2). Отметим заметное (более чем в полтора раза) повышение (p < 0.001) уровня глюкозы к 5-летнему возрасту, очевидно, связанное с общей интенсификацией метаболизма в период полового созревания, и в дальнейшем уменьшение (p < 0.001) значения этого показателя к 10-летнему возрасту. Такие же изменения наблюдаются и в содержании в эритроцитах морских зайцев конечного продукта гликолиза – молочной кислоты (рис. 2).

Рис. 2. Содержание метаболитов гликолиза в гемолизатах эритроцитов морских зайцев различного возраста. Здесь и далее знаком “*” отмечены статистически значимые различия по сравнению с предыдущим периодом развития

Таким образом, судя по этим двум показателям, интенсивность гликолитических реакций в эритроцитах морских зайцев с возрастом снижается, как и у других млекопитающих и человека (Коркушко и др., 2009).

Кроме метаболитов гликолиза определяли уровень катионов, играющих важную регуляторную роль в эритроцитах. Содержание натрия в эритроцитах изученных морских зайцев находится в пределах 19.58‒22.37 ммоль/л, калия – 74.41‒96.57 ммоль/л (рис. 3).

Рис. 3. Содержание натрия и калия в гемолизатах эритроцитов морских зайцев различного возраста

Для сравнения, в эритроцитах человека концентрация натрия в норме 13‒22 ммоль/л, калия – 79.8‒99.3 ммоль/л (Лифшиц, Сидельникова, 2006), в эритроцитах ряда пресноводных рыб концентрация натрия 18.2‒65.6 ммоль/л, калия – 65.7‒111.0 ммоль/л (Запруднова, 2017). Соотношение ионов натрия и калия в клетке оказывает, наряду с другими факторами, существенное влияние на активность Na⁺, K⁺-АТФазы. Этому ферменту принадлежит ведущая роль в поддержании объема и формы эритроцитов как важного условия их функциональной активности. Показано, что основную регуляторную роль в активности Na⁺, K⁺-АТФазы играют ионы калия, а ионы натрия оказывают незначительное влияние (Мосягин и др., 2010). У изученных морских зайцев содержание натрия в эритроцитах не изменяется с возрастом, тогда как концентрация калия статистически значимо (p < 0.001) увеличивается у взрослых животных. Мы не располагаем сведениями об ионном составе эритроцитов у других видов морских млекопитающих, поэтому можем сравнивать полученные результаты лишь с данными для эритроцитов человека. Так, у человека с возрастом концентрация внутриэритроцитарного натрия увеличивается, а калия – уменьшается вследствие торможения гликолиза и уменьшения концентрации АТФ. При этом снижается активность Na⁺, K⁺-АТФазы, что приводит к выходу K⁺ и входу Na⁺ в клетку (Коркушко и др., 2009). Возможно, что наблюдаемое у морских зайцев повышение с возрастом уровня внутриэритроцитарного калия обеспечивает, наряду с другими механизмами, устойчивость к гипоксии, как это описано для рыб (Запруднова, 2017).

Уровень кальция в эритроцитах морских зайцев статистически значимо увеличивается к 10-летнему возрасту (рис. 4), косвенно указывая на интенсификацию работы калий-натриевого насоса в клетках (Engelman, Duhm, 1987). Содержание фосфора в эритроцитах взрослых животных не отличается от такового в возрасте 3 года, при этом статистически значимо снижается вдвое в период полового созревания (5 лет). Концентрация магния в эритроцитах снижается к 10-летнему возрасту. Как известно (Мисюра, Богданова, 1997), с ионами магния связана часть фосфатных соединений эритроцитов. Магний снижает сродство фосфатов к гемоглобину, тем самым повышая сродство последнего к кислороду. Можно предположить, что кислородсвязывающая способность гемоглобина в эритроцитах молодых животных регулируется магнием, влияние которого снижается к тому моменту, когда эта способность поддерживается за счет высокой концентрации гемоглобина.

Рис. 4. Содержание кальция, фосфора и магния в гемолизатах эритроцитов морских зайцев различного возраста

Таким образом, исследование ряда показателей метаболизма эритроцитов у морских зайцев различного возраста показало, что устойчивость мембран эритроцитов к гемолизирующим воздействиям повышается к периоду полового созревания и в дальнейшем сохраняется на том же уровне. Установлено, что в эритроцитах морских зайцев в период полового созревания интенсивность гликолиза повышается и затем снижается у взрослых животных. С возрастом изменяется концентрация некоторых катионов – повышается уровень внутриэритроцитарного калия, но снижается содержание магния. Предполагается, что эти изменения отражают роль регуляторных катионов в устойчивости к гипоксии и кислородсвязывающей способности гемоглобина в эритроцитах.

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории морских млекопитающих ММБИ РАН Н. Н. Кавцевичу, В. Н. Светочеву, О. Н. Светочевой за отбор и первичную обработку проб крови животных во время экспедиций.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках темы госзадания ММБИ РАН “Экология и физиология морских млекопитающих арктических морей” (№ гос. регистрации 121091600101-6).

Этическое одобрение

Исследование одобрено комиссией по биоэтике Мурманского морского биологического института РАН (Заключение № 2 о соответствии исследования действующим международным нормам, рекомендациям, законам и иным нормативным актам Российской Федерации, нормам этического проведения исследований). с использованием животных от 27 декабря 2023 г.).

Конфликт интересов

Автор данной работы заявляет, что у него нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

I. Erokhina

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: irina.erohina58@mail.ru
Ресей, Vladimirskaya st., 17, Murmansk, 183010

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар

Әрекет

1. JATS XML

Жүктеу

2. Fig. 1. Osmotic resistance of erythrocytes of sea hares of different ages

Жүктеу (172KB)

Метадеректер

3. Fig. 2. Content of glycolytic metabolites in hemolysates of erythrocytes of sea hares of different ages. Here and below, the sign “*” indicates statistically significant differences compared to the previous period of development

Жүктеу (111KB)

Метадеректер

4. Fig. 3. Sodium and potassium content in hemolysates of erythrocytes of sea hares of different ages

Жүктеу (118KB)

Метадеректер

5. Fig. 4. Contents of calcium, phosphorus and magnesium in hemolysates of erythrocytes of sea hares of different ages

Жүктеу (91KB)

Метадеректер