Maternal Methyl-Enriched Diet Improves Episodic Memory and Does Not Affect the Conditioned Fear Memory in Offspring of WAG/RIJ Rats

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Крысы линии WAG/Rij являются моделью наследственной absence-эпилепсии (АЭ) с коморбидной депрессией [1]. АЭ – неконвульсивная форма эпилепсии, характерным признаком которой является наличие спонтанных генерализованных пик-волновых разрядов (ПВР) на ЭЭГ, сопровождающихся отключением сознания (отсутствие реагирования на внешние стимулы). Первые одиночные ПВР у крыс линии WAG/Rij появляются примерно в возрасте 2–3 месяцев, а к 5–6-месячному возрасту число и длительность ПВР увеличиваются [1]. По мере увеличения числа и длительности ПВР у крыс линии WAG/Rij усиливаются симптомы депрессивноподобного поведения: пониженное предпочтение сахарозы в тесте потребления сахарозы (ангедония) и повышенный уровень иммобильности в тесте вынужденного плавания (поведенческая «депрессия») [1].

Несмотря на то, что патологический фенотип у крыс линии WAG/Rij генетически обусловлен, он может быть модифицирован под влиянием ранних средовых воздействий, таких как материнская забота [2, 3], обогащенная/обедненная среда [3], а также диета матери во время перинатального периода [3–8]. В качестве механизма ранних воздействий среды рассматриваются эпигенетические процессы, которые модулируют экспрессию генов без изменения последовательности ДНК. Одним из наиболее изученных эпигенетических механизмов является метилирование ДНК. Для осуществления процесса метилирования ДНК необходимы доноры метильных групп [3, 9]. Паттерн метилирования ДНК формируется на самых ранних стадиях онтогенеза, поэтому в перинатальном периоде он особенно чувствителен к воздействиям окружающей среды, прежде всего к составу материнской диеты [3].

Ранее была показана возможность коррекции проявлений АЭ и коморбидной депрессии у потомства крыс линии WAG/Rij с помощью метилобогащенной диеты (МОД) матери [3–5]. Установлено, что у потомства крыс линии WAG/Rij, матери которых потребляли МОД в перинатальном периоде, симптомы АЭ и коморбидной депрессии были выражены меньше по сравнению с потомством крыс линии WAG/Rij, матери которых потребляли контрольную диету [4, 5].

Когнитивные нарушения являются частью симптоматики как АЭ [10], так и депрессии [11, 12]. Так, у крыс линии WAG/Rij – генетической модели АЭ с коморбидной депрессией – было выявлено нарушение долгосрочной памяти в тесте «Платформа с отверстиями» и в тестах выработки условного рефлекса пассивного [1] и активного [13] избегания. При реверсивном обучении в сложном лабиринте крысы линии WAG/Rij медленнее выполняли прямую и обратную задачи и делали больше ошибок по сравнению с неэпилептическими крысами Wistar [14, 15]. В одной из наших предыдущих работ у крыс линии WAG/Rij были показаны нарушения эпизодической памяти в тесте распознавания нового объекта [16, 17]. Этосуксимид – препарат первого выбора при АЭ, не обладающий собственной антидепрессантной активностью [18, 19], подавлял пик-волновую активность, повышал исследовательскую мотивацию и улучшал эпизодическую память у крыс линии WAG/Rij [17]. У крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, которые потребляли МОД в перинатальном периоде, также было меньше генетически обусловленных ПВР (без изменения их длительности) по сравнению с контрольными крысами [4, 5].

Цель данной работы – выяснить, какое влияние оказывает МОД матери в перинатальном периоде на когнитивные функции (обучение и память) взрослого потомства крыс линии WAG/Rij. Для оценки когнитивных функций в данной работе использовали тесты распознавания нового объекта (РНО) и выработки условно-рефлекторной реакции страха (fear conditioning). Тест РНО использовали для оценки эпизодической памяти (по индексу распознавания нового объекта). Врожденная потребность животных в новизне, в том числе в исследовании новых объектов, формирует исследовательскую мотивацию, уровень которой в тесте РНО оценивали по числу выходов в центр арены и числу стоек без опоры [17]. Тест выработки условной реакции страха использовали для оценки памяти о страхе, связанном с контекстом и сигналом (по % реакций замирания). Выработка условнорефлекторной реакции страха (fear conditioning) основана на оборонительной мотивации: потребности животных в самозащите от внешнего негативного раздражителя (электрическое раздражение лап), который использовался в данном тесте как негативное подкрепление. Поскольку в качестве негативного подкрепления применяли умеренное болевое воздействие в виде электрического раздражения лап, необходимо было сравнить порог болевой чувствительности у животных экспериментальной и контрольной группы. Для этой цели использовали тест отдергивания хвоста (tail flick test).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Работа выполнена на 22 крысах-самцах линии WAG/Rij: 11 животных, рожденных матерями, потреблявшими МОД (экспериментальная группа), и 11 животных, рожденных матерями, потреблявшими контрольную диету (контрольная группа). Для получения потомства самкам крыс линии WAG/Rij предоставляли контрольную диету (КД) или МОД в течение одной недели до беременности, во время беременности и в течение одной недели после рождения детенышей.

Использовали следующие метилсодержащие добавки (на 1 кг пищи): холин – 5 г; бетаин – 15 г; фолиевая кислота – 15 мг; витамин В12 – 1.5 мг; L-метионин – 7.5 г; цинк – 150 мг. Для приготовления МОД метилсодержащие добавки смешивали с 4-зерновой кашей, творогом и свежими яйцами [4, 5]; для приготовления КД использовали только 4-зерновую кашу, творог и свежие яйца [4, 5].

Всех животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде по 4–5 особей в клетке (70 х 40 х 40), в условиях естественного цикла день – ночь (день около 10 ч).

Схема эксперимента. Оценку когнитивных функций – обучения и памяти проводили у взрослого потомства крыс линии WAG/Rij, рожденного матерями, потреблявшими МОД (экспериментальная группа) или КД (контрольная группа). Возраст животных контрольной и экспериментальной группы составлял 6–7 месяцев, когда ПВР и симптомы депрессии хорошо выражены [1]. Для оценки обучения и памяти в данной работе использовали тесты распознавания нового объекта (РНО) и выработки условно-рефлекторной реакции страха (fear conditioning). Оценку болевой чувствительности у животных экспериментальной и контрольной группы проводили в тесте отдергивания хвоста (tail flick test).

Процедура тестирования в сумме составляла 9 дней. Выработка условно-рефлекторной реакции страха с использованием негативного подкрепления оказывает стрессогенное воздействие на животных в большей степени, чем тест РНО, который основан на врожденном исследовательском поведении. Чтобы исключить потенциальное влияние негативного подкрепления – электрического раздражения лап на результаты теста РНО, был использован следующий порядок проведения тестов: 2 дня – тест РНО; 2 дня – перерыв; 2 дня – обучение и тестирование выработки условно-рефлекторной реакции страха; 2 дня – перерыв; 1 день – тест отдергивания хвоста. Выполнение поведенческих тестов в разные дни и наличие перерывов между ними позволяет значительно уменьшить влияние одного теста на результаты другого [20].

Тест РНО. В данной работе использована схема эксперимента, которая применялась в наших предыдущих работах [16, 17]. Исследование проводили на квадратной арене (80 х 80 см). Объекты находились на одинаковом (20 см) расстоянии от боковых стенок арены и друг от друга. Перед каждым тестом с новым животным арену и объекты протирали 70%-ным этиловым спиртом. Процедура тестирования составляла 2 дня.

1. В первый день проводили фазу адаптации (А): крысу сажали в центр арены (без объектов) и в течение 5 мин регистрировали следующие показатели поведения: число стоек с опорой и без опоры, число выходов в центр, число реакций груминга (короткие и длинные). Данные показатели регистрировали и анализировали в программе «RealTimer» (Open Science, Россия).
2. На следующем этапе исследования проводили фазу ознакомления (Т1), тестовую фазу 1 (Т2) и тестовую фазу 2 (Т3). В фазе ознакомления животным предъявляли два одинаковых объекта. Через 1 ч после фазы ознакомления проводили тестовую фазу 1 (Т2): один из знакомых объектов (ЗО) меняли на незнакомый объект (НО1). Через 24 ч после тестовой фазы 1 проводили тестовую фазу 2 (Т3): незнакомый объект 1 меняли на незнакомый объект 2 (НО2). Незнакомый объект отличался от знакомого по форме и цвету. В каждую из фаз тестирования (Т1, Т2 и Т3) крысу сажали в центр арены хвостом по направлению к предъявляемым объектам и в течение 5 мин регистрировали время (продолжительность) обследования каждого из объектов, а также число подходов к каждому из объектов и число переходов между ними. Эти показатели также регистрировали и анализировали в программе «RealTimer» (Open Science, Россия). Степень предпочтения незнакомого объекта характеризует индекс распознавания (ИР), который рассчитывают по формуле: ИР = (время обследования НО – время обследования ЗО)/(время обследования НО + время обследования ЗО) [21].

Выработка условно-рефлекторной реакции страха (fear conditioning). Условнорефлекторную реакцию страха вырабатывали в экспериментальной установке Startle and Fear Combined System компании PanLab Harvard apparatus (Испания, 2000). Установка состояла из камеры размером 250 × 250 × 250 мм, которая была помещена в звуконепроницаемую камеру размером 670 × 530 × 550 мм.

Память о страхе в тесте выработки условно-рефлекторной реакции страха оценивается по % реакций замирания (% freezing) на условные раздражители (контекст и звуковой сигнал), ассоциированные с электроболевым раздражением лап. Замиранием считали периоды неподвижности длительностью не менее 2 с, когда можно наблюдать только дыхательные движения животного. Замирание определяли по записи механограммы пола камеры с помощью амплитудного и временного порогов. Амплитудный порог зависел от массы тела крысы, коэффициента усиления и выставлялся таким образом, чтобы отсечь интервалы с активным движением животного.

Крыс тестировали в течение 2 дней. В первый день проводили обучение животных:

1) крысу помещали в звуконепроницаемую камеру, в течение 120 с животное исследовало камеру при включенном свете;

2) затем свет выключали и в течение 28 с подавали звуковой сигнал (60 дБ);

3) после окончания действия звука (свет был выключен) в течение 2 с производили электрокожное раздражение лап животного (2 мА);

4) в течение 30 с животное находилось без какого-либо воздействия в камере с включенным светом.

На второй день проводили тестирование выработанного условно-рефлекторного страха:

1) на 3 мин крысу помещали в камеру с включенным светом;

2) затем свет выключали и в течение 3 мин подавали звуковой сигнал.

Обработку данных проводили с помощью стандартной программы, прилагающейся к установке фирмы Panlab, которая позволяла идентифицировать реакции замирания и определять их длительность. Программа также позволяла регистрировать % реакций замирания (% freezing) – это процент времени замирания от времени регистрации. Данный показатель фиксировали до (реакция на контекст, context test) и во время (реакция на контекст и сигнальный раздражитель, cued test) действия звука в течение двух дней тестирования [22].

Стоит отметить, что замирания как проявление условно-рефлекторного страха внешне напоминают замирания у крыс линии WAG/Rij во время абсансов длительностью 2–5 с, которые сопровождаются подергиванием вибрисс и наклоном головы. Однако абсансные припадки возникают преимущественно во время пассивного бодрствования (33.1%) и легкого медленноволнового сна (48.4%). В экспериментальных ситуациях, вызывающих активное поведение животных, например, при проведении любых поведенческих тестов [1], особенно связанных с избеганием/ожиданием болевого воздействия, абсансные припадки не возникают. Поэтому замирания, связанные с абсансными припадками, не могут оказать существенного влияния на результаты выработки условно-рефлекторного страха у крыс линии WAG/Rij.

Тест отдергивания хвоста (оценка болевой чувствительности). Тест отдергивания хвоста – это один из тестов для определения болевой чувствительности и оценки анальгетических свойств у фармакологических препаратов [23]. Для определения болевой чувствительности с помощью теста отдергивания хвоста использовали долориметр проводимости компании IITC Life Science. Стимул подается в виде сфокусированного пучка света размером 4 х 6 мм на дорзальную поверхность хвоста («tail flick test»). Для этого животное удерживали на верхней панели долориметра таким образом, что его хвост располагался под установленным источником света. В момент фокусировки луча света на хвосте животного запускался таймер. Когда животное взмахивало хвостом, источник света выключали и таймер останавливали. Порогом болевой чувствительности считают период времени между началом термальной стимуляции хвоста животного и реакцией отдергивания хвоста (латентный период отдергивания хвоста). Латентный период отдергивания хвоста зависит от места приложения светового стимула: время реакции снижается по мере удаления точки приложения стимула от основания хвоста. Методика проведения теста для определения болевой чувствительности требует, чтобы болевое воздействие было хорошо ощутимо для животного, но не оказывало повреждений [23]. Поэтому расстояние от основания хвоста до точки приложения светового стимула в нашем исследовании составляло 5 см, так как это конечная точка самой «чувствительной» первой трети хвоста (длина хвоста крысы составляет в среднем 15 см, она примерно равна длине тела 15.8 ± 5.5 см).

Статистическая обработка данных. Обработку данных осуществляли с помощью пакета статистических программ «STATISTICA release 7». Тип распределения исследуемых показателей и степень его близости к нормальному определяли по критериям Колмогорова – Смирнова и Лиллиефорса (Kolmogorov–Smirnov & Lilliefors test). Если распределение показателя соответствовало критерию нормальности, использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) (для показателей в тестах РНО и tail flick test), а также однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями (one-way ANOVA with repeated measures) для % реакций замирания в тесте выработки условно-рефлекторной реакции страха. Последующее определение статистической значимости различий в средних значениях показателей проводили по post-hoc критерию Ньюмана – Кеулса (Newman–Keuls test). В случае несоответствия критерию нормальности применяли непараметрический аналог ANOVA – Kruskal-Wallis H test (one-way ANOVA by ranks) c последующим определением значимости различий между группами с использованием множественного сравнения (Multiple comparisons of mean ranks for all groups).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) показал отсутствие влияния фактора «диета матери» на длительность исследования правого объекта (F _{(1, 20)} = 1.7, p = 0.2), левого объекта (H _{(1, 23)} = 0.2, p = 0.7), а также на число подходов к правому (F _{(1, 20)} = 1.3, p = 0.3) и левому (F _{(1, 20)} = 0.9, p = 0.4) объекту в фазе ознакомления (предъявление двух одинаковых объектов). Эти показатели значимо не отличались у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД и КД (p > 0.05). Дисперсионный анализ также показал отсутствие значимых различий по времени исследования правого и левого объектов (H _{(1, 23)} = 0.1, p = 0.8 – МОД и H _{(1, 23)} = 2.8, p = 0.1 – КД) и по числу подходов к объектам (F _{(1, 20)} = 0.01, p = 0.9 – МОД и F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.8 – КД). Это свидетельствует о том, что исходное предпочтение правого или левого объекта у крыс линии WAG/Rij в обеих группах отсутствовало.

Для ИР1 в тестовой фазе 1 дисперсионный анализ показал значимость фактора «диета матери» (H _{(1, 23)} = 14.6, p < 0.01). Крысы линии WAG/Rij, рожденные матерями, потреблявшими МОД, ≈ в 1.8 раз дольше (p < 0.05) исследовали незнакомый объект (15.7 ± 2.1 с), чем крысы, рожденные матерями, потреблявшими КД (8.6 ± 2.1 с). Знакомый объект, напротив, животные, рожденные матерями, потреблявшими МОД, исследовали ≈ в 1.6 раз меньше (17.3 ± 3.7 с) по сравнению с животными контрольной группы (27.6 ± 3.7 с) (p < 0.05). Вследствие этого ИР1 у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД, был значимо больше, чем у крыс, рожденных матерями, потреблявшими КД (рис. 1, Т2). По числу подходов к правому (F _{(1, 20)} = 0.3, p = 0.6) и левому (F _{(1, 20)} = 1.4, p = 0.3) объекту, а также по числу переходов между фигурами (F _{(1, 20)} = 0.8, p = 0.4), характеризующих двигательную активность животных в этом тесте, различий между группами не наблюдали.

 

Рис. 1. Индекс распознавания нового объекта через 1 ч (ИР 1 – в тестовую фазу 1, Т2) и через 24 ч (ИР 2 – в тестовую фазу 2, Т3) после предъявления двух одинаковых объектов. CD – контрольная диета, MED – метилобогащенная диета. *p < 0.05 – у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД, по сравнению с крысами линии WAG/Rij, рожденными матерями, потреблявшими КД.

 

В отличие от ИР1 в тестовой фазе 1, для индекса распознавания в тестовой фазе 2 (ИР2) дисперсионный анализ показал отсутствие значимости факторов «диета матери» (F _{(1, 20)} = 0.9, p = 0.5). Длительность исследования как незнакомого (F _{(1, 20)} = 1.7, p = 0.2), так и знакомого объекта (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.8) значимо не отличалась у крыс экспериментальной группы по сравнению с контрольной. Вследствие этого межлинейные различия по ИР2 отсутствовали (рис. 1, Т3). Крысы линии WAG/Rij, рожденные матерями, потреблявшими МОД, не отличались от животных контрольной группы также ни по числу подходов к правому (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.9) или левому (F _{(1, 20)} = 0.4, p = 0.5) объекту, ни по числу переходов между объектами (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.7).

 

Таблица 1. Показатели поведения у крыс линии WAG/Rij в фазе адаптации в тесте РНО

Показатели поведения		КД	МОД
Число выходов в центр		1.2 ± 0.3	2.5 ± 0.3*
Число стоек без опоры		5.3 ± 1.1	10.5 ± 1.1+
Число стоек с опорой		4.5 ± 1.3	4.8 ± 1.3
Число реакций груминга	Короткие Длинные	0.5 ± 0.3	1.4 ± 0.3+
		1.6 ± 0.2	1.6 ± 0.2
Число болюсов		1.5 ± 0.4	0.9 ± 0.4

КД – контрольная диета, МОД – метилобогащенная диета. *p < 0.05 – у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД, по сравнению c крысами линии WAG/Rij, рожденными матерями, потреблявшими КД.⁺ 0.05 < p < 0.1 (тенденция).

 

Во время фазы адаптации между крысами экспериментальной и контрольной группы не наблюдали различий по числу стоек с опорой (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.9), по числу длинных реакций груминга (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.9) и по числу болюсов (F _{(1, 20)} = 1.1, p = 0.3). Различия между крысами экспериментальной и контрольной группы обнаружены по такому важному показателю исследовательской мотивации, как число выходов в центр арены (F _{(1, 20)} = 12.5, p = 0.01). У крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД (2.5 ± 0.3), этот показатель был ≈ в 2 раза больше, чем у животных, рожденных матерями, потреблявшими КД (1.2 ± 0.3). Различие между группами по другому показателю исследовательской мотивации, такому как число стоек без опоры (F _{(1, 20)} = 2.7, p = 0.07), было на уровне тенденции (у крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД, этот показатель был больше по сравнению с контрольной группой). Наблюдали также тенденцию к увеличению числа коротких реакций груминга (F _{(1, 20)} = 3.9, p = 0.06) (табл. 1).

Тест выработки условно-рефлекторной реакции страха ANOVA с повторными измерениями показал значимость фактора «день эксперимента» (1-й день – обучение, 2-й день – тестирование) (F _{(1, 20)} = 23.7, p < 0.001), а также значимость взаимодействия факторов «день эксперимента» и «диета матери» (F _{(1, 20)} = 13.1, p < 0.01) для % реакций замирания при помещении в камеру (до действия звука). Влияние фактора «диета матери» было незначимым (F _{(1, 20)} = 1.2, p = 0.2). У крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД (25.4 ± 5.2 – первый день тестирования; 67.1 ± 6.6 – второй день тестирования), также как и у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими КД (33.9 ± 5.2 – первый день тестирования; 63.9 ± 6.6 – второй день тестирования), % реакций замирания при повторном тестировании (при помещении в камеру без действия звука) значимо возрастал, что указывает на выработку условной эмоциональной реакции на контекст – contextual fear memory (рис. 2).

Для % реакций замирания при действии сигнального раздражителя – звука показана значимость фактора «день эксперимента» (F _{(1, 20)} = 14.2, p < 0.001), а также значимость взаимодействия факторов «день эксперимента» и «диета матери» (F _{(1, 20)} = 76.4, p < 0.001). Влияние фактора «диета матери» также было незначимым (F _{(1, 20)} = 0.1, p = 0.9). У крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД (25.7 ± 5.6 – первый день тестирования; 82.5 ± 5.6 – второй день тестирования), также как и у животных, рожденных матерями, потреблявшими КД (44.0 ± 8.1 – первый день тестирования; 82.7 ± 8.1 – второй день тестирования), % реакций замирания при повторном тестировании (при помещении в камеру при действии звука) значимо возрастал, что указывает на выработку условной эмоциональной реакции страха на сигнальный раздражитель – cued fear memory (рис. 2).

 

Рис. 2. Влияние МОД матери на выработку условно-рефлекторной реакции страха у крыс линии WAG/Rij. % реакций замирания в фоне во время обучения (a) и тестирования (c). % реакций замирания на условный стимул (звук) при обучении (b) и тестировании (d). По вертикали – % реакций замирания. 1 – % реакций замирания при помещении в камеру без действия звука (контекст), 2 – % реакций замирания при действии звука (сигнальный раздражитель). Размещенные над графиками серые линии, ограниченные с двух сторон, показывают каждую фазу теста с указанием их длительности. ## p < 0.01, ### p < 0.001 – в день тестирования (2-й день) по сравнению с днем обучения (1-й день).

 

По данным однофакторного дисперсионного анализа, фактор «диета матери» не оказал значимого эффекта на порог болевой чувствительности (F _{(1, 20)} = 1.8, p = 0.2) в тесте отдергивания хвоста. У крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД (2.8 ± 0.4 с), порог болевой чувствительности значимо не отличался от данного показателя у животных, рожденных матерями, потреблявшими КД (3.5 ± 0.4 с) (p = 0.2) (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние МОД матери на болевую чувствительность у крыс линии WAG/Rij (латентный период отдергивания хвоста, tail flick latency). CD – контрольная диета, MED – метилобогащенная диета.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В фазе ознакомления в тесте РНО ни экспериментальная, ни контрольная группа животных не проявляла предпочтение правого или левого объекта. Это говорит о том, что было выполнено одно из важнейших условий проведения теста РНО – отсутствие выраженного исходного предпочтения одной из двух одинаковых фигур.

В тестовой фазе 1 у крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД, ИР1 был значимо больше, чем у животных, рожденных матерями, потреблявшими КД. Это свидетельствует о том, что МОД оказала благоприятное воздействие на эпизодическую память у крыс в фазу тестирования 1, когда незнакомый объект предъявлялся через 1 ч после ознакомления животных с двумя одинаковыми объектами (фаза ознакомления). В тестовой фазе 2 у крыс экспериментальной группы не было обнаружено различий в ИР2 по сравнению с крысами контрольной группы. Вероятно, на второй день тестирования интерес к исследованию объектов у обеих групп животных снижается в одинаковой степени. Поэтому можно сделать вывод о том, что МОД не оказывала влияние на эпизодическую память у крыс в фазу тестирования 2 (через 24 ч после фазы ознакомления). Показано, что у исследуемых животных наибольшая длительность исследования нового объекта в тесте РНО наблюдается в начале тестовой фазы 1. Впоследствии данный показатель уменьшается, и в случае, если тестовая фаза 1 длится продолжительное время (разное для разных видов животных), незнакомый объект для исследуемого животного становится неотличим от знакомого [24]. В тестовой фазе 2 – через 24 ч после фазы ознакомления – большинство животных отличает новый предмет от знакомого [21, 25]. Однако межгрупповые различия в ИР2 обнаруживаются в большинстве случаев после фармакологических воздействий [21, 26]. Так, введение кофеина предотвратило вызванное скополамином нарушение эпизодической памяти, которая оценивалась спустя 1 и 24 ч после фазы ознакомления [26]. В нашей предыдущей работе было показано, что антиабсансный препарат этосуксимид подавлял пик-волновую активность и увеличивал как ИР1, так и ИР2 [17].

Межгрупповое различие ИР1 в тестовой фазе 1 достигалось за счет более длительного исследования незнакомого объекта животными экспериментальной группы и, напротив, более длительного исследования знакомого объекта животными контрольной группы [17, 21]. Помимо времени (длительности) исследования объектов, мы регистрировали число подходов к знакомому и незнакомому объекту, а также число переходов между объектами, которые служили показателями двигательной активности. Различия в двигательной активности отсутствовали у крыс, рожденных матерями, потреблявшими МОД по сравнению с КД как в тестовой фазе 1, так и в тестовой фазе 2. Это указывает на то, что выявленные различия в эпизодической памяти не могут быть связаны с изменением двигательной активности животных.

В нашей предыдущей работе [17] было показано, что у крыс линии WAG/Rij в возрасте 2 месяцев отсутствие хорошо выраженной пик-волновой активности и коморбидной депрессии сопровождалось отсутствием нарушений эпизодической памяти через 1 и 24 ч после фазы ознакомления в тесте РНО. В возрасте 6 месяцев крысы линии WAG/Rij демонстрировали нарушение эпизодической памяти в тестовой фазе 1 по сравнению со здоровыми крысами Wistar, что, вероятно, связано с проявлением в этом возрасте хорошо выраженных ПВР на ЭЭГ и симптомов депрессивноподобного поведения. Однако у 6-месячных животных не наблюдали значимых межлинейных различий в ИР2 – показателе эпизодической памяти, регистрируемом через 24 ч после фазы ознакомления [16, 17].

Тест РНО не требует предварительного обучения животных, он основан на врожденном исследовательском поведении грызунов. Важным проявлением исследовательского поведения является внимание – избирательная направленная активность животного на исследование незнакомого объекта [17, 21]. В нашей предыдущей работе [17] показано, что отсутствие избирательной направленности на исследование незнакомого объекта (отсутствие предпочтения незнакомого объекта по сравнению со знакомым) косвенно можно расценивать как дефицит внимания у крыс линии WAG/Rij. В настоящей работе показано, что животные экспериментальной группы дольше исследовали новый объект в Т2, и разница в ИР1 достигается не за счет числа подходов к незнакомому объекту, а за счет более длительного исследования нового объекта в Т2. Это может свидетельствовать о том, что МОД матери в перинатальном периоде оказывает благоприятное влияние на внимание у взрослого потомства крыс линии WAG/Rij.

Было высказано предположение [17] о том, что возможной причиной нарушений эпизодической памяти у крыс линии WAG/Rij может быть пониженный уровень исследовательской мотивации – одного из наиболее заметных поведенческих признаков депрессивных нарушений у животных. Как было показано ранее, стойки без опоры и выходы в центр арены во время стадии адаптации являются надежными поведенческими маркерами успешности последующего распознавания нового объекта в тесте РНО (по крайней мере в тестовой фазе 1, Т2). Так, обнаружена положительная корреляция между показателем эпизодической памяти в тесте РНО (ИР1) и такими показателями исследовательской мотивации, как число выходов в центр арены и число стоек без опоры [17]. В настоящей работе показано, что число выходов в центр арены и число стоек без опоры (на уровне тенденции) было больше у потомства крыс линии WAG/Rij, рожденного матерями, потреблявшими МОД по сравнению с КД. Таким образом, можно говорить о том, что МОД матери повышает исследовательскую мотивацию, что, наряду с улучшением внимания, улучшает эпизодическую память. Стоит отметить, что благоприятное влияние МОД матери на результаты теста РНО нельзя объяснить ее влиянием на уровень тревожности крыс линии WAG/Rij. В ранее проведенных тестах свето-темнового выбора, открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта различий в уровне тревожности между потомством крыс линии WAG/Rij, рожденным матерями, потреблявшими МОД или КД, не обнаружено [4, 5].

Действие МОД матери можно сравнить с эффектами антиабсансного препарата этосуксимида. Данный препарат, как было показано ранее, не обладает собственной антидепрессантной активностью [18, 19]. Этосуксимид подавлял симптомы АЭ и коморбидной депрессии, улучшал эпизодическую память в тесте РНО и повышал оба показателя исследовательской мотивации – число выходов в центр арены и число стоек без опоры у 6-месячных крыс линии WAG/Rij [17]. МОД матери во время перинатального периода также уменьшает проявление симптомов АЭ (уменьшает число ПВР без изменения их длительности) и коморбидной депрессии, повышает уровень исследовательской мотивации, исходно низкий у крыс линии WAG/Rij [17]. Эти данные свидетельствуют о том, что благоприятный эффект МОД матери на эпизодическую память в тесте РНО связан с коррекцией патологического фенотипа крыс линии WAG/Rij (симптомов АЭ и коморбидной депрессии), в том числе пониженной исследовательской мотивации [17].

У крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД, так же, как и у крыс этой линии, рожденных матерями, потреблявшими КД, % реакций замирания при повторном тестировании (при помещении в камеру без действия звука) значимо возрастал по сравнению с первым тестированием. Это указывает на выработку условной эмоциональной реакции страха на контекст – contextual fear memory. Аналогичная картина наблюдалась при повторном тестировании при помещении в камеру при действии звука: % реакций замирания значимо возрастал у животных экспериментальной и контрольной группы на второй день тестирования по сравнению с первым. Это значит, что обе группы крыс линии WAG/Rij – потомство матерей, потреблявших МОД и КД, выработали условную эмоциональную реакцию страха на контекст и сигнальный раздражитель (звук), а значимые различия между группами отсутствовали.

Учитывая тот факт, что МОД матери не оказала значимого эффекта на порог болевой чувствительности у крыс, можно сделать вывод о том, что реакция на негативное подкрепление была практически одинаковой у крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД и КД. У крыс исследуемой линии ранее было выявлено нарушение долгосрочной памяти в тестах выработки условного рефлекса пассивного [1] и активного [13] избегания в 5–6-месячном возрасте. Однако, по данным других авторов, в тесте пассивного избегания у крыс линии WAG/Rij в возрасте 5–6 месяцев не было обнаружено дефицита обучения и памяти. Нарушение долговременной памяти в этом тесте было показано у этих животных только в возрасте 13 месяцев [27].

В клинических исследованиях последних десятилетий представлены многочисленные данные о нарушениях в сфере внимания и особенно памяти при депрессии. Нарушения этих когнитивных функций наиболее ярко обнаруживаются при оперировании эмоционально окрашенными стимулами (феномены негативного сдвига и снижения чувствительности к положительной обратной связи) [28–34]. Для больных депрессией характерна пониженная чувствительность к поощрению, а также неадаптивный ответ на наказание [28–30]. Это проявляется в вероятностных задачах, основанных на принципах азартной игры (существуют наказание за ошибку и поощрение за верный ответ). Здоровые испытуемые демонстрируют сдвиг в сторону поощряемых ответов, в то время как при субклинических депрессиях и депрессивных расстройствах этот сдвиг минимизирован [28, 29].

Негативный сдвиг – избирательно повышенное внимание к потенциально угрожающим или фрустрирующим стимулам. Метаанализ показал, что пациенты с депрессией запоминают примерно на 10% больше негативных слов, чем позитивных [30]. Имеются данные о гиперреактивности больных на ошибку и негативную обратную связь, что нарушает их дальнейшую деятельность [31]. Вместе с тем имеются данные и об отсутствии этих признаков [31]. Нейровизуализационные исследования выявили аномальное возрастание нейронного ответа в ростральной части поясной извилины [32] и в миндалине [33] в ответ на предъявление испытуемым негативно окрашенной информации. Устойчивый сдвиг в сторону усиленной обработки негативной информации при этом объясняют недостаточной регуляцией активности со стороны префронтальной коры [34]. Примечательно, что гипофункция дофаминергической системы, выявленная у крыс линии WAG/Rij, начинается со снижения уровня дофамина в префронтальной коре в возрасте 2-х месяцев, когда фенотипические проявления АЭ [1] и депрессии [13] еще отсутствуют. В дальнейшем гипофункция дофаминергической системы мозга у крыс линии WAG/Rij нарастает, что сопровождается усилением симптомов АЭ и депрессии [1].

У пациентов с депрессией [31], так же, как и у моделей депрессии на животных, выявление феномена негативного сдвига вызывает некоторые трудности. У крыс линии WAG/Rij результаты тестов с использованием негативного подкрепления и их интерпретация остаются противоречивыми до настоящего времени [1, 13, 27]. Внимание к потенциально угрожающим стимулам, вызывающим страх, и целенаправленная адекватная реакция на них играют важнейшую роль в адаптации субъекта к постоянно меняющимся условиям окружающей среды. Эта адаптивная функция связана с возможностью возникновения ассоциаций между нейтральными стимулами, включая контекст, и негативным событием. Отсюда следует вывод о том, что выявить нарушения памяти о страхе при обучении с отрицательным подкреплением у животных моделей депрессии практически невозможно, если оценивать состояние памяти о страхе однократно. Одна из известных экспериментальных моделей депрессии – мыши линии Disc1-Q31L несут точечную мутацию во 2-м экзоне гена Disc1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1), приводящую к замене глицина на лейцин в положении 31-й аминокислоты в белке DISC1 [35]. Для этой мутантной линии показано нарушение процесса угашения условной реакции пассивного избегания. У самцов мышей линии Disc1-Q31L достижение полного угашения было выявлено только во время 19-го тестирования (у контрольных мышей – во время 10-го тестирования). У самок линии Disc1-Q31L не было обнаружено угашения условной реакции пассивного избегания в течение всех 24 дней теста [36]. Интересно, что различия в выработке условной реакции пассивного избегания между мутантными (депрессивными) и контрольными мышами не обнаружены. Известно, что мутация Disc1-Q31L вызывает истощение основных нейротрансмиттеров (дофамина, серотонина и норадреналина), что проявляется большим спектром депрессивноподобных нарушений поведения, в том числе нарушением угашения условной реакции пассивного избегания [35, 36]. Можно предположить, что влияние МОД матери на память об условно-рефлекторном страхе могло бы быть выявлено у крыс линии WAG/Rij при исследовании угашения условной реакции страха.

Таким образом, в настоящей работе впервые установлено, что МОД матери во время перинатального периода улучшает эпизодическую память в тесте РНО, основанном на врожденном исследовательском поведении, но не влияет на память о страхе, обусловленном негативным подкреплением, у взрослого потомства крыс линии WAG/Rij.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. МОД матери в перинатальном периоде улучшает эпизодическую память у взрослого потомства крыс линии WAG/Rij в тесте РНО, оцениваемую через 1 ч после предъявления двух одинаковых объектов.
2. Предполагается, что благоприятный эффект МОД матери на эпизодическую память у потомства крыс линии WAG/Rij основан на повышении исследовательской мотивации.
3. МОД матери не влияет на память об условно-рефлекторном страхе, обусловленном негативным подкреплением: обе группы крыс линии WAG/Rij, рожденных матерями, потреблявшими МОД и КД, выработали условную эмоциональную реакцию страха на контекст и сигнальный раздражитель (звук). Значимые различия между группами не обнаружены.
4. МОД матери не оказала значимого эффекта на порог болевой чувствительности у крыс линии WAG/Rij.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

WAG/Rij – Wistar Albino Glaxo/Rijswijk

АЭ – абсанс-эпилепсия

ПВР – пик-волновые разряды

МОД – метилобогащенная диета

КД – контрольная диета

РНО – распознавание нового объекта

ЗО – знакомый объект

НО – незнакомый объект

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (К.Ю.С.); постановка экспериментов, сбор данных (Е.А.Ф., А.Б.Ш.); обработка данных (Е.А.Ф.); написание и редактирование рукописи (Е.А.Ф., К.Ю.С.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20–015–00327a). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по этике Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, протокол № 5 от 02.12.2020 г.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

E. A. Fedosova

Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of RAS

Author for correspondence.
Email: ekaterina5fedosova@rambler.ru
Russian Federation, Moscow

A. B. Shatskova

Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of RAS

Email: ekaterina5fedosova@rambler.ru
Russian Federation, Moscow

K. Yu. Sarkisova

Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of RAS

Email: ekaterina5fedosova@rambler.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files