Effects of stearic acid on the cryotolerance of the domestic cat (Felis silvestris catus) embryos

Толық мәтін

У ряда млекопитающих, в частности у таких важных сельскохозяйственных животных, как свинья (Sus scrofa, L., 1758), лошадь (Equus caballus, L., 1758), а также у всех изученных представителей отряда Carnivora ооциты и преимплантационные эмбрионы содержат большое количество внутриклеточных липидов (Genicot et al., 2005; Amstislavsky et al., 2019; Lawson et al., 2022). Для большинства из этих видов существуют проблемы, связанные с криоконсервацией их эмбрионов (Nagashima et al., 1995; Amstislavsky et al., 2019; Borges, Vireque, 2019; Idrissi et al., 2021). Поиск механизмов, лежащих в основе низкой криоустойчивости эмбрионов богатых липидами, важен для зоологии и сравнительной эмбриологии, а в практическом плане необходим для успешной консервации генетических ресурсов ряда видов млекопитающих (Abe et al., 2002; Амстиславский и др., 2017; Amstislavsky et al., 2019; Borges, Vireque, 2019; Idrissi et al., 2021; Igonina et al., 2021).

Семейство Felidae включает множество уязвимых и исчезающих видов (IUCN, 2021). Домашняя кошка (Felis silvestris catus, L., 1758) является модельным объектом для исследований, направленных на реализацию концепции сохранения генетических ресурсов диких видов кошачьих путем криоконсервации гамет и эмбрионов (Amstislavsky et al., 2018; Mokrousova et al., 2020а; 2020б; Окотруб и др., 2022). В ооцитах и преимплантационных эмбрионах исследованных видов кошачьих содержится большое количество внутриклеточных липидов (Crichton et al., 2003; Kochan et al., 2021; Zahmel et al., 2021). Эксперименты, проводимые на домашней кошке, могут способствовать пониманию особенностей криоконсервации эмбрионов других представителей семейства кошачьих.

Внутриклеточные липидные гранулы (ЛГ) чувствительны к охлаждению и могут подвергаться негативному влиянию криоконсервации (Abe et al., 2002; Amstislavsky et al., 2019; Okotrub et al., 2021), хотя механизмы криоповреждений в эмбрионах, богатых липидами, остаются слабо изученными. Известно, что фазовый переход воды во время процесса охлаждения связан с повреждением клеток и снижением их жизнеспособности (Mazur, 1990). Подобно кристаллизации водного раствора при охлаждении, в клетках эмбрионов происходит и фазовый переход липидов (ФПЛ), которые содержаться в больших количествах в ЛГ (Amstislavsky et al., 2019). Это может инициировать повреждения, связанные с перераспределением и упорядочением молекул липидов (Okotrub et al., 2018). Одной из стратегий снижения повреждения клеток является полное или частичное удаление из них внутриклеточных липидов (Nagashima et al., 1995; Galiguis et al., 2014; Borges, Vireque, 2019). Другая стратегия состоит в том, чтобы изменить липидный состав ЛГ и тем самым улучшить результаты криоконсервации ооцитов и преимплантационных эмбрионов. В некоторых исследованиях показано, что воздействие in vitro ненасыщенными жирными кислотами (ЖК), в частности линолевой (ЛК) и олеиновой кислот (ОК), улучшает развитие эмбрионов и повышает их жизнеспособность после криоконсервации у разных видов млекопитающих (Fayezi et al., 2018; Karasahin, 2019; Yousif et al., 2020). Насыщенные ЖК оказывают противоположное влияние на развивающиеся эмбрионы млекопитающих (Shehab-el-Deen et al., 2009; Van Hoeck et al., 2011; Aardema et al., 2022). Например, воздействие in vitro пальмитиновой (ПК) и/или стеариновой кислот (СК) увеличивает уровень апоптоза и уменьшает число клеток у эмбрионов крупного рогатого скота и негативно влияет на их развитие (Van Hoeck et al., 2011; Desmet et al., 2016; Aardema et al., 2022). Более того, криоустойчивость эмбрионов крупного рогатого скота значительно ниже после дозревания in vitro ооцитов и/или при культивировании in vitro таковых с СК (Shehab-el-Deen et al., 2009; Aardema et al., 2022).

В работе на ооцитах домашней кошки показано, что во время их охлаждения внутриклеточные ЛГ подвергаются фазовому переходу и фазовой сепарации. После охлаждения более насыщенные липиды в составе ЛГ подвергаются фазовой сепарации раньше, чем ненасыщенные (Mokrousova et al., 2020а). В недавней работе на ооцитах домашних кошек было показано, что после добавления СК во время их дозревания in vitro и последующей криоконсервации при помощи программного замораживания, часть насыщенных липидов может оставаться в упорядоченном конформационном состоянии после оттаивания (Okotrub et al., 2021). Тем не менее влияние СК в ходе культивирования in vitro эмбрионов домашних кошек на их жизнеспособность после криоконсервации проверено не было.

Существуют отдельные наблюдения, показывающие, что снижение температуры начала ФПЛ (T*) повышает криоустойчивость репродуктивных клеток (Zeron et al., 2002). На нескольких видах млекопитающих выявлено, что T* зависит от степени ненасыщенности липидов (Zeron et al., 2002; Igonina et al., 2021; Окотруб и др., 2022). В нашей работе на эмбрионах домашней кошки показано, что воздействие на них ЛК при культивировании in vitro вызывает увеличение степени ненасыщенности внутриклеточных липидов, что в свою очередь приводит к снижению T* и более эффективной криоконсервации эмбрионов домашних кошек (Окотруб и др., 2022). В настоящей работе мы планируем проверить, как сдвиг в противоположном направлении – в сторону более насыщенных внутриклеточных липидов – будет влиять на T* и на эффективность криоконсервации эмбрионов домашних кошек.

Целью данного исследования являлось: 1) определить общее содержание и степень ненасыщенности внутриклеточных липидов эмбрионов домашней кошки после культивирования in vitro с насыщенной СК; 2) измерить T* во время охлаждения эмбрионов домашней кошки после воздействия СК; 3) оценить влияние СК на развитие эмбриона in vitro; 4) исследовать эффективность криоконсервации эмбрионов домашней кошки после культивирования in vitro с СК.

Материалы и методы

Животные

Семенники с эпидидимисами котов, а также яичники кошек получены после плановой орхиэктомии/овариогистерэктомии в центре льготной стерилизации животных г. Новосибирска и доставлены в лабораторию в течение двух часов. Яичники немедленно помещали в среду Collect, т. е. среду М199 (Merck, Германия) с добавлением 20 мМ буфера HEPES (Merck, Германия), 2.2 мМ пирувата натрия (Merck, Германия), 2.2 мМ лактата натрия (Merck, Германия), 3 г/л бычьего сывороточного альбумина – БСА (Merck, Германия) и 50 мкг/мл гентамицина (Синтез АКО, Россия); хранили при 4°C не более четырех часов. Семенники с эпидидимисами немедленно помещали в стерильные сухие пробирки и хранили при 4°C до 24 ч с момента операции. Все исследования соответствовали Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS № 123).

Дозревание ооцитов in vitro

Кумулюс-ооцитные комплексы (КОК) выделяли из фолликулов яичников взрослых беспородных кошек (n = 49), как описано ранее (Mokrousova et al., 2020б; Окотруб и др., 2022), в подогретую до 38.5°C среду Collect с использованием стереомикроскопа S8 APO (Leica Microsystems, Германия). Ооциты с темной и гомогенной цитоплазмой, окруженные пятью или более слоями клеток кумулюса, промывали для удаления дебриса и отбирали для дозревания in vitro. Дозревание осуществляли в среде М199 с добавлением 15 мМ бикарбоната натрия (Merck, Германия), 2.2 мМ пирувата натрия, 2.2 мМ лактата натрия, 3 г/л БСА, 50 мкг/мл гентамицина, 2 МЕ/мл гонадотропина сыворотки жеребых кобыл – “Фоллигон” (Intervet, Нидерланды) и 10 МЕ/мл хорионического гонадотропина человека – “Хорулон” (Intervet, Нидерланды). Далее КОКи (по 10–15 на лунку) переносили в 4-луночные планшеты (Nunc, США) с предварительно уравновешенной средой для дозревания под минеральным маслом FertiCult Mineral Oil (FertiPro, Бельгия) и помещали в СО₂-инкубатор New Brunswick™ Galaxy 48R (Eppendorf, Германия) при 38.5°C, 5% CO₂ и влажности 90% на 24 ч.

Получение сперматозоидов и экстракорпоральное оплодотворение

Сперматозоиды были получены из каудальных частей эпидидимисов взрослых беспородных котов (n = 5), как описано ранее (Brusentsev et al., 2018). Каудальные части эпидидимидов извлекали, переносили на чашку Петри (Corning, США) в 1000 мкл среды Collect и измельчали при 38.5°C. Образцы эпидидимального семени наносили на верхний мениск среды ISolate Sperm Separation Medium (FUJIFILM Irvine Scientific, США) с градиентом плотности 40: 80% и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осадок собирали и перемешивали с 1000 мкл среды Collect, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин для удаления оставшихся коллоидных частиц. Супернатант удаляли, а осадок со сперматозоидами использовали для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Концентрацию сперматозоидов и их подвижность определяли в счетной камере Маклера – Makler Chamber (Origio, Дания). Созревшие ооциты переносили в 4-луночные планшеты с предварительно уравновешенной средой Ham’s F-10 (Merck, Германия) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (Merck, Германия) и 50 мкг/мл гентамицина под минеральным маслом FertiCult Mineral Oil (FertiPro, Бельгия). Суспензию сперматозоидов с концентрацией 1 ‧ 10⁶ подвижных сперматозоидов/мл добавляли к 10–15 ооцитам в лунку планшета объемом 500 мкл и инкубировали в CO₂-инкубаторе New Brunswick™ Galaxy 48R (Eppendorf, Германия) при 38.5°C, 5% CO₂ и влажности 90% в течение 21 ч.

Приготовление раствора стеариновой кислоты

Раствор стеариновой кислоты готовили в соответствии с опубликованным ранее протоколом (Ranneva et al., 2020) с небольшими модификациями. Смешивали 0.01 М СК (Merck, Германия) с 0.01 М гидроксидом калия (“ХимМед”, Россия) на водяной бане при 90°C в течение 60 мин с последующей гомогенизацией ультразвуком (60 мин) на Sonicator Q700 (Qsonica, США) с получением 0.01 М раствора стеарата калия. Сеансы нагревания и гомогенизации ультразвуком чередовали несколько раз в течение 5–6 ч до достижения необходимой консистенции мыльного раствора. Полученный раствор инкубировали с 3.3 мМ БСА (свободного от ЖК) с получением 5 мМ раствора СК-БСА в соотношении 3: 1. Приготовленную смесь добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 400 мкМ.

Культивирование эмбрионов in vitro

Дизайн эксперимента представлен графически на рис. 1.

 

Рис. 1. Дизайн эксперимента. ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение; ФПЛ – фазовый переход липидов

 

Двухклеточные эмбрионы, полученные после ЭКО, были случайным образом распределены между двумя группами: контрольной (n = 48) и экспериментальной (СК; n = 46). Культивирование проводили в 20 мкл среды CSCM–C (FUJIFILM Irvine Scientific, США) с добавлением 400 мкМ СК (СК-группа) и без нее (контроль) в СО₂-инкубаторе Galaxy 48R (Eppendorf, Германия) при 38.5°C, 5% СО₂ и влажности 90% в течение 66 ч. Сразу после этого периода культивирования in vitro 17 и 19 эмбрионов (из контрольной и СК-группы соответственно) фиксировали в 400 мкл 4%-го параформальдегида (“ХимМед”, Россия), рН 7.4–7.6, разведенного в фосфатно-солевом буфере – PBS (“Росмедбио”, Россия), с предварительной отмывкой в трех каплях PBS (по 3 мин в каждой капле). Развитие эмбрионов оценивали с помощью окрашивания DAPI с последующей флуоресцентной микроскопией. После культивирования in vitro в течение 66 ч с СК (n = 8) или без нее (n = 11) в эмбрионах оценивали общее содержание липидов с помощью окрашивания нильским красным (Nile Red) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Восемь эмбрионов (пять из контрольной и три из СК-группы) использовали для изучения степени ненасыщенности липидов и T* с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС).

Эмбрионы как в контрольной группе (n = 18), так и в СК-группе (n = 13) после 66 ч культивирования in vitro замораживали, затем оттаивали, культивировали в течение дополнительных 30 ч и фиксировали, как описано выше. Общее время культивирования этих эмбрионов составило 96 ч. Развитие эмбрионов до и после криоконсервации оценивали с помощью окрашивания DAPI с последующей флуоресцентной микроскопией.

Криоконсервация эмбрионов

Для программного замораживания эмбрионов использовали раствор криопротектора, содержащий 10% пропиленгликоля – ПГ (“ХимМед”, Россия) в среде Collect. Эмбрионы как контрольной, так и СК-группы переносили в среду Collect на 5 мин, после чего переносили в раствор криопротектора, разбавленный средой Collect в соотношении 1: 1 на 5 мин; затем в неразбавленный раствор криопротектора еще на 5 мин, после чего помещали в 0.25-мл пластиковую соломину (CryoBioSystem, Франция). Все эти процедуры уравновешивания проводили при комнатной температуре. Соломину с эмбрионами помещали в программный замораживатель CL-8800 (CryoLogic, Австралия) при 0°C, охлаждали со скоростью 2°C/мин до –8°C и выдерживали в течение 5 мин. В этот период прикасались к верхней части соломины (под пыжом и к верхнему мениску второго сектора) предварительно охлажденным в жидком азоте (LN₂) пинцетом для инициации кристаллизации льда. Затем охлаждение возобновляли со скоростью 0.3°C/мин до –40°C, после чего со скоростью 6°C/мин до –80°C. После этого соломины с эмбрионами помещали в LN₂. Для оттаивания соломины извлекали из LN₂, выдерживали на воздухе при комнатной температуре в течение 40 с, а затем в течение 40 с на водяной бане при 30ºС, как описано ранее (Renard, Babinet, 1984). Эмбрионы отмывали от криопротектора, перенося их между каплями растворов с разным соотношением 10% ПГ и 1М сахарозы (“ХимМед”, Россия) на основе среды Collect (по шесть минут в каждой капле): 1) 40 мкл 10% ПГ и 20 мкл 1 М сахарозы, 2) 40 мкл 10% ПГ, 20 мкл 1 М сахарозы и 30 мкл Collect, 3) 20 мкл 1 М сахарозы и 60 мкл Collect, 4) 50 мкл Collect.

Окрашивание эмбрионов DAPI и флуоресцентная микроскопия

Фиксированные эмбрионы трижды отмывали от параформальдегида при комнатной температуре в PBS с добавлением 1 мг/мл поливинилпирролидона – ПВП (Merck, Германия) в течение 5 мин, а затем инкубировали с 2 мг/мл DAPI в течение 5 мин. После этого эмбрионы снова отмывали и переносили на предметные стекла (“МиниМед”, Россия). Образцы оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Imager.M2 (Carl Zeiss, Германия) с фильтром, подходящим для окрашивания DAPI, камеры AxioCam 506 mono (Carl Zeiss, Германия) и программы ImageJ (США). Работу проводили в Центре коллективного пользования SPF-вивария Института цитологии и генетики – ИЦиГ СО РАН (http://spf.bionet.nsc.ru).

Для каждого эмбриона подсчитывали число интерфазных ядер (ИЯ), фрагментированных ядер (ФЯ) и общее число ядер (ОЯ), т. е. сумму ИН, ФЯ и митозов. Индекс фрагментации (ИФ) оценивали как долю ядерных фрагментов к общему числу ядер. По общему числу ядер (Roth et al., 1994; Swanson et al., 1994; Mokrousova et al., 2020б) эмбрионы были разделены на следующие группы: неразвивающиеся, остановившиеся в своем развитии (менее 8 ядер), эмбрионы на стадии дробления (9–16 ядер), ранние морулы (17–50 ядер) и поздние морулы (более 50 ядер).

Окрашивание нильским красным и конфокальная микроскопия

Оценку изменений внутриклеточного содержания липидов у эмбрионов домашней кошки через 66 ч культивирования in vitro с СК и в контроле (без СК) проводили с использованием флуорохрома нильского красного – Nile Red (Merck, Германия) с последующей КЛСМ, как описано ранее (Genicot et al., 2005; Igonina et al., 2021; Окотруб и др., 2022). Фиксированные эмбрионы трижды отмывали от параформальдегида в PBS, содержащем 1 мг/мл ПВП, по 5 мин в каждой капле при комнатной температуре. Исходный раствор нильского красного (1 мг/мл) готовили при помощи разбавления красителя в диметилсульфоксиде (“ХимМед”, Россия) и разбавляли до рабочей концентрации 10 мкг/мл перед исследованием. Эмбрионы инкубировали в рабочем растворе в течение трех часов при 37°C для достижения максимальной интенсивности окрашивания внутриклеточных липидов, как описано ранее (Genicot et al., 2005). Образцы помещали на предметные стекла (Thermo Fisher Scientific, США) в PBS. Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 780 NLO Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения Zen 2012 Black Edition (Carl Zeiss, Германия). Эмбрионы, окрашенные нильским красным, облучали аргоновым газовым лазером с длиной волны 488 нм (максимальная мощность 30 мВт) при 0.1% максимальной мощности, которая оставалась постоянной во время процедуры. Спектры получали в диапазоне длин волн 494–687 нм с шагом 9 нм. Изображения получали с помощью 32-канального фотоумножителя с использованием режима сканирования Z-stack и Lambda. Все изображения получали в режиме подсчета фотонов (photon counting), подсчитывали сумму всех фотонов со ста оптических срезов на каждый эмбрион. Суммирование оптических срезов и вычитание фоновой флуоресценции выполняли с помощью программы ImageJ. Работу проводили в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН (https://ckp.icgen.ru/ckpmabo).

Спектроскопия комбинационного рассеяния света

Спектроскопию КРС проводили на экспериментальной установке, состоящей из прямого микроскопа Orthoplan (Leitz, Германия), оснащенного сканирующим пьезопозиционером PXY-200 (Newport, США) и монохроматором SP2500i (Princeton Instruments, США), снабженным зарядным устройством, сопряженным с инструментальным детектором Spec-10:2K/LN (Princeton Instruments, США). Оптический криостат THMS350V (Linkam Scientific, Великобритания) использовали для проведения измерений КРС при разных температурах. Источником монохроматического излучения для возбуждения комбинационного рассеяния света служил твердотельный лазер Excelsior (Spectra-Physics, США) с длиной волны 532.1 нм. Фокусировку лазерного луча в пятно диаметром ~1 мкм осуществляли с помощью ×60 объектива CFI Plan Fluor 60XC (Nikon Instruments, Япония) с числовой апертурой 0.85. Мощность облучения после объектива составляла 20 мВт. Спектральное разрешение экспериментальной установки составляло 2.5 см^–1. Длины волн всех измеренных спектров калибровали с помощью неоновой газоразрядной лампы. Спектры комбинационного рассеяния света измеряли в диапазоне от 800 до 3200 см^–1.

Оценка вклада и степени ненасыщенности липидов

Пять контрольных и три эмбриона СК-группы, культивированных в течение 66 ч, исследовали методом спектроскопии комбинационного рассеяния света. Для изучения внутриклеточных липидов было исследовано 100 спектров комбинационного рассеяния от разных случайно выбранных локальных областей внутри эмбрионов. Из полученного набора данных, используя метод главных компонент, был извлечен вклад липидов. Поскольку наиболее интенсивный сигнал комбинационного рассеяния света исходит от липидных гранул, мы предполагаем, что полученная спектральная составляющая липидов в основном связана именно с ними. Метод выделения вклада липидов в спектры комбинационного рассеяния света был описан в нашей более ранней работе (Igonina et al., 2021). Его принцип следующий: чтобы извлечь вклад липидов, мы уменьшили размерность данных КРС до трех основных главных компонент, связанных с вариацией в спектрах трех основных типов соединений: липидов, белков и воды, которые дают наиболее интенсивный вклад в измеряемые спектры. Затем подбирали такую линейную комбинацию этих компонент, чтобы результирующий спектр был свободен от пика фенилаланина при 1004 см^-1 и полосы валентных колебаний ОН-группы воды на частотах выше 3050 см^-1. Поскольку в спектре комбинационного рассеяния света липидов отсутствуют линии на этих частотах, полученная комбинация главных компонент будет отражать липидный вклад в измеряемые спектры. Для оценки степени ненасыщенности липидов использовали соотношение интенсивностей линии валентных колебаний связей С=С при 1657 см^–1 к линии ножничных деформационных колебаний СН₂ (δСН). Интенсивность первой линии увеличивается с увеличением числа двойных связей С=С, интенсивность второй линии увеличивается с увеличением числа метиленовых групп. Для характеристики ненасыщенности были использованы спектры комбинационного рассеяния, измеренные при Т = 25°C.

Измерение температуры начала фазового перехода липидов при охлаждении эмбрионов

Для изучения зависимости фазового состояния липидов от температуры эмбрионы помещали в раствор EmbryoMax KSOM (Merck, Германия) с добавлением 0.2 М сахарозы и 1.5 М ПГ. Охлаждение проводили до –7°C со скоростью 1°C/мин, затем инициировали образование льда, делали 10-минутную паузу для перекристаллизации льда. После этого образец охлаждали со скоростью 0.3°C/мин. При охлаждении делали дополнительные паузы ~20 мин для измерения спектров КРС. За изменением фазового состояния липидов следили по соотношению интенсивностей антисимметричных (aCH) и симметричных (sCH) валентных колебаний CH₂ при 2880 и 2850 см^–1 соответственно. Эта особенность в спектрах КРС отражает изменение конформационного состояния липидов, происходящее при фазовом переходе. Поскольку фазовый переход уширен, отслеживали температуру начала фазового перехода (T*), т. е. температуру, при которой появляется пик (Okotrub et al., 2018). Предварительная обработка данных включала коррекцию всплесков интенсивности в измеренных спектрах и вычитание фона по линейной функции. Спектры анализировали и обрабатывали, как описано ранее (Okotrub et al., 2018; Igonina et al., 2021).

Статистический анализ

Данные проверяли на нормальное распределение с помощью критерия Шапиро – Уилка и анализировали с помощью стандартного пакета программ STATISTICA v 8.0 (StatSoft Inc., США). Группы с нормальным распределением сравнивали по t-критерию Стьюдента, в противном случае по U-критерию Манна – Уитни. Такие параметры, как доля эмбрионов на разных стадиях развития до и после замораживания, сравнивали с помощью критерия хи-квадрат. Данные по индексу фрагментации ядер до криоконсервации, числу клеток в морулах и бластоцистах до и после криоконсервации, степени ненасыщенности липидов и температуры начала фазового перехода липидов представляли в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (M ± SEM). Различия по этим параметрам между группами сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Данные по индексу фрагментации ядер после криоконсервации и интенсивности флуоресценции липидов (по числу фотонов) представлены в виде медианы и 25–75%-х квартилей – Me [Q1; Q3]. В этих случаях сравнения проводили по U-критерию Манна – Уитни. Различия при p < 0.05 считали статистически значимыми. Для создания графиков использовали пакеты OriginPro (OriginLab Corporation, США) и Biorender (https://www.biorender.com).

Результаты исследования

Культивирование эмбрионов in vitro с добавлением стеариновой кислоты

Добавление в культуральную среду 400 мкМ СК не влияло ни на скорость развития эмбрионов, ни на индекс фрагментации ядер (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние стеариновой кислоты (СК) при культивировании in vitro на развитие эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus) и фрагментацию ядер до криоконсервации

Параметры	Группы1
	Контроль	СК
Число эмбрионов	17	19
Неразвивающиеся (%)	0 (0)	1 (5.3)
Дробящиеся (%)	1 (5.9)	0 (0)
Ранние морулы (%)	13 (76.5)	15 (78.9)
Поздние морулы (%)	3 (17.6)	3 (15.8)
ИФ2	5.6 ± 1.3	6.9 ± 1.5

Примечание. ¹Общее число использованных самок – 49. Число повторов – пять. Эмбрионы были случайным образом распределены между группами.

²Данные по индексу фрагментации (ИФ) представлены в виде M ± SEM для эмбрионов контрольной и СК-группы (n = 16 и n = 18 соответственно).

 

Статистический анализ не выявил достоверных различий по числу интерфазных ядер в эмбрионах через 66 ч культивирования in vitro между СК-группой и контролем (табл. 2, рис. 2).

 

Таблица 2. Влияние стеариновой кислоты (СК) при культивировании in vitro на развитие эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus) до и после криоконсервации

Группы	Число ядер до криоконсервации, культивирование in vitro – 66 ч
	Ранние морулы			Поздние морулы
	Число эмбрионов	ОЯ	ИЯ	Число эмбрионов	ОЯ	ИЯ
Контроль	13	38.2 ± 2.4	35.0 ± 2.5	3	62.0 ± 3.5	56.7 ± 3.8
СК	15	36.1 ± 2.2	33.1 ± 2.3	3	66.0 ± 6.0	59.7 ± 3.3
Число ядер после криоконсервации, культивирование in vitro – 96 ч
Контроль	4	38.8 ± 4.1	22.3 ± 9.1	13	80.6 ± 3.5	58.9 ± 5.1
СК	8	36.5 ± 4.0	2.5 ± 1.4*	4	54.3 ± 0.8**	3.5 ± 1.3***

Примечание. Данные представлены как M ± SEM.

ОЯ – общее число ядер; ИЯ – интерфазные ядра.

*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001 по сравнению с контролем.

 

Рис. 2. Стадии развития эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus) после 66 ч культивирования in vitro без (а, в) или со стеариновой кислотой –СК (г, д): ранние морулы (а, б) и поздние морулы (г, д); окрашивание DAPI и флуоресцентная микроскопия. Белые стрелки – фрагментации, стрелки пунктиром – сперматозоиды. Шкала – 50 мкм

 

Анализ фазового перехода липидов и степени их ненасыщенности

Влияние СК на степень ненасыщенности липидов и Т* показано на рис. 3.

 

Рис. 3. Влияние стеариновой кислоты (СК) на степень ненасыщенности липидов (вверху) и Т* (внизу) в клетках преимплантационных эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus). Данные представлены как M ± SEM. Каждая точка соответствует одному эмбриону. *p < 0.05; ***p < 0.001 по сравнению с контролем

 

Степень ненасыщенности внутриклеточных липидов составила I_C=C/I_δCH = 0.96 ± 0.03, а Т* = = 1.6 ± 0.8°C для эмбрионов, культивируемых без ЖК. Добавление 400 мкМ СК в культуральную среду приводило к достоверному снижению (p < 0.05) степени ненасыщенности липидов (I_C=C / Iδ_CH = = 0.74 ± 0.07) по сравнению с контролем; и достоверному увеличению Т* (p < 0.001) более чем на 20°C по сравнению с контролем. Измерения спектров проводили при температуре 25°C и ниже. Точное значение Т* не оценивали, поскольку даже при комнатной температуре фракция липидов находилась в конформационно-упорядоченном состоянии. Таким образом, воздействие СК на эмбрионы кошек in vitro снижало степень ненасыщенности липидов и повышало Т*.

Оценка содержания внутриклеточных липидов

Культивирование in vitro в течение 66 ч с добавлением в питательную среду 400 мкМ СК не влияло на общее количество липидов в эмбрионах домашних кошек (рис. 4).

 

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus), окрашенных нильским красным, через 66 ч культивирования in vitro без и со стеариновой кислотой (СК). а – число фотонов (Me [Q1; Q3]), каждая точка соответствует одному эмбриону; б, в-репрезентативные оптические срезы КЛСМ эмбрионов домашней кошки, окрашенных нильским красным. б – без СК; в-с СК. Шкала – 50 мкм

 

Интенсивность флуоресценции, измеренная как число фотонов, не отличалась между контрольной – 6.4 ‧ 10⁶ [5.5 ‧ 10⁶; 7.3 ‧ 10⁶] и СК-группой – 5.6 ‧ 10⁶ [5.2 ‧ 10⁶; 6.1 ‧ 10⁶].

Жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации

Добавление в питательную среду 400 мкМ СК оказывало влияние (p < 0.05) на развитие эмбрионов после их криоконсервации и дополнительного культивирования in vitro в течение 30 ч (табл. 2, 3). Доля ранних морул была выше (p < 0.05), тогда как доля эмбрионов на стадии поздних морул была ниже (p < 0.05) в СК-группе по сравнению с контролем, что свидетельствует об угнетающем влиянии СК на развитие эмбрионов. Общее число ядер в ранних морулах этих групп не различалось (табл. 2). Однако число интерфазных ядер в ранних морулах СК-группы было меньше (p < 0.05) по сравнению с контролем (табл. 2). Общее число ядер (p < 0.01), а также число интерфазных ядер (p < 0.001) в поздних морулах СК-группы было меньше, чем в контроле (табл. 2, рис. 5).

 

Рис. 5. Поздние морулы домашней кошки (Felis silvestris catus) после замораживания-оттаивания и последующего культивирования in vitro в течение 30 ч (общее время – 96 ч): контрольная (а) и СК (б) группы; окрашивание DAPI. Стрелки указывают на фрагментированные ядра. Шкала – 50 мкм

 

Кроме того, большинство ядер (97.7%) были фрагментированы в СК-группе, а индекс фрагментации был значительно выше (p < 0.001) в этой группе по сравнению с контролем (табл. 3).

 

Таблица 3. Влияние стеариновой кислоты (СК) при культивировании in vitro на развитие эмбрионов домашней кошки (Felis silvestris catus) и фрагментацию ядер после криоконсервации

Параметры	Группы1
	Контроль	СК
Число эмбрионов	18	13
Неразвивающиеся (%)	1 (5.6)	0 (0)
Дробящиеся (%)	0 (0)	1 (7.7)
Морулы (%)	4 (22.2)	8 (61.5)*
Поздние морулы (%)	13 (72)	4 (30.7)*
ИФ2	23.8 [12; 42.9]	97.7 [90.6; 100]***

Примечание. ¹Общее число использованных самок – 49. Число повторов – пять. Эмбрионы были случайным образом распределены между группами.

²Данные по индексу фрагментации (ИФ) представлены в виде Me [Q1; Q3] для эмбрионов контрольной и СК-группы (n = 17 и n = 12 соответственно).

^*p < 0.05;^***p < 0.001 по сравнению с контролем.

 

Обсуждение результатов

В настоящем исследовании было измерено общее количество внутриклеточных липидов в эмбрионах домашних кошек, однако различий между контрольной и СК-группой установлено не было. В нашей предыдущей работе, как и в данном исследовании, нами не было обнаружено изменений общего количества внутриклеточных липидов в эмбрионах домашних кошек после их культивирования in vitro с добавлением другой жирной кислоты, а именно ненасыщенной линолевой кислоты (Окотруб и др., 2022). Ранее другими авторами было показано, что содержание нейтральных липидов в ооцитах мышей было выше после витрификации и отогрева с применением среды, содержавшей 1% липидный концентрат, в который входила СК (Ohata et al., 2021). Мы предполагаем, что наблюдаемое в нашем исследовании отсутствие различий по общему количеству внутриклеточных липидов в преимплантационных эмбрионах домашней кошки после воздействия in vitro СК может быть вызвано изначально высоким содержанием липидов в ооцитах и эмбрионах данного вида млекопитающих (Galiguis et al., 2014; Amstislavsky et al., 2019). Непрозрачность эмбрионов, связанная с интенсивным рассеянием света на липидных гранулах, затрудняет объемную интеграцию флуоресцентного сигнала после окрашивания нильским красным, в отличие от гораздо более прозрачных эмбрионов мыши, содержащих меньше внутриклеточных липидов (Amstislavsky et al., 2019; Igonina et al., 2021). Между тем воздействие in vitro в дозе 25 мкМ СК на преимплантационные эмбрионы крупного рогатого скота в течение пяти дней приводило к снижению общего количества внутриклеточных липидов (Aardema et al., 2022). Следует отметить, что в данном исследовании на крупном рогатом скоте использовали окрашивание флуорохромом LD540, тогда как в нашем исследовании эмбрионов кошек мы использовали нильский красный. Эти методические различия, а также видовая специфика могли быть причиной того, что выводы, полученные в нашей работе и в исследовании Аардерма с соавторами (Aardema et al., 2022), различаются.

Несмотря на то что в настоящем исследовании мы не обнаружили изменений по общему количеству внутриклеточных липидов после воздействия СК in vitro, были выявлены изменения в степени их ненасыщенности и Т*, что свидетельствует о проникновении СК в клетки преимплантационных эмбрионов домашней кошки. Полученные в данной работе результаты хорошо согласуются с нашим предыдущим исследованием, в котором было показано, что воздействие на ооциты домашней кошки в дозах 50–400 мкМ СК в течение 23–45 ч их дозревания in vitro было достаточным для насыщения клеток данной ЖК (Ranneva et al., 2020). При этом молекулы СК проникли во все липидные гранулы клеток. Интересно отметить, что насыщенная СК снижала степень ненасыщенности внутриклеточных липидов эмбрионов кошки, а воздействие ненасыщенной ЛК в аналогичных условиях приводило к обратному эффекту (Окотруб и др., 2022).

В настоящем исследовании при использовании СК в дозе 400 мкМ не было обнаружено ее влияния на скорость развития эмбриона, число бластомеров и индекс фрагментации ядер при культивировании in vitro без криоконсервации. Мы полагаем, что доза, использованная в нашем исследовании, а также продолжительность воздействия кислоты являются оптимальными для эмбрионов домашних кошек, и это послужило причиной того, что скорость развития in vitro эмбрионов до криоконсервации не снижалась, несмотря на признаки проникновения СК внутрь клеток. В других работах оценивали влияние СК на скорость развития эмбрионов разных видов млекопитающих (Nonogaki et al., 1994; Van Hoeck et al., 2011; Pawlak et al., 2020; Aardema et al., 2022). По литературным данным, СК в дозе 75 мкМ подавляла развитие in vitro эмбрионов крупного рогатого скота; в частности, было обнаружено меньше клеток в бластоцистах и повышение в них уровня апоптоза (Van Hoeck et al., 2011), хотя дозировка 25 мкМ не вызывала подобных изменений (Aardema et al., 2022). У мышей при использовании дозировок 200–300 мкМ темпы развития эмбрионов in vitro существенно замедлялись (Nonogaki et al., 1994). Было показано, что воздействие на ооциты свиньи 150 мкМ СК во время дозревания in vitro не влияет на последующее развитие полученных из них эмбрионов (Pawlak et al., 2020). В совокупности эти исследования показывают, что СК по-разному влияет на развитие эмбрионов разных видов млекопитающих, эффекты её воздействия зависят от используемой дозы и видовой специфики исследуемого объекта (Nonogaki et al., 1994; Van Hoeck et al., 2011; Pawlak et al., 2020; Aardema et al., 2022).

В нашем исследовании установлено, что Т* у эмбрионов после воздействия СК достоверно увеличивается. Это наблюдение находится в полном соответствии с гипотезой о том, что не только общее количество внутриклеточных липидов, но и их качественный состав может быть одним из ключевых факторов, влияющих на криоустойчивость ооцитов и преимплантационных эмбрионов (Amstislavsky et al., 2019). Ранее было показано, что качественный и количественный состав ЖК в ооцитах и преимплантационных эмбрионах специфичен для разных видов млекопитающих (Amstislavsky et al., 2019). Более того, в исследовании на людях было показано, что ооциты и эмбрионы высокого качества содержат больше ненасыщенных ЖК и меньше насыщенных ЖК по сравнению с ооцитами и эмбрионами более низкого качества (Haggarty et al., 2006). Настоящее исследование показывает, что воздействие СК во время культивирования in vitro изменяет состав внутриклеточных липидов в сторону их большей насыщенности, что может повлиять на эффективность криоконсервации эмбрионов. Этот результат хорошо согласуется с нашими недавно опубликованными наблюдениями о более высокой степени ненасыщенности внутриклеточных липидов и улучшении эффективности криоконсервации эмбрионов домашних кошек после обратного воздействия – их культивирования in vitro c ненасыщенной ЛК (Окотруб и др., 2022).

В нашем исследовании СК действительно негативно повлияла на эффективность криоконсервации эмбрионов домашней кошки. Данный результат согласуется с более ранней работой, в которой показано, что дозревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота с добавлением СК и последующее их оплодотворение приводило к получению бластоцист низкого качества с повышенной криочувствительностью (Shehab-El-Deen et al., 2009). В более поздней работе подтвердили, что культивирование in vitro эмбрионов крупного рогатого скота в течение пяти дней в среде с добавлением СК также значительно снижало их криоустойчивость (Aardema et al., 2022). Одним из признаков разрушения эмбриона является наличие ядерных фрагментов, которые обусловлены клеточным апоптозом (Cecchele et al., 2022). В нашем исследовании индекс фрагментации ядер эмбрионов, подвергшихся воздействию СК в процессе культивирования in vitro, был значительно выше по сравнению с контролем после криоконсервации. Наблюдали практически полную гибель всех оттаянных эмбрионов, культивированных in vitro в присутствии СК в течение 66 ч до криоконсервации. Такой негативный эффект можно объяснить тем, что после накопления эмбриональными клетками насыщенных ЖК значительно возрастает Т*. Высокая температура начала фазового перехода внутриклеточных липидов рассматривается как фактор повреждения клеток при их охлаждении ниже физиологического оптимума, но выше точки замерзания (Zeron et al., 2002; Amstislavsky et al., 2019). Согласно данным, полученным с помощью спектроскопии КРС, в процессе замораживания насыщенные ЖК в упорядоченной фазе имеют тенденцию распределяться на периферии липидных гранул (Okotrub et al., 2021). Гипотетически избыточное распределение упорядоченных липидов вблизи поверхности ЛГ может влиять на фазовое состояние и функциональные свойства поверхностного монослоя, окружающего ядро ЛГ, поскольку ненасыщенные липиды остаются заключенными в центре данных структур и не имеют доступа к периферии (Okotrub et al., 2021). Более того, после оттаивания клеток до физиологических температур некоторые насыщенные липиды остаются в упорядоченном конформационном состоянии (Okotrub et al., 2021), что, вероятно, оказывает пагубное влияние на дальнейшее развитие эмбрионов. Если предположить, что в норме при физиологических температурах внутриклеточные липиды должны находиться в неупорядоченном фазовом состоянии для участия в биологических процессах, то молекулы в упорядоченном конформационном состоянии в физиологических условиях могут эти процессы нарушать.

Возможно, воздействие ЖК in vitro также может влиять на преимплантационные эмбрионы через эпигенетические механизмы. Существует предположение, что воздействие различных ЖК in vitro может влиять на уровень экспрессии генов и метилирования ДНК в ооцитах, в клетках кумулюса и преимплантационных эмбрионов (Desmet et al., 2016; Barrera et al., 2018; Pawlak et al., 2020; Ohata et al., 2021). В частности, культивирование in vitro эмбрионов в среде с добавлением смеси 425 мкМ неэтерифицированных ЖК, содержащей 75 мкМ СК, 150 мкМ ПК и 200 мкМ ОК, приводило к изменению метилирования ДНК в клетках 7.5-дневных бластоцист крупного рогатого скота (Desmet et al., 2016). Использование раствора для отогрева, содержащего 1% липидный концентрат, в том числе СК, приводило к повышению экспрессии генов Acaa2 и Hadha у эмбрионов мышей (Ohata et al., 2021). Кроме того, в ооцитах овец, которые дозревали in vitro в среде с добавлением делипидированной сыворотки и затем витрифицировали, наблюдали повышенную экспрессию маркеров стресса эндоплазматического ретикулума: генов Atf4, Atf6, Grp78 и Chop10; эти изменения могут влиять и на метаболизм липидов (Barrera et al., 2018). Экспрессия генов Acaca, Scd, Plin2, Fads1 и Fads2 повышалась в кумулюсных клетках и ооцитах свиньи после воздействия ЖК (Pawlak et al., 2020). Можно предположить, что воздействие СК на преимплантационные эмбрионы кошек in vitro вызывает изменения в экспрессии генов, связанных с криочувствительностью клеток, что может приводить к низкой криоустойчивости эмбрионов после воздействия СК.

Ранее с помощью спектроскопии КРС было установлено, что добавление ненасыщенной ЛК в культуральную среду приводит к увеличению степени ненасыщенности липидов в преимплантационных эмбрионах домашней кошки (Окотруб и др., 2022). Эти изменения приводили к снижению Т*, что положительно отражалось на криоустойчивости эмбрионов (Окотруб и др., 2022). Напротив, как показало представляемое в данной статье исследование, добавление в культуральную среду насыщенной СК приводит к значительному снижению степени ненасыщенности липидов без изменения общего их содержания, что в свою очередь, в полном соответствии с нашей гипотезой, приводит к увеличению Т* и, следовательно, к низкой эффективности криоконсервации эмбрионов. Таким образом, настоящее исследование вместе с нашим предыдущим результатом (Окотруб и др., 2022) подтверждают гипотезу о том, что степень ненасыщенности внутриклеточных липидов играет важную роль в криочувствительности эмбрионов домашних кошек.

Заключение

Наши результаты свидетельствуют о том, что культивирование in vitro эмбрионов домашней кошки с добавлением стеариновой кислоты привело к уменьшению степени ненасыщенности внутриклеточных липидов, но не повлияло на их общее количество и скорость развития эмбрионов до криоконсервации. Тем не менее снижение степени ненасыщенности липидов привело к значительному увеличению температуры начала фазового перехода липидов и подавлению последующего развития эмбрионов in vitro после криоконсервации. Вместе с нашими более ранними результатами по воздействию in vitro ненасыщенной линолевой кислоты на эмбрионы домашних кошек эта работа демонстрирует роль липидного состава в криотолерантности эмбрионов домашней кошки и подтверждает взаимосвязь между T*, степенью ненасыщенности липидов и эффективностью криоконсервации. Эти результаты важны для выбора способа сохранения генетических ресурсов тех видов млекопитающих, ооциты и эмбрионы которых отличаются высоким содержанием внутриклеточных липидов. Речь идет о некоторых сельскохозяйственных животных, в частности о свиньях, а также о представителях отряда хищных, к которому относятся редкие и исчезающие виды кошачьих.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке РНФ № 21-74-10108 с использованием оборудования ЦКП “Центр генетических ресурсов лабораторных животных” ФИЦ ИЦиГ СО РАН, поддержанного Минобрнауки России (уникальный идентификатор проекта RFMEFI62119X0023). Микроскопические работы выполнены в ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.

Этическое одобрение

Все исследования проводились в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для Экспериментальные и другие научные цели (СЭД № 123). Исследование одобрено Комитетом по биоэтике (протокол № 144 от 29 марта 2023 г.).

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

E. Brusentsev

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Lavrentyeva 10, Novosibirsk, 630090

S. Okotrub

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Lavrentyeva 10, Novosibirsk, 630090

D. Lebedeva

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Automation and Electrometry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Lavrentyeva 10, Novosibirsk, 630090; prosp. Koptyuga 1, Novosibirsk, 630090; Pirogova 2, Novosibirsk, 630090

K. Okotrub

Institute of Automation and Electrometry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Koptyuga 1, Novosibirsk, 630090

T. Rakhmanova

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Automation and Electrometry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Lavrentyeva 10, Novosibirsk, 630090; prosp. Koptyuga 1, Novosibirsk, 630090; Pirogova 2, Novosibirsk, 630090

S. Amstislavsky1

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Automation and Electrometry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: amstis@yandex.ru
Ресей, prosp. Lavrentyeva 10, Novosibirsk, 630090; prosp. Koptyuga 1, Novosibirsk, 630090

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар