Молекулярный водород уменьшает среднее и систолическое артериальное давление и процессы воспаления в легких при разных формах гипертонии в экспериментах на крысах линии Wistar

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Артериальное давление (АД) является интегративным показателем состояния сердечно-сосудистой системы. Нормальный уровень давления в организме создается и регулируется нервным, гуморальным, гормональным, местным и др. механизмами. Длительное повышение АД приводит к развитию артериальной гипертонии. Гипертония – обширная группа заболеваний, которая характеризуется стойким увеличением АД и является одной из ведущих причин возникновения сердечно-сосудистых заболеваний в организме человека [1]. В последнее время появляются данные, что одним из важнейших факторов патогенеза этого заболевания являются оксидативный стресс и воспаление. Оба этих фактора опосредуют патологические изменения миокарда, сосудов и окружающей ткани. Среди перспективных и неспецифических методов предупреждения и терапии гипертонии рассматривается применение антиоксидантов [2]. Молекулярный водород – природный антиоксидант, может избирательно нейтрализовать гидроксильные радикалы (OH) и пероксинитрит (ONOO-), которые являются очень сильными окислителями и активность которых приводит к необратимым изменениям тканей и гибели клеток. Важно, что молекулярный водород не восстанавливает такие важные сигнальные молекулы в тканях, как Н₂О₂ и NO [3]. Влияние молекулярного водорода на организм умеренное, побочных эффектов до сих пор не выявлено [4]. Обладая такими свойствами, молекулярный водород может уменьшать оксидативный стресс, при этом не влияя на сигнальные молекулы, участвующие в физиологических процессах в клетках [5]. Тучные клетки (ТК) рассматриваются потенциальными мишенями для выявления противовоспалительных эффектов молекулярного водорода и иммунного ответа. Ферменты и протеазы (триптаза), высвобождаемые ТК, а также образующиеся во время дегрануляции активные формы кислорода, сопровождают ранние стадии воспалительного процесса [6]. Кроме того, было показано, что Н₂ способен ингибировать синтез провоспалительных и воспалительных цитокинов, изменяя внутриклеточные пути реализации их сигналов [7]. Открытие этих свойств Н₂ положило начало широкому кругу исследований на животных о возможном влиянии Н₂ на течение различных сердечно-сосудистых и других заболеваний. В работах, проведенных на крысах, было показано, что добавление молекулярного водорода к атмосферному воздуху, которым дышат животные, уменьшает ишемическое/реперфузионное повреждение миокарда за счет снижения оксидативного стресса и NLRP3-опосредованного пироптоза у крыс [8]. Защитное действие газообразного водорода продемонстрировано также при изучении ишемического/реперфузионного повреждения спинного мозга. Показано, что транспортер-1 глутамата играет важную роль в этом эффекте [9]. Были получены данные о том, что вдыхание газообразного водорода уменьшает ремоделирование миокарда сердца и фиброз путем регулирования воспаления у крыс с инфарктом миокарда [10] и в легких у животных с легочной гипертонией [11]. Матриксные металлопротеиназы (MMП) представляют собой группу ферментов, участвующих в деградации большинства компонентов внеклеточного матрикса и, следовательно, в ремоделировании тканей, связанном с патологическими состояниями, в том числе с развитием легочной гипертонии [12]. Матриксная металлопротеиназа-9 (MMП-9), влияя на активацию тканевого фактора, при взаимодействии с MMП-2 вызывает нарушение строения дыхательных путей и базальной мембраны сосудов, что напрямую приводит к повышению их проницаемости. Кроме того, MMП-9 усиливает активность нейтрофилов через NF-κB-путь, увеличивает высвобождение воспалительных факторов, таких как IL-6, и катализирует прогрессирование легочного воспаления [12].

В исследованиях используют несколько способов применения водорода, каждый из которых имеет свои особенности. В настоящее время в экспериментальных и клинических исследованиях часто применяют ингаляции воздухом, содержащим разный процент добавленного водорода. Было показано, что вдыхание газовой смеси с концентрацией водорода от 2 до 4% безопасно [13].

Несмотря на большое количество работ, касающихся изучения защитного действия молекулярного водорода на развитие патологий сердца и мозга, исследования на моделях гипертонии единичны. Так, в одном из них было показано, что ежедневные 4-часовые ингаляции с Н₂ у пожилых людей (50–70 лет) с диагностированной артериальной гипертонией приводят к уменьшению систолического артериального давления [14]. Предполагается, что кроме изменения активности ренин-ангиотензиновой системы, в этом эффекте принимает участие уменьшение активности симпатической системы. В связи с этим мы в настоящей работе изучали влияние Н₂ на развитие гипертонии на двух моделях. Первая модель воспроизводит гипертонию малого круга кровообращения – легочную гипертонию, которая характеризуется увеличением среднего артериального давления в легочных сосудах более чем на 25 мм рт. ст. Развитие МКТ гипертонии ассоциировано с интерстициальной болезнью легких (ИЗЛ). При этом наблюдается развитие эндотелиальной дисфункции, воспаления, оксидативного стресса, ремоделирование сосудистой стенки и соединительной ткани легких, т. е. все симптомы развития ИЗЛ [15]. Важно, что эта форма гипертонии не сопровождается изменением системного артериального давления. Изучены многие молекулярные механизмы, лежащие в основе ее патогенеза [16]. Уменьшение процессов воспаления и фиброза в легких может явиться маркером действия молекулярного водорода при ингаляциях.

В качестве второй модели была выбрана модель гипертонии большого круга кровообращения – реноваскулярная гипертония “одна почка – одна клипса” (РВГ 1П1К), которая зависит от ренин-агиотензиновой системы только в начале заболевания. Показано, что механизм развития РВГ запускается при сужении просвета приносящей почечной артерии не менее чем на 70–80% [17]. Считается, что важную роль в увеличении системного артериального давления и ЧСС играет увеличение симпатической активности [18].

Таким образом, целью настоящего исследования явилось изучение влияния дыхания атмосферным воздухом, содержащим 4% молекулярного водорода, на степень развития МКТ-легочной гипертонии и ассоциированной с ней интерстициальной болезни легких, а также выраженности реноваскулярной (1П1К) гипертонии в экспериментах на крысах.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Исследование проводили на самцах крыс линии Wistar, массой 180–220 г, полученных из вивария НИИ общей патологии и патофизиологии (Москва, Россия). При содержании крыс соблюдались условия 12-часового светового дня со свободным доступом к воде и пище при контроле влажности и температуры. Эксперименты начинали не ранее, чем через 7 дней после доставки животных.

Моделирование МКТ-ЛГ. Эксперименты проводились на 24 животных, которые были разделены на три группы по 8 крыс. Для получения модели МКТ-ЛГ животным однократно подкожно вводили монокроталин (МКТ) (60 мг/кг в 60%-ном этиловом спирте) (Sigma Aldrich, Дармштадт, Германия). Контрольной группе (Контроль) вводили только растворитель для МКТ (эквивалентный объем 60%-ного этилового спирта). Животные этой группы были помещены в пластиковые камеры, так же как и МКТ группы, они дышали атмосферным воздухом. Животные, получавшие МКТ-инъекцию, были разделены на две группы. В 1-й группе крысы дышали атмосферным воздухом (МKТ-Контроль), во 2-й группе – атмосферным воздухом, содержащим 4% водорода (МKТ-Н₂). Воздействие было хроническим – в течение 3 недель. В течение этого времени убыль животных не наблюдалась, однако в ходе острого эксперимента не всегда удавалось корректно измерить систолическое давление в правом желудочке сердца как одного из симптомов развития МКТ-ЛГ, или же животные с гипертонией плохо переносили наркоз и умирали. Поэтому в конечном итоге представлены результаты по 5 или 6 животным в группах.

Схема эксперимента. В ходе эксперимента животных помещали в пластиковые контейнеры объемом 130 л (SAMLA 203.764.41, Inter IKEA Systems). Внутри каждого контейнера располагалось по две клетки Т3 для животных, в каждой из которых помещалось по 4 крысы. Для вентиляции контейнеров использовали воздушный компрессор (Hiblow XP 40, Techno Takatsuki CO, Япония). Водород подавали от генератора молекулярного водорода (Pioneer, Vodorodpomogaet Россия). Подачу водорода и атмосферного воздуха контролировали ротаметрами (LZB-3, LZM-4T, Китай). Она составляла 0.15 л/мин для водорода и 4 л/мин для воздуха. Содержание водорода в этом случае составляло 3.5–4.0% в воздухе, которым дышали крысы (рис. 1).

 

Риc. 1. Схематическое изображение экспериментальной установки.

 

Моделирование РВК 1П1К. Перед началом эксперимента животных взвешивали, измеряли систолическое артериальное давление (САД) плетизмографическим методом и помещали в метаболические клетки производства компании Tecniplast на 22 ч. Животные в метаболических клетках (метабоклетки) имели неограниченный доступ к воде. Сразу после того, как животных извлекали из метабоклеток, у них из хвостовой вены отбирали пробы крови на биохимический анализ, определяли количество выпитой воды и суточный объем выделенной мочи. Полученные образцы крови и мочи замораживали при температуре –20 °С для последующего анализа. Животные после метабоклеток восстанавливались в течение двух дней для увеличения выживаемости при последующей операции.

Операцию по моделированию РВГ 1П1К гипертонии проводили под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг, 20 мг/мл в 0.9%-ном растворе NaCl, внутрибрюшинно). У животных удаляли правую почку, а на почечную артерию левой почки накладывали клипсу, которую изготовляли из отрезка серебряной ленты (толщина 0.1 мм) длиной 8–9 мм, шириной 2 мм. Просвет клипсы составлял 0.26–0.27 мм в зависимости от массы тела крысы. После операции крысам внутрибрюшинно вводили антибиотик ципрофлоксацин, 5 мг/кг/день, 2 мг/мл, в течение четырех дней (Ciprinol®, раствор для инфузии, KRKA). Оперированных животных помещали в индивидуальные клетки на 7 дней.

Спустя неделю после операции животным измеряли САД плетизмографическим методом и разделяли их на 2 группы – РВГ-К и РВГ-Н₂. Животных распределяли так, чтобы усредненное увеличение САД после операции было статистически равным между двумя группами. Так же как и в предыдущих экспериментах, в течение 3 недель животные в опытной группе (РВГ-Н₂) дышали воздухом, содержащим 4% молекулярного водорода, а животные в контрольной группе (РВГ-К) дышали атмосферным воздухом. За 2 дня до острого эксперимента животных сажали в метаболические клетки, проводили измерение массы до и после метабоклеток, определяли потребление воды за сутки и объем суточной мочи, проводили отборы проб сыворотки крови и мочи. В пробах крови и мочи проводили измерение содержания креатинина и мочевины коммерческими наборами.

Для регистрации гемодинамических параметров животных анестезировали уретаном (1.2 г/кг, 0.6 г/мл в воде) внутрибрюшинно. Среднее артериальное давление (ср. АД), систолическое АД (САД), диастолическое АД (ДАД) и систолическое давление в правом желудочке (СПЖД) в случае МКТ-ЛГ животных и частоту сердечных сокращений (ЧСС) оценивали непосредственно с помощью датчика артериального давления Statham (Statham Instrument Inc., Лос-Анджелес, Калифорния, США). Данные через усилитель и аналого-цифровой преобразователь L-Card E14–140 (версия 1, L-Card, Москва, Россия) передавались на компьютер. Наркотизированным крысам в бедренную артерию вживляли катетер РЕ10 для регистрации давления и ЧСС. В бедренную вену вставляли катетер РЕ 50 (Медсил, Москва, Россия) для введения веществ. Для МКТ-ЛГ животных в правую яремную вену вставляли катетер РЕ 50 и проводили его в правый желудочек под контролем регистрации кривой давления. О степени развития реноваскулярной гипертонии судили по изменению системного АД, а МКТ гипертонии – по величине СПЖД и гипертрофии правого желудочка сердца. Степень гипертрофии правого желудочка (ПЖ) оценивали как отношение массы ПЖ к сумме масс левого желудочка (ЛЖ) и межжелудочковой перегородки (пер) (ПЖ/(ЛЖ + пер)) в процентах.

Биохимический анализ проводили в образцах сыворотки крови и мочи животных с РВГ 1П1К. В пробах измеряли содержание креатинина и мочевины с помощью коммерческих наборов Ольвекc-Диагностикум (Россия): Креатинин-Ольвекс, Мочевина-Ольвекс. Спектрофотометрический анализ проводили на анализаторе Multiscan EX (Thermo EC, Delaware, США).

Морфологический анализ. Взятые образцы легких незамедлительно фиксировали в 10%-ном забуференном растворе формалина в течение 2–3 дней. После стандартной процедуры пробоподготовки из парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм для окрашивания гематоксилином и эозином, а также раствором Гимзы для идентификации ТК; срезы толщиной 2 мкм использовали для иммуногистохимического исследования. Иммуногистохимически определяли секрецию триптазы ТК с использованием мышиных моноклональных антител к триптазе (Abcam #ab2378, разведение 1 : 2000), профиброзные маркеры TGF-β 1 [EPR21143] (Abcam #ab215715, разведение 1 : 500) и MMП-9 [EP127] (#AC-0122RUO, разведение 1 : 200, Cell Marque, Epitomics Inc., США) для оценки ремоделирования легких. Проводили иммунофлуоресцентное выявление триптазы ТК (козий анти-мышиный IgG Ab (#A-11029) Invitrogen, (метка Alexa Fluor 488) и MMП-9 (козий анти-кроличий IgG Ab (#A-11034) Invitrogen, (метка-Cy3)), ядра контрастировали 4´,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, 5 мкг/мл в PBS). Количественный анализ иммунопозитивных клеток осуществлялся по 30 полям зрения при увеличении ×20. Сводные данные приведены в табл. 1. Все гистологические срезы анализировали слепым способом с использованием микроскопа Zeizz Imager.A2, программного обеспечения ImagePro (Германия).

 

Таблица 1. Среднее количество триптаза-позитивных тучных клеток и клеток, экспрессирующих профиброзные маркеры в 1 мм² легких (M ± SD)

Группа Маркер	Контроль (n = 7)	MКT-Контроль (n = 6)	MКT-H2 (n = 6)
Триптаза ТК	23 ± 6	40 ± 13*	28 ± 10*,#
TGF-β	4 ± 3	106 ± 50*	42 ± 10*,#
ММП-9	3 ± 1	48 ± 9*	21 ± 7*,#

Примечание. Триптаза ТК – *Контроль vs. MКT-Control, MКT-H₂, p < 0.05, # MКT-H₂ vs. MКT-Контроль, p < 0.05, one-way ANOVA; TGF-β – *Контроль vs. MКT-Control, MКT-H_2, p < 0.00001, # MКT-H₂ vs. контроль, MКT-Контроль односторонний ANOVA; *Контроль vs. MКT-Контроль, MКT-H₂ , p < 0.05, # MКT-H₂ vs. MКT-Контроль, p < 0.05, one-way ANOVA.

 

Статистическая обработка результатов. Данные экспериментов оформлены и представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (M ± SD). Статистический анализ данных проводили в программах Statistica 12.0 (Statistica Inc., США) и GraphPad Prism 8.0. Проверку нормальности распределения проводили с помощью критерия Шапиро – Уилка. One-Way ANOVA использовали для определения наличия статистически значимых различий по одному фактору между средними значениями трех или более независимых групп. Для того чтобы установить одновременное влияние группы и продолжительности воздействия, а также оценить взаимодействие между этими факторами, использовали двухфакторный дисперсионный анализ Two-way ANOVA. Для сравнения ранговых данных использовали тест Краскела – Уоллиса. Исключение статистических выбросов проводили с использованием критерия ROUT при Q > 1%. Качественные данные описывали абсолютными (n) и относительными данными (%). Как статистически значимый рассматривали уровень доверительной вероятности р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния молекулярного водорода на развитие МКТ-ЛГ

Влияния добавленного молекулярного водорода к атмосферному воздуху на основные сердечно-сосудистые показатели развития МКТ-ЛГ не было выявлено. Показатели СПЖД для группы МКТ-Контроль и МКТ-Н₂ достоверно не отличались друг от друга и составляли 56 ± 7 мм рт. ст. (n = 5) и 55 ± 6 мм рт. ст. (n = 6) соответственно. Обе величины были достоверно выше СПЖД контрольной группы без МКТ-ЛГ, где оно составляло 29 ± 5 мм рт. ст. (p < 0.05), что свидетельствует о развитии МКТ-ЛГ в обеих экспериментальных группах. Индекс гипертрофии ПЖ сердца в группе контроля составил 29.2 ± 4.0%, в группе МКТ-Контроль – 38.3 ± 6.1% и в группе МКТ-Н₂ – 42.1 ± 6.8%. Два последних показателя статистически значимо не отличались друг от друга, но были достоверно больше величины в группе Контроль (р < 0.05). Эти данные свидетельствуют о развитии гипертонии в МКТ группах и отсутствии влияния Н₂ на этот показатель, что подтверждает полученные ранее данные [11].

Изучение величины САД показало, что в группе животных с МКТ-ЛГ, которые дышали атмосферным воздухом, содержащим 4% молекулярного водорода (МКТ-Н₂), наблюдается достоверное уменьшение ср. АД на 11% по сравнению с ср. АД в контрольной группе и на 13% по сравнению с группой МКТ-Контроль (p < 0.05) (рис. 2).

 

Рис. 2. Среднее артериальное давление (а), систолическое (b) и диастолическое (c) артериальное давление на 21-й день эксперимента. *MCT-H₂ vs Control, MCT-Control, p < 0.05, One-way ANOVA. Цифры внутри столбиков обозначают количество животных.

 

Так как ср. АД представляет собой некоторый усредненный показатель между САД и ДАД, мы посмотрели, за счет какой составляющей наблюдается выявленное нами уменьшение ср. АД. Как показано на рис. 2b, изменение ср. АД обусловлено снижением его систолической составляющей. САД в группе МКТ-Н₂ составляет 107 ± 8 мм рт. ст., а в группе МКТ – 121 ± 9 мм рт. ст., в группе Контроль – 120 ± 15 мм рт. ст. (p < 0.05). ДАД и ЧСС при этом не отличались.

МКТ-ЛГ является моделью легочной гипертонии, ассоциированной с интерстициальным заболеванием легких, которое характеризуется воспалением и фиброзом. Морфологический анализ выявил признаки воспалительного процесса, а также изменение активности профиброзных маркеров в сторону активации синтеза фибриллярных структур с образованием фиброзных структур с неравномерной плотностью, утолщение стенок сосудистого русла (рис. 3b). Морфологический анализ образцов группы MКT-H₂ показал, что структуры ацинуса приобрели классическую форму; альвеолы имели ячеистый вид и слегка утолщенные стенки с полноценными кровеносными сосудами в интерстиции (рис. 3e). Признаки интерстициального отека уменьшились, но пневмоциты с признаками гипертрофии сохранялись. Реакция ТК показала как количественное, так и функциональное снижение по сравнению с контрольной группой MКT. Ранее мы описывали, что дыхание воздухом с примесью 4% Н₂ у животных с МКТ приводит к снижению количества и функциональной активности тучных клеток (включая клетки, содержащие триптазу) в среднем на 30% по сравнению с группой MКT-Контроль, т. е. вызывает уменьшение воспаления в легких (табл. 1). Секреция TGF-β альвеолярными макрофагами и альвеолярными клетками II типа была высокой по сравнению с контролем и MКT-H₂ в группах (табл. 1, рис. 4). При общем увеличении количества клеток TGF-β наблюдалось их неравномерное распределение в респираторной части легкого с формированием преимущественного накопления в определенных локусах ацинуса. Продолжая это исследование, в данной работе мы проводили иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализ содержания одного из ферментов семейства матриксных металлопротеиназ – ММП-9. Как уже говорилось выше, при ЛГ наблюдается ремоделирование стенки легочных сосудов. В этом процессе принимает участие и изменение внеклеточного матрикса, которое регулируется как иммунокомпетентными клетками, так и ферментами семейства ММП [19]. Результаты показали, что экспрессия MMП-9 в группе МКТ-Контроль была выше, чем в группах Контроль в 16 раз, а по сравнению с группой МКТ-Н₂ – в 2.3 раза (р < 0.05) (табл. 1, рис. 4).

 

Рис. 3. Морфологические особенности структур легких и тучных клеток крыс линии Вистар при моделировании легочной гипертонии. Методы окрашивания: (a), (b), (e) – гематоксилин и эозин, (c), (d), (f) – раствор Гимзы. (a) – группа контроля, (b, c, d) – МКТ-Контроль, (e, f) – МКТ-Н₂. (a) – в респираторном отделе легкого удлиненные альвеолярные проходы переходят в тонкостенные альвеолы, признаков воспалительного инфильтрата и отека стромы не наблюдается; (b) – выявляются структурные и функциональные изменения в артериальной стенке и облитерации просвета с гипертрофией медии; (c) – тучные клетки (фиолетовое окрашивание) инфильтрируют строму легочной ткани, активно дегранулируют; (d) – в локусе отмечаются нейтрофилы и плазмоциты; (e) – менее выраженный отек интерстициальных структур и альвеолоцитов легкого, периваскулярно расположено незначительное количество клеток воспалительного инфильтрата; (f) – единичные тучные клетки в поле зрения без признаков дегрануляции. Увеличение (a) – х 200, (b, c, e, f) – х 400, (d) – х 1000.

 

Рис. 4. Гистотопография и характер экспрессии триптазы тучных клеток (a, b), TGF-β (c, d) и ММП-9 (e, f) в легких при развитии ЛГ (b, d, f) и при ЛГ с ингаляцией 4% H₂ (a, c, e). Специфическое для иммуногистохимической реакции коричневое окрашивание выявляет скопление триптаза-позитивных тучных клеток с признаками дегрануляции в интерстиции легочной ткани (b), в то время как под влиянием ингаляции 4% H₂ снижается экспрессия данной протеазы (a); инфильтрация иммунопозитивными клетками с высокой экспрессией TGF-β в группе МКТ-Контроль (d) в сравнении с немногочисленными TGF-β позитивными клетками в группе применения молекулярного водорода (c); низкая экспрессия ММП–9 (красный цвет, метка-Cy3) на фоне солоколизации с триптаза-позитивными тучными клетками (зеленый цвет, метка Alexa Fluor 488) в группе (e) и скопление ММП-9 позитивных клеток, преимущественно нейтрофилов (в соответствии с морфологией клеток) в присутствии триптаза-позитивных тучных клеток. Методы окрашивания: (a, b, c, d) – иммуногистохимическая реакция, (e, f) – иммунофлуоресцентное окрашивание. Увеличение (a, b, d) – х 400; (c, e, f) – х 1000.

 

Таким образом, в гипертензивной группе, крысы которой дышали воздухом с 4% водорода, количество ММП-9-позитивных клеток было статистически значимо уменьшено по сравнению с МКТ-контрольной группой. MMП-9 в легких, идентифицируемая путем иммунофлуоресцентного окрашивания, экспрессировалась преимущественно в нейтрофилах, в меньшей степени – в ТК. Результаты показали, что экспрессия MMП-9 в группе MКT-Контроль была выше, иммунопозитивные MMП-9 клетки часто солокализовались с триптаза-позитивными ТК (табл. 1, рис. 4).

Таким образом, несмотря на отсутствие влияния Н₂ на основные сердечно-сосудистые симптомы развития МКТ, у крыс из группы МКT-Н₂ ингаляция с молекулярным водородом вызывает статистически значимое уменьшение ср. АД, опосредованное уменьшением САД, а также оказывает регуляторное воздействие на функциональный и фенотипический статус ТК, снижает количество TGF-β позитивных клеток и приводит к ингибированию активности ММП-9 – фактора, участвующего в ремоделировании внеклеточного матрикса легких, проявляя антифибротическое и противовоспалительное действие.

Изучение влияния молекулярного водорода на развитие РВГ 1П1К

В течение эксперимента в обеих группах с РВГ (РВГ-К и РВГ-H₂) на бодрствующих животных непрямым плетизмографическим методом измеряли САД. На рис. 5a представлена динамика изменения САД за 28 дней опыта.

 

Рис. 5. Параметры гемодинамики бодрствующих (а) и наркотизированных (b – d) крыс линии Wistar с реноваскулярной почечной гипертонией 1П1К. (a) – динамика САД у бодрствующих крыс, измеренная непрямым плетизмографическим методом. (b – d) гемодинамические показатели у наркотизированных крыс – (b) ЧСС; (с) – cр. АД; (d) – CАД; (e) – ДАД. # - статистически значимые различия между 1 и 3 точками (p < 0.05) two-way ANOVA. * – статистически значимые различия между группами (p < 0.05) по t-тесту для несвязанных переменных. ** – статистически значимые различия между группами (p < 0.01) по t-тесту для несвязанных переменных. Цифры внутри столбиков обозначают количество животных.

 

В “0” точке средняя величина САД составила 122.5 ± 8.5 мм рт. ст. (n = 16). Через неделю после проведения операции 1П1К у животных измеряли САД, делили их произвольно на две группы (РВГ-К и РВГ-Н₂) и начинали эксперимент по ингаляции молекулярным водородом. Измерение САД на 28-й день показало, что оно возросло в обеих группах. Для группы РВГ-К оно составило 151.7 ± 16.5 мм рт. ст. (n = 5, p < 0.05), а для группы РВГ-H₂ – 138.6 ± 5.9 мм рт. ст. (n = 6, p = 0.065). Таким образом, в обеих группах наблюдалось увеличение ср. АД, однако его степень в группе РВГ-Н₂ была меньше, чем в контрольной группе.

Исследования на наркотизированных животных показали статистически значимое уменьшение (p < 0.01) ср. АД (рис. 5c) в группе РВГ-Н₂ (85.6 ± 5.2 мм рт. ст., n = 6) по сравнению с группой РВГ-К (96.5 ± 5.7 мм рт. ст., n = 5). Уменьшение ср. АД, так же как и в случае МКТ-ЛГ, было снижено за счет САД (рис. 5d), которое у животных из группы РВГ-Н₂ (102.2 ± 9.9 мм рт. ст.) было статистически значимо (p < 0.05) меньше по сравнению с группой РВГ-К (116.2 ± 8.7 мм рт. ст.). ДАД (рис. 5e) и ЧСС (рис. 5b) достоверно не изменялись, хотя последний показатель имел тенденцию к уменьшению. Таким образом, и в случае РВГ 1П1К гипертонии при добавлении Н₂ к атмосферному воздуху наблюдается уменьшение ср. АД за счет САД.

В ходе этого эксперимента проводилось изучение выделительной способности почки. В пробах суточной мочи и крови исследовалось содержание креатинина и мочевины до операции по моделированию РВГ и на 26-й день эксперимента (риc. 6).

Развитие РВГ сопровождалось статистически значимым возрастанием концентрации креатинина (рис. 6a) (на 44% в группе РВГ-К и на 55% в группе РВГ-H₂) и мочевины (рис. 6d) (на 20% в группе РВГ-К и на 78% в группе РВГ-H₂) в пробах крови. Их экскреция с суточной мочой возросла в обеих группах: для креатинина на 91% в группе РВГ-К и на 51% в группе РВГ-H₂ (рис. 6b), для мочевины на 40% в группе РВГ-К и на 58% в группе РВГ-H₂ (рис. 6e). Значимых различий между группами РВГ-К и РВГ-Н₂ для этих показателей не выявлено. В качестве показателя скорости клубочковой фильтрации был изучен клиренс эндогенного креатинина (рис. 6c). Наблюдалось некоторое увеличение этого показателя к концу эксперимента, но статистически значимого изменения скорости клубочковой фильтрации, рассчитанной по креатинину, выявлено не было. Не отличался он и между группами РВГ-К и РВГ-Н₂ (0.80 ± 0.29 мл/мин и 1.13 ± 0.17 мл/мин до операции и 1.07 ± 0.16 мл/мин и 1.17 ± 0.62 мл/мин в конце эксперимента соответственно). Таким образом, при данной форме РВГ выделительная способность почки адаптируется к возрастанию катаболизма белков, так как клиренс не меняется. Водород на этот показатель также не влиял.

 

Рис. 6. Оценка выделительной функции почки у крыс линии Wistar с РВГ. (a) – концентрация креатинина в сыворотке крови; (b) – суточная экскреция креатинина; (с) – клиренс креатинина; (d) – концентрация мочевины в сыворотке крови; (e) – суточная экскреция мочевины. ** – статистически значимые различия между значениями до и после операции (p < 0.01) по two-way ANOVA. *** – статистически значимые различия между значениями до и после операции (p < 0.001) по two-way ANOVA. Цифры внутри столбиков обозначают количество животных.

 

Влияние атмосферного воздуха, содержащего 4% молекулярного водорода, на гемодинамические показатели здоровых животных

Для выяснения того, насколько полученный эффект уменьшения ср. АД и САД при МКТ-ЛГ и РВГ 1П1К при дыхании с Н₂ связан с развитием патологического процесса, была проведена полностью идентичная серия на здоровых животных. В этой серии экспериментов гипотензивный эффект не был получен, а ср. АД и САД составили в среднем 98 ± 9 и 112 ± 14 мм рт. ст. соответственно (n = 8), что не отличалось от показателей контрольной группы (n = 8), которая дышала только атмосферным воздухом. Влияния H₂ на ЧСС в этой серии также не наблюдалось, и в среднем величина ЧСС составила 373 ± 74 уд/мин.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно современным представлениям, молекулярный водород обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами [1–5, 7]. Именно такой эффект мы получили, изучая маркеры (тучные клетки, триптаза, TGF-β), ассоциированные с МКТ-ЛГ интерстициальной болезнью легких. Было показано их значимое уменьшение в настоящей работе и в предыдущих исследованиях [11]. Кроме того, мы выявили снижение экспрессии ММП-9 в легких в группе МКТ-Н₂ по сравнению с группами МКТ-контроль и Контроль. MMП-9 участвует в фиброзе и ремоделировании соединительной ткани легких и легочных кровеносных сосудов [20]. Регуляторную роль на активность ММП-9 могут оказывать многие иммунокомпетентные клетки, в том числе тучные клетки, которые не только регулируют активность MMП-9, но и сами производят данный фермент [12, 21]. Водородная ингаляция уменьшала степень утолщения альвеолярных перегородок и их инфильтрацию воспалительными клетками, что способствовало значительному снижению показателей повреждения легких. Вдыхание водорода значительно улучшило состояние интерстиция легких, снизив воспалительную инфильтрацию, уменьшило отек легких и кровоизлияния, повлияло на активность секреции профиброзных маркеров, тем самым предотвращая воспалительные каскадные структурные изменения дыхательных путей. Воздействие молекулярного водорода на тучные клетки может быть эффективным способом уменьшения воспалительного повреждения и профиброзного состояния тканей легкого в патогенезе легочной гипертонии. Однако несмотря на то, что уменьшение экспрессии ММП-9 предполагает уменьшение ремоделирования не только соединительной ткани легких, но и стенки сосудов, мы не выявили влияния Н₂ на гемодинамические показатели МКТ-ЛГ. Хотя такое взаимодействие можно было бы ожидать, учитывая, что использование терапии, направленной на коррекцию ИЗЛ, приводит к улучшению качества жизни пациентов с ЛГ и уменьшению суммарных расходов на их лечение [22]. По-видимому, для проявления этого взаимодействия необходимо более длительное или более интенсивное действие Н₂.

Несмотря на отсутствие влияния молекулярного водорода на показатели гемодинамики малого круга кровообращения, в нашем исследовании было зарегистрировано значимое снижение ср. АД и САД в большом круге кровообращения в группе МКТ-Н₂. Эффект не наблюдался в группах МКТ-контроль и Контроль. Схожие результаты были получены в исследованиях на людях. В рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании проводилось наблюдение за 60 пациентами с диагностированной артериальной гипертонией в возрасте 50–70 лет. Их подвергали ингаляциям комнатного воздуха или его смеси с водородом (0.2–0.4%) в течение четырех часов в день на протяжении 2 недель. Было отмечено, что систолическое артериальное давление значительно снизилось после водородных ингаляций по сравнению с исходным, чего не наблюдалось в группе плацебо. Эффект сопровождался снижением соотношения альдостерона к ренину и содержания кортизола в крови испытуемых, что позволило авторам высказать предположение о понижении активности симпатической системы при действии молекулярного водорода [14]. В нашем исследовании этот эффект наблюдался при МКТ-ЛГ, которая обычно не сопровождается изменением системного артериального давления, но связана с развитием воспалительного процесса. В последнее время появились исследования, которые показывают, что хроническое воспаление является одним из факторов патогенеза системной гипертонии [23]. Можно предположить, что молекулярный водород, уменьшая воспалительный процесс, снижает и ср. АД. Тот факт, что уменьшение этого показателя происходит за счет его систолической составляющей, позволяет предположить, что этот процесс связан с понижением активности симпатической системы.

Имеются исследования, результаты которых подтверждают такое предположение. В исследовании реноваскулярной гипертонии на крысах, где использовалось хирургическое удаление 5/6 одной почки при удалении второй, ингаляции водородом в течение 1 ч в сутки вызывали уменьшение повышенного АД у этих животных. Спектральный анализ вариабельности АД показал, что Н₂ уменьшает дисбаланс вегетативной нервной системы за счет подавления активности симпатической нервной системы [24].

В нашем исследовании мы использовали модель реноваскулярной гипертонии 1П1К. Как уже говорилось выше, механизм повышения АД в этой модели запускается при сужении просвета артерии не менее чем на 70–80% [11]. Считается, что важную роль в увеличении системного артериального давления при этом играет повышение активности симпатической нервной системы [18].

При сравнительном изучении изменения содержания норадреналина в плазме крови животных с разными моделями РВГ (1П1К или 2П1К) было показано его увеличение только в модели 1П1К, что коррелировало с возрастанием ЧСС [25]. В хронической форме эта модель РВГ является ренин-независимой. Используя эту модель, мы показали, что добавление 4% водорода в дыхательную смесь крысам со 2-й недели развития РВГ (группа РВГ-Н₂) привело к значимому уменьшению ср. АД и САД по сравнению с группой РВГ-К. Эффект сопровождался тенденцией к уменьшению ЧСС (р < 0.065). Молекулярный водород не влиял на повышение уровня креатинина и мочевины в крови крыс обеих групп и выделительную способность почки. Учитывая патогенез данной модели РВГ, уменьшение САД, тенденцию к уменьшению ЧСС и отсутствие влияния на выделительную способность почки можно рассматривать как аргумент в пользу центрального действия молекулярного водорода. Наличие воспалительного процесса при этой форме гипертонии также, вероятно, присутствует, учитывая хирургическое вмешательство.

Возникает вопрос: какое место в этом эффекте занимает противовоспалительное и антиоксидантное действие молекулярного водорода. По-видимому, эти свойства молекулярного водорода реализуются и в этом случае, так как эффект понижения системного АД наблюдается только на животных с гипертонией. На здоровых животных без патологии этот эффект не выявляется, что соответствует литературным данным [13].

Таким образом, мы показали, что добавление 4% молекулярного водорода во вдыхаемый воздух вызывает уменьшение системного АД и САД при гипертонии как малого, так и большого кругов кровообращения. При МКТ-ЛГ уменьшается воспалительный процесс в легких, но сердечно-сосудистые показатели малого круга кровообращения не меняются. В случае РВГ гипертонии уменьшается ср. АД и САД, что не связано с выделительной способностью почки. Предполагается, что эффект уменьшения АД связан с уменьшением активности симпатической системы на фоне уменьшения воспалительного процесса.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента: Н. А. М., О. С. M., В. В. Ш., сбор данных, проведение эксперимента, обработка данных экспериментов: М. М. А., Т. А. К., Д. В. С., Д. А. А., В. В. Ш., написание и редактирование манускрипта: Н. А. М., О. С. М., В. В. Ш., М. М. А., Т. А. К.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета биологического факультета и факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова в рамках научного проекта Государственного задания Правительства Российской Федерации Московскому государственному университету имени М. В. Ломоносова №№ 121032300071-8 и 118011790188-5, при поддержке Российского Научного Фонда (проект № 24-25-00051) и Договора о научном сотрудничестве между Воронежским государственным медицинским университетом имени Н. Н. Бурденко и МГУ имени М. В. Ломоносова. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по биоэтике биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, протокол 113-G, 19.06.2020 г.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. М. Артемьева

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва

Т. А. Куропаткина

Российский экономический университет имени Г. В. Плеханова; Российский университет дружбы народов

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва; Москва

В. В. Шишкина

Воронежский государственный медицинский университет имени Н. Н. Бурденко

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Воронеж

Д. В. Серебряная

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова; Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Д. А. Адашева

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва

О. С. Медведев

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова; Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е. И. Чазова

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Н. А. Медведева

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Email: marinka.artemieva@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы