Changes of transcriptomic activity in rat brain cells under the influence of synthetic adrenocorticotropic hormone-like peptides

封面

如何引用文章

全文:

详细

Synthetic peptides have a wide range of clinical effects. Of particular interest are peptides based on adrenocorticotropic hormone (ACTH) both as already used and as potential drugs for preventing the consequences of cerebral ischemia. However, it is necessary to study the peptide influence on brain cells under normal physiological conditions, including understanding the risks of their use. Here, we used high-throughput RNA sequencing (RNA-Seq) to identify differentially expressed genes (DEGs) in the frontal cortex of rats receiving intraperitoneal administration of ACTH-like peptides ACTH(4-7)PGP (Semax) and ACTH(6–9)PGP or saline. We identified 258 and 228 DEGs, respectively, with a threshold of > 1.5 and Padj < 0.05 at 22.5 hours after the first administration of Semax and ACTH(6-9)PGP. Metabolic pathways, characterizing both the general and specific effects of peptides on the transcriptome were identified. Both peptides predominantly caused a decrease in the expression of genes associated with the immune system. At the same time, when comparing the effects of ACTH(6-9)PGP relative to Semax, DEGs were identified that characterized the main differences in the effects of the peptides. These genes were mostly downregulated and associated with neurosignaling systems and regulation of ion channels and characterized differences in the effects of peptides. Our data show how differences in the structure of ACTH derivatives are associated with changes in the brain cell transcriptome following exposure to these related peptides. Furthermore, our results evident that when studying the influence of regulatory peptides on the transcriptome in pathological conditions, it is necessary to take into account their actions under normal physiological conditions.

全文:

Принятые сокращения: ДЭГ – дифференциально экспрессируемые гены; КП1–КП4 – кластеры путей, характеризующих эффекты пептидов; Gapdh – ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы; NA – «норма + АКТГ(6–9)PGP»; NS – «норма + семакс»; NV – «норма + физраствор»; Padj – значение вероятности p, скорректированное с поправкой Бенджамини–Хохберга; PGP – Pro-Gly-Pro; pMCAO – необратимая окклюзия средней мозговой артерии; RIN – показатель целостности РНК (RNA integrity number); RNA-Seq – высокопроизводительное секвенирование РНК; Rpl3 – ген 60S-рибосомного белка L3; tMCAO – обратимая окклюзия средней мозговой артерии; АКТГ – адренокортикотропный гормон; АКТГ(4–7)PGP – Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, семакс; АКТГ(6–9)PGP – His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro.

ВВЕДЕНИЕ

Пептиды представляют собой уникальный класс фармацевтически значимых соединений с высокой биосовместимостью, низкой иммуногенностью, мягким действием и минимальными побочными эффектами [1–5]. В частности, большое внимание привлекают пептиды на основе адренокортикотропного гормона (АКТГ) для создания нейропротективных препаратов [6–9]. Известно, что α-меланоцитстимулирующий гормон (α-МСГ), аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности фрагмента АКТГ (1–13), оказывает выраженное противовоспалительное, нейрогенное и нейропротекторное действие на моделях ишемического инсульта [10, 11]. На основе фрагментов АКТГ удалось создать пептиды полностью свободные от гормональной активности. Так, синтетический пептид АКТГ(4–7)PGP (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), известный как семакс, уже применяется для лечения широкого круга патологических и стрессовых состояний, включая острый ишемический инсульт, в качестве нейропротекторного препарата, обладающего терапевтическим эффектом без развития лекарственной зависимости или синдрома отмены [12]. Семакс способен проходить через гематоэнцефалический барьер, в том числе при внутривенном введении [13]. Использование С-концевого трипептида Pro-Gly-Pro (PGP) в структуре семакса увеличивает продолжительность его действия по сравнению с исходным фрагментом АКТГ(4–7). Семакс оказывает ноотропное действие, стимулируя процессы обучения, внимания и формирования памяти [14]. Кроме того, семакс был успешно использован при лечении сосудистых, токсико-аллергических и воспалительных заболеваний зрительного нерва параллельно с основной нейротрофической и противовоспалительной терапией [15]. Аналог семакса, синтетический пептид АКТГ(6–9)PGP (His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro), также обладает ноотропными эффектами, в особенности влияя на процессы обучения [16–18]. Более того, этот пептид повышал жизнеспособность культивируемых корковых нейронов [18] и защищал клетки линии SH-SY5Y от пероксидной и цианидной цитотоксичности [19]. В настоящее время АКТГ(6–9)PGP проходит доклинические испытания и, на наш взгляд, имеет большие перспективы клинического использования.

В последние годы транскриптомика стала эффективным подходом для изучения механизмов патологических процессов при различных заболеваниях и поиска молекулярных мишеней для их медикаментозного лечения. Полногеномные методы анализа транскриптома, включая микрочипы и высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-Seq), дают сведения об экспрессии отдельных генов и позволяют идентифицировать сигнальные пути, нарушение которых приводит к развитию многих заболеваний. Существует множество примеров использования транскриптомного анализа для изучения механизмов действия ряда пептидов, в том числе орексина-А [20], VR-10 [21], семаглутида [22], имеющих значение для медицины. Нами ранее с помощью полногеномного анализа также было изучено влияние семакса на транскриптом мозга крыс в условиях моделей церебральной ишемии [23–25]. В одном из последних исследований мы изучили влияние двух АКТГ-подобных пептидов – семакса и АКТГ(6–9)PGP – на транскриптом мозга через 4,5 ч после обратимой окклюзии правой средней мозговой артерии (tMCAO) у крыс [26]. Данные пептиды представляют собой гибриды фрагментов АКТГ и глипролина Pro-Gly-Pro. В их структуру входили перекрывающиеся участки аминокислотной последовательности (рис. 1, а). Для анализа нами был выбран участок фронтальной коры, который содержал как здоровую ткань, так и способные к восстановлению клетки пенумбры (рис. 1, б). Мы показали, что как семакс, так и АКТГ(6–9)PGP могут частично предотвращать изменения в профилях экспрессии генов нейросигнализации и иммунной системы, нарушенных действием ишемии через 4,5 ч после tMCAO. При этом было выявлено и различное действие пептидов в отношении преимущественно генов иммунной системы [26]. Таким образом, в результате проделанной работы мы выявили сходство и различие эффектов АКТГ-подобных пептидов на транскриптом в ранние часы после экспериментальной ишемии в зависимости от их структуры.

 

Рис. 1. Структура пептидов АКТГ(4–7)PGP (семакс) и АКТГ(6–9)PGP (а). Схематическое изображение среза мозга крысы с указанием штриховкой локализации участка лобной коры, взятого для секвенирования РНК (б). Схема исследования (в)

 

В настоящем исследовании впервые была поставлена цель изучить влияние родственных АКТГ-подобных пептидов на транскриптом клеток фронтальной коры мозга крыс в условиях физиологической нормы, в том числе для понимания рисков их использования. С помощью RNA-Seq мы проанализировали изменения профиля экспрессии генов участка фронтальной коры крыс после трехкратного внутрибрюшинного введения семакса и АКТГ(6–9)PGP. Был выявлен общий эффект снижения экспрессии генов иммунной системы под действием семакса и АКТГ(6-9)PGP в участке фронтальной коры у крыс, что может лежать в основе иммуномодулирующего и нейропротективного эффектов данных пептидов. Также были выяснены специфические эффекты для каждого из пептидов на транскриптом, прежде всего, относящиеся к активности генов систем нейросигнализации и регуляции ионных каналов. Спрогнозирована генная сеть, иллюстрирующая вовлеченность метаболических систем клетки в проявление влияния АКТГ-подобных пептидов на клетки мозга. Таким образом, полученные данные показывают, как различия в структуре родственных пептидов связаны с молекулярно-генетическими механизмами их действия в мозге в нормальных физиологических условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Белых 2-месячных самцов крыс Wistar массой 200–250 г содержали при 12-часовом цикле смены дня и ночи при температуре 22–24 °C со свободным доступом к пище и воде. Животные были случайным образом разделены на три группы: «норма + физраствор» (NV); «норма + семакс» (NS); «норма + АКТГ(6–9)PGP» (NA). Каждая группа включала по 5 животных. Схема исследования представлена на рис. 1, в.

Пептиды и их введение. АКТГ(4–7)PGP (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, семакс) и АКТГ(6–9)PGP (His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro) были синтезированы в Лаборатории молекулярной фармакологии пептидов НИЦ «Курчатовский институт».

Все животные получали трехразовые внутрибрюшинные инъекции пептидов (100 мкг на 1 кг массы животного) или физиологического раствора с интервалами в 1 ч и 4 ч. Объем разовой инъекции составлял 100 мкл на 100 г массы животного. Физиологический раствор вводили в эквивалентном объеме в соответствующие сроки. Время, дозировка и способ введения пептидов были выбраны на основе предыдущих исследований [23–25, 27–30]. Животных выводили из эксперимента методом декапитации через 22,5 ч после первой инъекции.

Получение ткани. Из мозга крыс была извлечена область фронтальной коры (участок (+2)–(+5) мм от брегмы), соответствующая области, содержащей жизнеспособные клетки и клетки с ишемическим повреждением у животных, подвергнутых tMCAO, как описано ранее [26]. На рис. 1, б показано схематическое изображение среза мозга с указанием локализации участка лобной коры, взятого для секвенирования РНК. Образцы данной ткани помещали в раствор RNAlater на 24 ч при 0 °С, а затем хранили при –70 °С.

Получение РНК. Из полученных образцов участка фронтальной коры крыс была выделена тотальная РНК при помощи реагента Trizol («Invitrogen» и «Thermo Fisher Scientific», США), согласно рекомендации производителя. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой 1 («Thermo Fisher Scientific») в присутствии ингибитора РНКаз RiboLock RNase Inhibitor («Thermo Fisher Scientific») в соответствии с рекомендациями производителя. Качество и количество выделенной тотальной РНК проверяли на приборе BioAnalyser с помощью RNA 6000 Nano Kit («Agilent», США). Показатель целостности РНК (RNA integrity number, RIN) был не менее 9.

Полногеномное секвенирование РНК (RNA-Seq). Фракцию полиА РНК получали из тотальной РНК при помощи олигоТ магнитных шариков Dynabeads® mRNA Purification Kit («Ambion», США). Далее, из полиА РНК были приготовлены библиотеки для массового параллельного секвенирования при помощи набора NEBNext® mRNA Library Prep Reagent Set («NEB», США). Концентрацию библиотек определяли при помощи набора Qubit dsDNA HS Assay Kit на приборе Qubit 2.0 («Thermo Fisher Scientific»). Распределение длин фрагментов библиотеки проводили при помощи набора Agilent High Sensitivity DNA Kit («Agilent»). RNA-Seq проводили на приборе HiSeq1500 («Illumina», США) с генерацией не менее 10 млн коротких чтений длиной 1 × 50 нуклеотидов. Для RNA-Seq каждая группа (NV, NS и NA) включала по 3 животных (рис. 1, в).

Обработка результатов RNA-Seq. Для картирования и подсчета количества прочтений были использованы программы Tophat и Cufflinks. Уровень экспрессии генов рассчитывался как число фрагментов на килобазу, отнесенное на миллион прочтений (fragments per kilobase per million reads, FPKM) с использованием программы Cuffdiff. Дифференциально экспрессированными генами (ДЭГ) считались только те гены, которые изменили уровень своей экспрессии больше чем в 1,5 раза. Значимыми считались различия, имеющие значение вероятности p (t-тест), скорректированное с поправкой Бенджамини–Хохберга (Padj) < 0,05.

Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Синтез кДНК проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкг РНК, с использованием реагентов набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit («Thermo Fisher Scientific, Baltics UAB», Литва) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа мРНК использовали праймеры Oligo(dT)18.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Синтезированная кДНК была использована в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I («Евроген», Россия). Праймеры были подобраны с помощью Oligo Analyzer Tool (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer) и синтезированы компанией «Евроген» (табл. 1). Амплификацию кДНК проводили на приборе StepOnePlus™ Real-Time PCR System («Applied Biosystems», США), как описано ранее [16]. Каждая группа включала по 5 животных (рис. 1, в).

Обработка результатов ПЦР в реальном времени. Каждый образец кДНК анализировали трижды. Из трех повторных измерений было рассчитано среднее значение порогового цикла (Ct). Уровень мРНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Gapdh) и гена 60S-рибосомного белка L3 (Rpl3) был использован для нормализации результатов ПЦР. Одиночные пики на кривых плавления свидетельствовали, что при амплификации с каждой парой используемых праймеров синтезировался единственный продукт ПЦР. Расчеты были проведены с использованием Relative Expression Software Tool (REST) 2005 software [31]. Для оценки содержания исследуемых мРНК относительно мРНК генов сравнения была использована формула:

ECt(ref) / ECt(tar), (1)

где E – эффективность ПЦР-реакции; Ct(tar) – средняя величина порогового цикла амплификации (Ct) для исследуемых РНК; ECt(ref) – среднее геометрическое ECt для мРНК генов сравнения (Gapdh и Rpl3).

Эффективности ПЦР оценивали с использованием амплификации серии стандартных разведений кДНК. Значения эффективностей для всех реакций ПЦР находились в пределах 1,89–2,07 (табл. 1). При сравнении групп данных между собой статистически значимыми считались различия со значением вероятности р < 0,05 (two-sided Pair-Wise Fixed Reallocation Randomization Test). Дополнительную обработку данных проводили при помощи программы Microsoft Excel.

 

Таблица 1. Характеристика праймеров для ПЦР в реальном времени

Ген

Последовательность праймеров (5′–3′): прямой (F), обратный (R)

RefSeq

Длина (п.н.)

E ± SE

Rt1-Da

F: AGATGCCAATGTGATTCCAGAGGT

R: ACAAACAACCCGAGAACA

NM_001008847

360

1,93 ± 0,03

Rt1-Db1

F: TCTGCTCTGTGAGTGACTTCTA

R: GAAGGTCCAGTCTCCATTT

NM_001008884

119

2,07 ± 0,06

Rt1-Ba

F: TGTGGAGGTCAAGACGACATT

R: AAAGCAGATGAGGGTGTT

NM_001008831

344

1,92 ± 0,03

Cxcl13

F: TCTACTGGCCATCTGCCTCC

R: TAATACTTCTGCTTCGGACAAAT

NM_001017496

257

1,99 ± 0,05

Cxcl9

F: AGTCCGTTGCTCTATTCCTCA

R: TCTTTTGCTTTTTCTTTTGGCT

NM_145672

294

2,03 ± 0,11

Fos

F: TGAAGAGGAAGAGAAACGGAGA

R: ACTCTGGGGTGGTAGCCTCA

NM_022197.2

302

1,89 ± 0

Drd1

F: CATAGAGACGGTGAGCATTA

R: TGTGTGTGACAGGTTGGAT

NM_012546

251

1,96 ± 0

Drd2

F: CCAGGATTGCCAAGTTCTT

R: TTGACGGCACTGTTGACATA

NM_012547

262

1,95 ± 0

Gapdh

F: ACTCTACCCACGGCAAGTTCAACG

R: GTAGACTCCACGACATACTCAGCAC

NM_017008.4

148

2,01 ± 0,03

Rpl3

F: ATGGGTCCTTGGGCTTCTTG

R: CACAATACCCACAACCACCA

NM_198753.2

239

1,90 ± 0,03

Примечание. E ± SE – эффективность ПЦР ± стандартная ошибка среднего; RefSeq – идентификатор референсной нуклеотидной последовательности мРНК; п.н. – пары нуклеотидов.

 

Анализ функциональных аннотаций генов. Программы для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID v2021) [32] и для анализа обогащения наборов генов (GSEA) [33] использовались при аннотировании функций ДЭГ. При сравнении групп данных статистически значимые различия учитывали с вероятностью Рadj < 0,05 (с поправкой Бенджамини–Хохберга в DAVID v2021 и FDR – в GSEA).

Иерархический кластерный анализ. Иерархический кластерный анализ ДЭГ проводился с использованием Heatmapper [34].

Генные сети. Программное обеспечение Cytoscape 3.9.2 использовалось для визуализации регуляторной сети [35].

Другие расчеты и построения, включая графики «Volcano-plot», были построены с помощью Microsoft Excel (Microsoft Office 2010, Microsoft, США).

Доступность данных и материалов. Данные RNA-Seq были депонированы в базу данных Sequence Read Archive под кодом доступа PRJNA1086759 (https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1086759?reviewer=fbc3pamv9qhevsbek8nug5oh75).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

RNA-Seq-анализ влияния АКТГ-подобных пептидов на транскриптом участка фронтальной коры крыс. В результате RNA-Seq были получены данные об изменении уровня мРНК под действием семакса и АКТГ(6–9)PGP для 17 367 генов крысы. Графики «volcano-plot» иллюстрируют различия в экспрессии мРНК между группами NS относительно (vs.) NV (рис. 2, а) и NА vs. NV (рис. 2, б). Мы обнаружили 258 ДЭГ (кратность > 1,5; Padj < 0,05) под действием семакса в группе NS vs. NV. Из них 105 генов (Lefty2, Bc1, Psma8, Erbb4, Kcnh5 и др.) повысили уровень экспрессии и 153 гена понизили его (Cyp4a8, Nphs1, Prlr, Trim31, Cd247 и др.). Величины дифференциальной экспрессии перечисленных генов представлены на рис. 2, в. Также мы обнаружили 228 ДЭГ под действием АКТГ(6-9)PGP в группе NA vs. NV. Из них 44 гена, в том числе Lefty2, Bc1, Psma8, Morf4l1, Cdc6, повысили уровень экспрессии и 184 гена, включая Mis18a, Plac8, Nphs1, Prlr, Cd247, понизили его. Величины дифференциальной экспрессии перечисленных выше генов представлены на рис. 2, г.

 

Рис. 2. RNA-Seq-анализ влияния семакса и АКТГ(6–9)PGP на транскриптом участка фронтальной коры крыс. Графики «volcano-plot» иллюстрируют различия в экспрессии мРНК между группами «норма + семакс» (NS) и «норма + физраствор» (NV) (а), а также «норма + АКТГ(6–9)PGP» (NA) и «норма + физраствор» (NV) (б). Представлено по 10 ДЭГ, которые продемонстрировали наибольшее кратное изменение экспрессии в сравнениях NS vs. NV (в) и NA vs. NV (г). В каждую группу сравнения входило по 3 животных. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего

 

Для проверки результатов RNA-Seq на расширенной выборке животных мы использовали ПЦР в реальном времени. В анализ были взяты гены, изменившие экспрессию в соответствии с критерием отбора Padj < 0,05 (Cxcl9, Cxcl13, Rt1-Ba, Rt1-Da, Rt1-Db1) и p < 0,05 (Fos, Drd1, Drd2) в сравнении NS vs. NV. Результаты ПЦР в реальном времени адекватно соответствовали результатам RNA-Seq и проиллюстрированы на рис. П1 в Приложении 1.

Cравнение результатов RNA-Seq в экспериментах с введением семакса и АКТГ(6–9)PGP крысам. На следующем этапе нами было проведено сравнение спектров ДЭГ, изменивших уровень мРНК под действием семакса (NS vs. NV) и АКТГ(6–9)PGP (NA vs. NV) в участке фронтальной коры крыс. На рис. 3, а в форме диаграммы Венна показан 161 ДЭГ, обнаруженные в обоих сравнениях. Все гены сонаправлено изменили уровень как в ответ на семакс, так и АКТГ(6–9)PGP в участке фронтальной коры крыс. На диаграммах Венна показаны ДЭГ, только повысившие (рис. 3, б) и только понизившие (рис. 3, в) уровень мРНК в изучаемых группах сравнения. Так, в числе повысивших экспрессию ДЭГ в обеих группах сравнения с максимальной кратностью изменений выявлены, в частности, гены Lefty2, Bc1, Psma8, Morf4l1, Slc1a2, а в числе понизивших экспрессию – Cd247, Prlr, Nphs1, Plac8, Mx2 (рис. 3, г).

 

Рис. 3. Сравнение результатов RNA-Seq в экспериментах с введением семакса и АКТГ(6–9)PGP. Диаграммы Венна (а–в) иллюстрируют результаты, полученные для двух попарных сравнений «норма + семакс» (NS) vs. «норма + физраствор» (NV) и «норма + АКТГ(6–9)PGP» (NA) vs. «норма + физраствор» (NV): для всех ДЭГ (а), только для повысивших экспрессию (б) и только для понизивших экспрессию (в). Числа в пересечении различных наборов генов на диаграмме Венна указывают количество ДЭГ (кратность > 1,5; Padj < 0,05) по данным RNA-Seq. Показаны величины относительной экспрессии для 10 генов из каждого сегмента на диаграмме Венна (панель а): гены с наибольшим кратным изменением экспрессии в NS vs. NV и лежат в пределах пересечения наборов ДЭГ (г); ДЭГ с наибольшим кратным изменением экспрессии в NS vs. NV, но не являющиеся ДЭГ в NA vs. NV (д); ДЭГ с наибольшим кратным изменением экспрессии в NA vs. NV, но не являющиеся ДЭГ в NS vs. NV (е). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего

 

Были выявлены также гены, которые изменили экспрессию в ответ на введение только одного из пептидов. Для семакса было 97 таких генов (рис. 3, а), в первые 10 генов с максимальной кратностью изменений вошли гены Erbb4, Kcnh5, Lnpep, Fzd3, Cacna1e из числа повысивших и Nek8, Sla, Fos, Klhl14, Gzmb из числа понизивших экспрессию в NS vs. NV (рис. 3, д). Для АКТГ(6–9)PGP – 67 генов, которые были в числе изменивших экспрессию в сравнении NA vs. NV, но не входили в число ДЭГ в сравнении NS vs. NV (рис. 3, а). Среди них гены Nr4a2, Etaa1, Strn3, Cnr2, Ifit2, Eif4ebp3, Trh, Eya2, Cd68, Ifi35 были в числе первых 10 генов с максимальной кратностью изменений экспрессии в NA vs. NV (рис. 3, е).

Cравнение результатов RNA-Seq в экспериментах с введением АКТГ(6–9)PGP крысам относительно действия семакса. В условиях эксперимента в участке фронтальной коры крыс после введения АКТГ(6–9)PGP по сравнению с группой животных, получавшей семакс (NA vs. NS), мы выявили 36 ДЭГ (3 повысивших и 33 снизивших экспрессию). График «volcano plot» иллюстрирует различия в экспрессии мРНК между группами NA и NS (рис. 4. а). Отдельно 10 генов (Cacng8, Fos, Arc, Slc1a2, Lmbrd2, Fzd3, Slc9a7, Kcnh5, Lnpep, Erbb4) с максимальной кратностью изменений экспрессии в сравнении NA vs. NS показаны на рис. 4, б.

 

Рис. 4. Сравнение результатов RNA-Seq в экспериментах с введением АКТГ(6–9)PGP относительно действия семакса. График «volcano-plot» иллюстрирует различия в экспрессии мРНК между группами «норма + АКТГ(6–9)PGP» (NA) и «норма + семакс» (NS) (а). Представлены 10 генов, которые продемонстрировали наибольшее кратное изменение экспрессии в сравнении NA vs. NS (кратность > 1,5; Padj < 0,05) по данным RNA-Seq (б)

 

Величины дифференциальной экспрессии всех ДЭГ, выявленных при действии изучаемых пептидов в NS vs. NV, NA vs. NV и NA vs. NS, представлены в табл. П1 в Приложении 2. Результаты иерархического кластерного анализа этих генов проиллюстрированы на рис. П2 в Приложении 1, выражая как общие, так и специфические черты действия каждого из пептидов на транскриптом участка фронтальной коры крыс.

Функциональные аннотации ДЭГ, связанных с влиянием АКТГ-подобных пептидов. Списки ДЭГ, полученные на предыдущем этапе, были обработаны нами в программе анализа функционального обогащения DAVID v2021. Было выявлено 1, 16 и 37 сигнальных путей, аннотированных в терминах баз данных KEGG PATHWAYS и REACTOME PATHWAYS и ассоциированных с ДЭГ в группах сравнения NA vs. NS, NS vs. NV и NA vs. NV соответственно (рис. 5, а). Так, в группе сравнения NS vs. NV наибольшей значимостью обладали пути, связанные с иммунным и воспалительным ответом, включая путь системы комплемента и коагуляции (Complement and coagulation cascades). В число наиболее значимых сигнальных путей в группе сравнения NA vs. NV были системы комплемента и коагуляции, врожденная иммунная система (Innate Immune System), иммунная система (Immune System), также системы, связанные с иммунной. Все перечисленные пути были связаны преимущественно с понизившими экспрессию ДЭГ как в сравнении NS vs. NV, так и в NA vs. NV и входили в 15 путей, являющихся общими для действия обоих пептидов (рис. 5, а и б). Эти пути, характеризующие общее влияние семакса и АКТГ(6–9)PGP на транскриптом участка фронтальной коры крыс, были обозначены нами как первый кластер путей (КП1).

 

Рис. 5. Сигнальные пути, связанные с влиянием семакса и АКТГ(6–9)PGP на транскриптом участка фронтальной коры крыс. Анализ проводился с помощью программы DAVID v2021. Схематическое сравнение аннотаций (путей), связанных с ДЭГ, полученных в трех парных сравнениях NS vs. NV, NA vs. NV и NA vs. NS в форме диаграммы Венна (а). Количество аннотаций указано цифрами в сегментах диаграммы. Показаны сигнальные пути, лежащие в сегментах на диаграмме Венна: общие для сравнений NS vs. NV и NA vs. NV (б), а также специфичные для сравнений NS vs. NV (в), NA vs. NV (г) и NA vs. NS (д). На панелях (б), (в) и (д) показаны все пути, лежащие в соответствующем сегменте на диаграмме Венна, а на панели (г) – только 5 из 22 путей с минимальной величиной Padj (значение p, скорректированное с использованием процедуры Бенджамини–Хохберга) в NA vs. NV. Для каждого пути представлены значения Padj, а также количество повысивших и понизивших экспрессию генов в соответствующем попарном сравнении. Для анализа были выбраны только ДЭГ и пути с Padj < 0,05. В каждую группу сравнения входило по 3 животных. Inflammatory bowel disease – воспалительное заболевание кишечника; NOD-like receptor signaling pathway – сигнальный путь NOD-подобного рецептора; Tuberculosis – туберкулез; Coronavirus disease – COVID-19 (коронавирусная болезнь); Influenza A – грипп А; Systemic lupus erythematosus – системная красная волчанка; Antigen processing and presentation – обработка и презентация антигена; Phagosome – фагосома; Pertussis – коклюш; Leishmaniasis – лейшманиоз; Complement and coagulation cascades – каскады комплемента и коагуляции; Epstein-Barr virus infection – инфекция вируса Эпштейна–Барр; Immune System – иммунная система; Staphylococcus aureus infection – инфекция золотистого стафилококка; Innate Immune System – врожденная иммунная система); Th17 cell differentiation – дифференцировка клеток T-хелперов 17; Immunoregulatory interactions between a Lymphoid and a non-Lymphoid cell – иммунорегуляторные взаимодействия между лимфоидными и нелимфоидными клетками; Neutrophil degranulation – дегрануляция нейтрофилов; Viral myocarditis – вирусный миокардит; Herpes simplex virus 1 infection – инфекция вируса простого герпеса 1; Natural killer cell mediated cytotoxicity – цитотоксичность, опосредованная естественными клетками-киллерами; Neuronal System – нейронная система

 

Семакс в группе сравнения NS vs. NV был связан с модуляцией активности пути клеточной дифференцировки Т-хелперов 17 (Th17 cell differentiation). Этот путь не был выявлен в случае АКТГ(6–9)PGP в сравнении NA vs. NV (рис. 5, а и в) и был отнесен нами ко второму кластеру путей (КП2). Вместе с тем специфичными для действия АКТГ(6–9)PGP были 22 пути (рис. 5, а) – третий кластер путей (КП3). Среди них дегрануляция нейтрофилов (Neutrophil degranulation), вирусный миокардит (Viral myocarditis) и цитотоксичность, опосредованная естественными клетками-киллерами (Natural killer cell mediated cytotoxicity) были в числе 5 путей с максимальной значимостью ассоциации (рис. 5, г).

При изучении влияния АКТГ(6–9)PGP в сравнении с семаксом (NA vs. NS) была выявлена ассоциация ДЭГ с путем нейронной системы (Neuronal System), отнесенным нами к четвертому кластеру путей (КП4) (рис. 5, а и д). Другой инструмент, GSEA, который предоставляет информацию об обогащении с использованием более мягкого статистического подхода (FDR, q < 0,05), в сравнении NA vs. NS выявил 7 путей, прежде всего, связанных с активностью систем передачи нервного импульса – нейронная система, потенциалзависимые калиевые каналы (Voltage gated Potassium channels), передача через химические синапсы (Transmission across Chemical Synapses) и другие.

Генные сети, характеризующие общее и специфическое влияние АКТГ-подобных пептидов на транскриптом участка фронтальной коры крыс. На рис. 6 представлены генные сети, характеризующие вовлеченность генов в презентацию сигнальных путей, отнесенных нами к кластерам путей, характеризующих эффекты пептидов (КП1–КП4) в соответствии с диаграммой Венна (рис 5, а). В презентации этих путей участвовало 98 генов, которые изменили экспрессию хотя бы в одной из групп сравнения (NS vs. NV, NA vs. NV, NA vs. NS).

КП1 характеризовал общие эффекты семакса и АКТГ(6–9)PGP (рис. 6, а). В кластер вошли 56 генов, которые изменили экспрессию как под действием семакса, так и АКТГ(6–9)PGP, причем изменение экспрессии этих генов в сравнениях NS vs. NV и NA vs. NV было сонаправлено. Гены преимущественно понизили экспрессию под действием пептидов (рис. 6, а). В сеть, связанную с КП1, вошло большинство генов (Cd247, RT1-Ba, RT1-Da, RT1-Db1, Stat1 и др.), которые кодировали белки, участвующие в презентации путей из нескольких кластеров. Вместе с тем были и гены, связанные только с одним из кластеров путей. Из них было 13 генов (Cfb, F10, Gbp2, Gbp5, Isg15, Lat2, Lsp1, Ncf1, Nlrp1a, Prlr, Tlr6, Usp18), которые участвовали только в презентации путей из КП1.

 

Рис. 6. Сети, отражающие общие и специфичные эффекты семакса и АКТГ(6–9)PGP на транскриптом участка фронтальной коры крыс. Показаны только гены, которые изменили экспрессию под действием как семакса, так и АКТГ(6–9)PGP (NS vs. NV и NA vs. NV) (а); только под действием семакса (NS vs. NV), но не АКТГ(6–9)PGP (NA vs. NV) (б); только под действием АКТГ(6–9)PGP (NA vs. NV), но не семакса (NS vs. NV) (в); под действием АКТГ(6–9)PGP относительно семакса (NA vs. NS) (г). Данные группы генов (а–г) вовлечены в презентацию КП1–КП4 соответственно. На схемах гены представлены в прямоугольных блоках, окрашенных в соответствии с дифференциальной экспрессией генов в группах сравнения – NS vs. NV (а и б), NA vs. NV (в), NA vs. NS (г). Пути обозначены белыми овалами. Линии, соединяющие гены и пути, указывают на участие белковых продуктов генов в функционировании пути. Программа DAVID v2021 использовалась для аннотирования функций ДЭГ в терминах путей из баз данных KEGG и REACTOME. Сеть была построена с использованием Cytoscape 3.9.2

 

КП2 включал только один путь клеточной дифференцировки Т-хелперов 17, отражая специфичные эффекты семакса. В презентации пути участвовало 3 гена (Rxrg, Fos и Rora), из которых только ген Rora повысил, а остальные снизили экспрессию в NS vs. NV, не изменив при этом экспрессию в сравнении NА vs. NV (рис. 6, б). Ген Rxrg, кодирующий гамма-рецептор ретиноида X, был к тому же единственным геном, связанным с путями только внутри КП2.

КП3 характеризовал специфичные эффекты АКТГ(6–9)PGP (рис. 6, в). В кластер вошли 15 генов (Psmb11, RT1-A2, Itgb2, RT1-T24-3, Cd37, Ptpn6, Tyrobp, Oas2, B2m, Cyba, Ifitm2, C1qc, C1s, Cd68, Chit1), которые изменили экспрессию в NA vs. NV, но не в NS vs. NV (рис. 6, в). Среди них гены Spn и Cd37 участвовали только во взаимодействиях внутри КП3.

КП4 также характеризовал уникальное влияние АКТГ(6–9)PGP при использовании семакса в качестве пептида сравнения (рис. 6, г). Путь нейронной системы, составляющий КП4, был ассоциирован с 7 генами (Slc1a2, Grin2a, Gabrb2, Kcna2, Kcnq3, Kcnh7 и Kcnh5), которые снизили экспрессию в NA vs. NS (рис. 6, г). Все эти гены (кроме Grin2a) были вовлечены только во внутрикластерные взаимодействия в КП4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе с помощью RNA-Seq было изучено влияние двух синтетических АКТГ-подобных пептидов – семакса и АКТГ(6–9)PGP – на транскриптом участка фронтальной коры мозга крыс через 22,5 ч после трехкратного внутрибрюшинного введения. Ранее при изучении влияния данных пептидов на транскриптом гиппокампа через 6 ч после однократного внутрибрюшинного введения крысам мы не наблюдали значимой дифференциальной экспрессии генов [16]. По всей видимости, текущий результат выявления более двух сотен ДЭГ, помимо различий, связанных со специфическими особенностями гиппокампа и лобной коры, вызван как бо́льшим количеством введенных пептидов, так и бо́льшим временем, прошедшим после их введения. В настоящем исследовании гены, экспрессия которых изменилась в ответ на воздействие пептидов на интактных животных, были кластеризованы по функциональным группам метаболических путей. Оба пептида вызывали преимущественное снижение экспрессии генов, связанных с иммунной системой. Презентацию кластера общих эффектов пептидов (КП1) обеспечивали, прежде всего, гены, кодирующие компоненты главного комплекса гистосовместимости и системы комплемента (RT1-Ba, RT1-Da, RT1-Db1, RT1-S3, C1qa, C1r, C3). Как известно, нейропептиды играют существенную роль в регуляции и модулировании иммунного ответа. Среди них такие пептиды, как тахикинины, кальцитонин-ген-связанный пептид, вазоактивный интестинальный полипептид, гипофизарный аденилатциклаза-активирующий полипептид, урокортин, адреномедуллин, соматостатин, кортистатин, грелин, галанин и опиоидные пептиды, в том числе имеющие значение в медицине [36]. Семакс и АКТГ(6–9)PGP характеризуются, прежде всего, как пептиды с нейропротективными эффектами в отношении событий ишемического инсульта и неврологических нарушений [12, 18]. Ранее мы определили, что семакс в мозге крыс модулирует экспрессию генов, кодирующих белки иммунного ответа и медиаторы воспаления в условиях моделей ишемического инсульта – необратимой (pMCAO) и обратимой (tMCAO) фокальной ишемии [23, 24, 37]. Так, под действием семакса с помощью RNA-Seq нами было выявлено подавление экспрессии генов Il1b, Il6, Tnfa и Cxcl2 через 24 ч после tMCAO в подкорковых структурах мозга, содержащих очаг повреждения [23, 37]. Также с помощью микрочипов мы выявили снижение экспрессии генов (C2, Cd68, RT1-Db1, RT1-Ba, RT1-A1, RT1-CE15) через 3 ч после pMCAO в лобной коре поврежденного левого полушария крыс под действием семакса [24]. Как показано нами в настоящем исследовании, многие из перечисленных генов также снижают экспрессию под действием семакса в норме. Интересные результаты были получены нами ранее при изучении влияния семакса и АКТГ(6–9)PGP на транскриптом участка фронтальной коры через 4,5 ч после tMCAO у крыс [26]. Было показано, что пептиды влияют на экспрессию генов иммунной системы, но каждый со своими особенностями. Пептид АКТГ(6–9)PGP преимущественно оказывал компенсаторное действие на экспрессию генов иммунной системы, предотвращая соответствующее влияние ишемии. В то же время отмечалось гетерогенное влияние семакса на экспрессию генов иммунной системы – на одни гены семакс оказывал влияние, противоположное действию ишемии, а на другие – влияние, сонаправленное эффекту самой ишемии [26]. При сравнении транскриптомных профилей генов участка фронтальной коры крыс, полученных через 4,5 ч после tMCAO, и в настоящем исследовании мы заметили только единичные общие гены, модулирование активности которых вызывали пептиды как при ишемии, так и в норме. Обращают на себя внимание 8 генов (RT1-Ba, RT1-Da, RT1-Db1, Xkr6, Clk2, Cd74, C3, Trdn), которые изменили экспрессию под действием обоих пептидов как в норме, так и при ишемии. Также было обнаружено несколько генов (Rac2, Doc2g, Prkd3, Pkn3, Dnajb14, Dlx2, Drd2, Cdhr1, Calb2 и др.), которые изменили экспрессию только при действии одного из пептидов, но как в норме, так и при ишемии. При этом общие гены преимущественно относятся к группе снизивших экспрессию под действием пептидов.

В настоящем исследовании, помимо общего эффекта семакса и АКТГ(6–9)PGP, мы выделили еще 3 кластера сигнальных путей, отражающих специфическое влияние каждого из пептидов. Следует отметить, что были найдены гены, которые участвуют в презентации только путей, относящихся к конкретному кластеру и, вероятно, смогут составлять набор транкриптомных маркеров эффектов пептидов. Семакс в норме влиял на экспрессию генов пути дифференциации Th17, который составлял КП2. Это путь не был выявлен в группе с введением АКТГ(6–9)PGP. Данный путь определяет процесс контроля воспалительных реакций и пластичности иммунной системы [38, 39]. Действие некоторых соединений также приводит к модуляции активности данного пути. Было показано, что блокирование образования клеток Th17 с помощью введения белка B7-H4.Ig эффективно подавляет развитие сахарного диабета у мышей [40]. Кроме того, флувоксамин ингибирует поляризацию и функцию Th1 и Th17, подавляя гликолиз, замедляя аутоиммунное прогрессирование при диабете 1-го типа [41]. Следует отметить, что путь клеточной дифференцировки Т-хелперов 17 был также в числе специфичных для семакса при изучении его влияния на транскриптом участка фронтальной коры через 4,5 ч после tMCAO [26]. В этой связи не исключено, что одними из уникальных мишеней действия семакса могут быть рецепторы B7-H4, регулирующие Т-клеточный иммунитет.

Мы показали, что в норме АКТГ(6–9)PGP оказывал влияние на целый спектр из 22 путей, связанных с иммунитетом, на которые семакс не влиял. Среди них пути дегрануляции нейтрофилов, вирусного миокардита, цитотоксичность, опосредованная естественными клетками-киллерами, формирующие КП3. Следует отметить, что АКТГ(6–9)PGP через 4,5 ч после tMCAO вызывал изменения экспрессии генов, связанных с активностью только 4 путей [26]. Кроме того, при сравнении группы с введением АКТГ(6–9)PGP с группой крыс, получавших инъекцию семакса, мы обнаружили 36 генов, которые значительно изменили экспрессию. Эти гены были ассоциированы с активностью систем нейросигнализации, формируя кластер нейронной система (КП4). Только 5 из данных генов (Slc1a2, Phc3, Rc3h2, Gabrb2, Kcna2) были ДЭГ также и через 4,5 ч после tMCAO в соответствующей группе сравнения, причем сонаправлено снизив экспрессию в обоих случаях. Влияние пептидов, в том числе синтетического происхождения, на активность системы нейросигнализации показано во многочисленных исследованиях [42–48]. Так, пептиды R1-Pep и PP2A-Pep ингибируют взаимодействие рецепторов γ-аминомасляной кислоты с ферментами, участвующими в их фосфорилировании [42, 43]. Нами было показано, что в подкорковых структурах мозга через 24 ч после tMCAO семакс активирует экспрессию генов Cplx2, Chrm1, Gabra5, Gria3, Neurod6, Ptk2b, связанных с передачей нервного импульса [23, 49]. Такой эффект семакса мог быть связан с PGP-фрагментом на его С-конце, так как в соответствующем эксперименте сам пептид PGP значимо повышал экспрессию гена Gabra5 и при этом не вызывал значимых изменений экспрессии генов кластера нейросигнализации относительно действия семакса [49]. В настоящей работе мы показали различную реакцию генов нейросигнализации на введение пептидов, отличающихся последовательностью АКТГ-фрагмента. В частности, АКТГ(4–5) (Met-Glu) присутствовал только в семаксе, а АКТГ(8–9) (Arg-Trp) присутствовал только в пептиде АКТГ(6–9)PGP. Поэтому проявление специфичных для семакса и АКТГ(6–9)PGP эффектов, как в норме, так и в условиях ишемии, может быть обусловлено уникальными последовательностями из АКГТ в их структурах.

Вопрос о том, как именно семакс и АКТГ(6–9)PGP передают свой эффект на уровень геномной активности остается во многом не решенным. Рассматривают модель, в которой пептиды или их метаболиты взаимодействуют с аллостерическими сайтами на мембранных рецепторах и обеспечивают передачу сигнала в ядро по системе сигнальных путей, влияя на экспрессию тех или иных генов [50, 51]. Изучение влияния пептидов на экспрессию генов на уровне мРНК дает лишь часть сведений об их молекулярно-генетических эффектах. Важным является изучение роли некодирующих РНК (микроРНК, длинных некодирующих РНК, циклических РНК), а также белков, обеспечивающих процессы регуляции экспрессии генов. Мы полагаем, что дальнейший интегративный молекулярно-генетический и протеомный функциональный анализ в клетках мозга позволит установить регуляторные аспекты, определяющие активность пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании впервые изучено влияние двух нейропептидов, производных АКТГ, – семакса и АКТГ(6–9)PGP, отличающихся деталями структуры, на транскриптом клеток мозга у интактных животных. В результате были выявлены гены и метаболические системы, которые характеризуют как общие, так и специфические эффекты пептидов. Полученные результаты способствуют выяснению зависимости нейропротективных эффектов АКТГ-подобных пептидов от их структуры и должны учитываться при изучении их влияния при патологии.

Вклад авторов. И.Б. Филиппенков, Н.Ю. Глазова, Е.А. Себенцова, Н.Г. Левицкая, Л.В. Дергунова – планирование экспериментов; И.Б. Филиппенков, Н.Ю. Глазова, Е.А. Себенцова, В.В. Ставчанский, Л.А. Андреева – постановка экспериментов; И.Б. Филиппенков – написание манускрипта; Н.Г. Левицкая, С.А. Лимборская, Л.В. Дергунова – редактирование манускрипта; С.А. Лимборская, Н.Ф. Мясоедов, Л.В. Дергунова – концептуализация и руководство исследованием.

Финансирование. Работа выполнена в рамках Тематического плана НИОКР НИЦ «Курчатовский институт» 5Ф.5.9 (биоинформатическая обработка данных), а также при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-14-00027; анализ экспрессии генов).

Благодарности. В работе использовали оборудование ресурсных центров НИЦ «Курчатовский институт» и МГУ имени М.В. Ломоносова. Авторы благодарят А.Э. Голубович за помощью в обработке данных.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Исследование проведено с соблюдением биоэтических норм обращения с экспериментальными животными в соответствии с «Правилами надлежащей лабораторной практики» (Приказ МЗ РФ № 199 от 01.04.2016) и требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента от 22.09.2010.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

×

作者简介

I. Filippenkov

National Research Centre “Kurchatov Institute”

编辑信件的主要联系方式.
Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

N. Glazova

National Research Centre “Kurchatov Institute”; Lomonosov Moscow State University

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru

Faculty of Biology

俄罗斯联邦, 123182 Moscow; 119991 Moscow

E. Sebentsova

National Research Centre “Kurchatov Institute”; Lomonosov Moscow State University

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru

Faculty of Biology

俄罗斯联邦, 123182 Moscow; 119991 Moscow

V. Stavchansky

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

L. Andreeva

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

N. Myasoedov

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

N. Levitskaya

National Research Centre “Kurchatov Institute”; Lomonosov Moscow State University

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru

Faculty of Biology

俄罗斯联邦, 123182 Moscow; 119991 Moscow

S. Limborska

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

L. Dergunova

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: filippenkov-ib.img@yandex.ru
俄罗斯联邦, 123182 Moscow

参考

  1. Lee, A. C. L., Harris, J. L., Khanna, K. K., and Hong, J. H. (2019) A comprehensive review on current advances in peptide drug development and design, Int. J. Mol. Sci., 20, 2383, https://doi.org/10.3390/ijms20102383.
  2. Apostolopoulos, V., Bojarska, J., Chai, T. T., Elnagdy, S., Kaczmarek, K., Matsoukas, J., New, R., Parang, K., Lopez, O. P., Parhiz, H., Perera, C. O., Pickholz, M., Remko, M., Saviano, M., Skwarczynski, M., Tang, Y., Wolf, W. M., Yoshiya, T., Zabrocki, J., Zielenkiewicz, P., AlKhazindar, M., Barriga, V., Kelaidonis, K., Sarasia, E. M., and Toth, I. (2021) A global review on short peptides: frontiers and perspectives, Molecules., 26, 430, https://doi.org/10.3390/molecules26020430.
  3. Lubell, W. D. (2022) Peptide-based drug development, Biomedicines, 10, 2037, https://doi.org/10.3390/biomedicines10082037.
  4. Wang, L., Wang, N., Zhang, W., Cheng, X., Yan, Z., Shao, G., Wang, X., Wang, R., and Fu, C. (2022) Therapeutic peptides: current applications and future directions, Signal. Transduct. Target. Ther., 7, 48, https://doi.org/10.1038/s41392-022-00904-4.
  5. Deigin, V. I., Poluektova, E. A., Beniashvili, A. G., Kozin, S. A., and Poluektov, Y. M. (2022) Development of peptide biopharmaceuticals in Russia, Pharmaceutics, 14, 716, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14040716.
  6. Starowicz, K., and Przewłocka, B. (2003) The role of melanocortins and their receptors in inflammatory processes, nerve regeneration and nociception, Life Sci., 73, 823-847, https://doi.org/10.1016/S0024-3205(03)00349-7.
  7. Adan, R. A. H., and Gispen, W. H. (1997) Brain melanocortin receptors: from cloning to function, Peptides, 18, 1279-1287, https://doi.org/10.1016/S0196-9781(97)00078-8.
  8. Catania, A., Gatti, S., Colombo, G., and Lipton, J. M. (2004) Targeting melanocortin receptors as a novel strategy to control inflammation, Pharmacol. Rev., 56, 1-29, https://doi.org/10.1124/pr.56.1.1.
  9. Cone, R. D. (2005) Anatomy and regulation of the central melanocortin system, Nat. Neurosci., 8, 571-578, https://doi.org/10.1038/nn1455.
  10. Giuliani, D., Minutoli, L., Ottani, A., Spaccapelo, L., Bitto, A., Galantucci, M., Altavilla, D., Squadrito, F., and Guarini, S. (2012) Melanocortins as potential therapeutic agents in severe hypoxic conditions, Front. Neuroendocrinol., 33, 179-193, https://doi.org/10.1016/j.yfrne.2012.04.001.
  11. Wikberg, J. (2001) Melanocortin receptors: new opportunities in drug discovery, Exp. Opin. Ther. Patents, 11, 61, https://doi.org/10.1517/13543776.11.1.61.
  12. Гусев Е. И., Мартынов М. Ю., Костенко Е. В., Петрова Л. В., Бобырёва С. Н. (2018) Эффективность семакса при лечении больных на разных стадиях ишемического инсульта, Журн. Неврол. Психиатр., 3, 61-68.
  13. Potaman, V. N., Alfeeva, L. Y., Kamensky, A. A., Levitzkaya, N. G., and Nezavibatko, V. N. (1991) N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176, 741-746, https://doi.org/10.1016/S0006-291X(05)80247-5.
  14. Agapova, T. Y., Agniullin, Y. V., Shadrina, M. I., Shram, S. I., Slominsky, P. A., Lymborska, S. A., and Myasoedov, N. F. (2007) Neurotrophin gene expression in rat brain under the action of Semax, an analogue of ACTH 4-10, Neurosci. Lett., 417, 201-205, https://doi.org/10.1016/j.neulet.2007.02.042.
  15. Полунин Г. С., Нуриева С. М., Баяндин Д. Л., Шеремет Н. Л., Андреева Л. А. (2000) Определение терапевтической эффективности нового отечественного препарата «семакс» при заболеваниях зрительного нерва, Вестник Офтальмол., 116, 15-18.
  16. Filippenkov, I. B., Stavchansky, V. V., Glazova, N. Y., Sebentsova, E. A., Remizova, J. A., Valieva, L. V., Levitskaya, N. G., Myasoedov, N. F., Limborska, S. A., and Dergunova, L. V. (2021) Antistress action of melanocortin derivatives associated with correction of gene expression patterns in the hippocampus of male rats following acute stress, Int. J. Mol. Sci., 22, 34576218, https://doi.org/10.3390/ijms221810054.
  17. Vorvul, A. O., Bobyntsev, I. I., Medvedeva, O. A., Mukhina, A. Y., Svishcheva, M. V., Azarova, I. E., Andreeva, L. A., and Myasoedov, N. F. (2022) ACTH(6-9)-Pro-Gly-Pro ameliorates anxiety-like and depressive-like behaviour and gut mucosal microbiota composition in rats under conditions of chronic restraint stress, Neuropeptides, 93, 35487169, https://doi.org/10.1016/j.npep.2022.102247.
  18. Бакаева З. В., Сурин А. М., Лизунова Н. В., Згодова А. Е., Красильникова И. А., Фисенко А. П., Фролов Д. А., Андреева Л. А., Мясоедов Н. Ф., Пинелис В. Г. (2020) Нейропротекторный потенциал пептидов HFRWPGP (ACTH6-9PGP), KKRRPGP, PYRRP в культивируемых корковых нейронах при глутаматной эксайтотоксичности, Докл. Росс. Акад. Наук Науки о Жизни, 491, 62-66, https://doi.org/10.31857/S2686738920020067.
  19. Akimov, M. G., Fomina-Ageeva, E. V., Dudina, P. V., Andreeva, L. A., Myasoyedov, N. F., and Bezuglov, V. V. (2021) ACTH(6–9)PGP peptide protects SH-SY5Y cells from H2O2, tert-butyl hydroperoxide, and cyanide cytotoxicity via stimulation of proliferation and induction of prosurvival-related genes, Molecules, 26, 1878, https://doi.org/10.3390/molecules26071878.
  20. Wang, C.-M., Pan, Y.-Y., Liu, M.-H., Cheng, B.-H., Bai, B., and Chen, J. (2017) RNA-seq expression profiling of rat MCAO model following reperfusion Orexin-A, Oncotarget, 8, 113066-113081, https://doi.org/10.18632/oncotarget.22995.
  21. Tian, R., Deng, A., Pang, X., Chen, Y., Gao, Y., Liu, H., and Hu, Z. (2022) VR-10 polypeptide interacts with CD36 to induce cell apoptosis and autophagy in choroid-retinal endothelial cells: identification of VR-10 as putative novel therapeutic agent for choroid neovascularization (CNV) treatment, Peptides, 157, 170868, https://doi.org/10.1016/ j.peptides.2022.170868.
  22. Zhang, Q., Liu, C., Shi, R., Zhou, S., Shan, H., Deng, L., Chen, T., Guo, Y., Zhang, Z., Yang, G. Y., Wang, Y., and Tang, Y. (2022) Blocking C3d+/GFAP+ A1 astrocyte conversion with semaglutide attenuates blood-brain barrier disruption in mice after ischemic stroke, Aging Dis., 13, 943-959, https://doi.org/10.14336/AD.2021.1029.
  23. Filippenkov, I. B., Stavchansky, V. V., Denisova, A. E., Yuzhakov, V. V., Sevan’kaeva, L. E., Sudarkina, O. Y., Dmitrieva, V. G., Gubsky, L. V., Myasoedov, N. F., Limborska, S. A., and Dergunova, L. V. (2022) Novel insights into the protective properties of ACTH(4–7)PGP (Semax) peptide at the transcriptome level following cerebral ischaemia-reperfusion in rats, Genes (Basel), 11, 681, https://doi.org/10.3390/genes11060681.
  24. Medvedeva, E. V., Dmitrieva, V. G., Povarova, O. V., Limborska, S. A., Skvortsova, V. I., Myasoedov, N. F., and Dergunova, L. V. (2014) The peptide semax affects the expression of genes related to the immune and vascular systems in rat brain focal ischemia: genome-wide transcriptional analysis, BMC Genomics, 15, 228, https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-228.
  25. Medvedeva, E. V., Dmitrieva, V. G., Limborska, S. A., Myasoedov, N. F., and Dergunova, L. V. (2017) Semax, an analog of ACTH(4–7), regulates expression of immune response genes during ischemic brain injury in rats, Mol. Genet. Genomics, 292, 635-653, https://doi.org/10.1007/s00438-017-1297-1.
  26. Filippenkov, I. B., Remizova, J. A., Stavchansky, V. V., Denisova, A. E., Gubsky, L. V., Myasoedov, N. F., Limborska, S. A., and Dergunova, L. V. (2023) Synthetic adrenocorticotropic peptides modulate the expression pattern of immune genes in rat brain following the early post-stroke period, Genes (Basel), 14, 1382, https://doi.org/10.3390/genes14071382.
  27. Ashmarin, I., Nezavibatko, V., Levitskaya, N., Koshelev, V., and Kamensky, A. (1995) Design and investigation of an ACTH(4-10) analog lacking D-amino acids and hydrophobic radicals, Neurosci. Res. Commun., 16, 105-112.
  28. Miasoedova, N. F., Skvortsova, V. I., Nasonov, E. L., Zhuravleva, E. I., Grivennikov, I. A., Arsen’eva, E. L., and Sukhanov, I. I. (1999) Investigation of mechanisms of neuro-protective effect of semax in acute period of ischemic stroke [in Russian], Zhurn. Nevrol. Psikhiatr. Im. S. S. Korsakova, 99, 15-19.
  29. Медведева Е. В., Дмитриева В. Г., Поварова О. В., Лимборская С. А., Скворцова В. И., Мясоедов Н. Ф., Дергунова Л. В. (2014) Трипептид PRO-GLY-PRO влияет на транскриптом коры головного мозга крыс в условиях фокальной ишемии, Мол. Биол., 48, 277, https://doi.org/10.7868/S0026898414020128.
  30. Шубина Т. А., Григорьева М. Е., Ляпина Л. А., Оберган Т. Ю., Мясоедов Н. Ф., Андреева Л. А. (2014) Гипогликемическая и противосвертывающая активность тетрапептида PRO-GLY-PRO-LEU при гиперхолестеринемии, Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 158, 35-39.
  31. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl, M. W., Shipley, G. L., Vandesompele, J., and Wittwer, C. T. (2009) The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments, Clin. Chem., 55, 611-622, https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797.
  32. Huang, D. W., Sherman, B. T., and Lempicki, R. A. (2009) Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources, Nat. Protoc., 4, 44-57, https://doi.org/10.1038/nprot.2008.211.
  33. Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V. K., Mukherjee, S., Ebert, B. L., Gillette, M. A., Paulovich, A., Pomeroy, S. L., Golub, T. R., Lander, E. S., and Mesirov, J. P. (2005) Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 15545-15550, https://doi.org/10.1073/pnas.0506580102.
  34. Babicki, S., Arndt, D., Marcu, A., Liang, Y., Grant, J. R., Maciejewski, A., and Wishart, D. S. (2016) Heatmapper: web-enabled heat mapping for all, Nucleic Acids Res., 44, W147-W153, https://doi.org/10.1093/nar/gkw419.
  35. Shannon, P., Markiel, A., Ozier, O., Baliga, N. S., Wang, J. T., Ramage, D., Amin, N., Schwikowski, B., and Ideker, T. (2003) Cytoscape: a software Environment for integrated models of biomolecular interaction networks, Genome Res., 13, 2498-2504, https://doi.org/10.1101/gr.1239303.
  36. Pintér, E., Pozsgai, G., Hajna, Z., Helyes, Z., and Szolcsányi, J. (2014) Neuropeptide receptors as potential drug targets in the treatment of inflammatory conditions, Br. J. Clin. Pharmacol., 77, 5-20, https://doi.org/10.1111/bcp.12097.
  37. Дергунова Л. В., Дмитриева В. Г., Филиппенков И. Б., Ставчанский В. В., Денисова А. Е., Южаков В. В., Севанькаева Л. Е., Валиева Л. В., Сударкина О. Ю., Губский Л. В., Мясоедов Н. Ф., Лимборская С. А. (2021) Пептидный препарат AKTГ(4-7)PGP (семакс) подавляет транскрипцию генов провоспалительных медиаторов, индуцированную обратимой ишемией мозга крыс, Мол. Биол., 55, 402-411, https://doi.org/10.31857/S0026898421010043.
  38. Bhaumik, S., and Basu, R. (2017) Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response, Front. Immunol., 8, 254, https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00254.
  39. Zhou, L., Chong, M. M. W., and Littman, D. R. (2009) Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation, Immunity, 30, 646-655, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.05.001.
  40. Lee, I. F., Wang, X., Hao, J., Akhoundsadegh, N., Chen, L., Liu, L., Langermann, S., Ou, D., and Warnock, G. L. (2013) B7-H4.Ig inhibits the development of Type 1 diabetes by regulating Th17 cells in NOD mice, Cell. Immunol., 282, 1-8, https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2013.03.005.
  41. Zou, Y., Zhang, J., Sun, F., Xu, Q., Chen, L., Luo, X., Wang, T., Zhou, Q., Zhang, S., Xiong, F., Kong, W., Yang, P., Yu, Q., Liu, S., and Wang, C. Y. (2024) Fluvoxamine inhibits Th1 and Th17 polarization and function by repressing glycolysis to attenuate autoimmune progression in type 1 diabetes, Mol. Med., 30, 23, https://doi.org/10.1186/s10020-024-00791-1.
  42. Balakrishnan, K., Hleihil, M., Bhat, M.A., Ganley, R. P., Vaas, M., Klohs, J., Zeilhofer, H. U., and Benke, D. (2022) Targeting the interaction of GABAB receptors with CaMKII with an interfering peptide restores receptor expression after cerebral ischemia and inhibits progressive neuronal death in mouse brain cells and slices, Brain Pathol., 33, e13099, https://doi.org/10.1111/bpa.13099.
  43. Hleihil, M., Balakrishnan, K., and Benke, D. (2022) Protein phosphatase 2A regulation of GABA B receptors normalizes ischemia-induced aberrant receptor trafficking and provides neuroprotection, Front. Mol. Neurosci., 15, 1015906, https://doi.org/10.3389/fnmol.2022.1015906.
  44. Chen, M., Zhang, X., Fan, J., Sun, H., Yao, Q., Shi, J., Qu, H., Du, S., Cheng, Y., Ma, S., Zhang, M., and Zhan, S. (2021) Dynorphin A (1-8) inhibits oxidative stress and apoptosis in MCAO rats, affording neuroprotection through NMDA receptor and κ-opioid receptor channels, Neuropeptides, 89, 34298371, https://doi.org/10.1016/j.npep.2021.102182.
  45. Paul, S., and Candelario-Jalil, E. (2021) Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: an overview of clinical and preclinical studies, Exp. Neurol., 335, 113518, https://doi.org/10.1016/ j.expneurol.2020.113518.
  46. Ballarin, B., and Tymianski, M. (2018) Discovery and development of NA-1 for the treatment of acute ischemic stroke, Acta. Pharmacol. Sin., 39, 661-668, https://doi.org/10.1038/aps.2018.5.
  47. Malyshev, A. V., Sukhanova, I. A., Ushakova, V. M., Zorkina, Y. A., Abramova, O. V., Morozova, A. Y., Zubkov, E. A., Mitkin, N. A., Pavshintsev, V. V., Doronin, I. I., Gedzun, V. R., Babkin, G. A., Sanchez, S. A., Baker, M. D., and Haile, C. N. (2022) Peptide LCGA-17 attenuates behavioral and neurochemical deficits in rodent models of PTSD and depression, Pharmaceuticals (Basel), 15, 462, https://doi.org/10.3390/ph15040462.
  48. Shibato, J., Takenoya, F., Yamashita, M., Gupta, R., Min, C. W., Kim, S. T., Kimura, A., Takasaki, I., Hori, M., Shioda, S., and Rakwal, R. (2023) OMICS analyses unraveling related gene and protein-driven molecular mechanisms underlying PACAP 38-induced neurite outgrowth in PC12 cells, Int. J. Mol. Sci., 24, 4169, https://doi.org/10.3390/ijms24044169.
  49. Stavchansky, V. V., Filippenkov, I. B., Remizova, J. A., Denisova, A. E., Mozgovoy, I. V., Gubsky, L. V., Myasoedov, N. F., Andreeva, L. A., Limborska, S. A., and Dergunova, L. V. (2022) Insight into glyproline peptides’ activity through the modulation of the inflammatory and neurosignaling genetic response following cerebral ischemia-reperfusion, Genes (Basel), 13, 2380, https://doi.org/10.3390/genes13122380.
  50. Dergunova, L. V., Filippenkov, I. B., Limborska, S. A., and Myasoedov, N. F. (2023) Neuroprotective peptides and new strategies for ischemic stroke drug discoveries, Genes (Basel), 14, 953, https://doi.org/10.3390/genes14050953.
  51. Mannes, M., Martin, C., Menet, C., and Ballet, S. (2022) Wandering beyond small molecules: peptides as allosteric protein modulators, Trends Pharmacol. Sci., 43, 406-423, https://doi.org/10.1016/j.tips.2021.10.011.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. The structure of peptides ACTH(4-7)PGP (semax) and ACTH(6-9)PGP (a). Schematic representation of a section of the rat brain with shading indicating the localization of the area of the frontal cortex taken for RNA sequencing (b). Study scheme (c)

下载 (276KB)
索引源数据
3. 2. RNA-Seq analysis of the effect of semax and ACTH(6-9)PGP on the transcriptome of the rat frontal cortex. The volcano-plot graphs illustrate the differences in mRNA expression between the norm + semax (NS) and norm + saline (NV) groups (a), as well as norm + ACTH(6-9)PGP (NA) and norm + saline (NV) (b). 10 DEGS were presented, which showed the largest multiple change in expression in the comparisons NS vs. NV (b) and NA vs. NV (d). Each comparison group included 3 animals. The data is presented as the average ± standard error of the average

下载 (391KB)
索引源数据
4. 3. Comparison of the results of RNA-Seq in experiments with the introduction of semax and ACTH(6-9)PGP. Venn diagrams (a–b) illustrate the results obtained for two pairwise comparisons "norm + semax" (NS) vs. "norm + saline solution" (NV) and "norm + ACTH(6-9)PGP" (NA) vs. "norm + saline solution" (NV): for all DEG (a), only for those with increased expression (b) and only for those with decreased expression (c). The numbers at the intersection of different sets of genes in the Venn diagram indicate the number of DEG (multiplicity > 1.5; Padj < 0.05) according to RNA-Seq data. The relative expression values for 10 genes from each segment are shown in the Venn diagram (panel a): genes with the largest multiple expression variation in NS vs. NV and lie within the intersection of the sets of DEG (d); DEG with the largest multiple expression change in NS vs. NV, but not DEG in NA vs. NV (e); DEG with the largest multiple expression change in NA vs. NV, but not DEG in NS vs. NV (e). The data is presented as the mean ± the standard error of the mean

下载 (416KB)
索引源数据
5. Fig. 4. Comparison of the results of RNA-Seq in experiments with ACTH(6-9)PGP administration relative to the action of semax. The "volcano-plot" graph illustrates the differences in mRNA expression between the "norm + ACTH(6-9)PGP" (NA) and "norm + semax" (NS) (a) groups. 10 genes are presented that showed the greatest multiple change in expression compared to NA vs. NS (multiplicity > 1.5; Padj < 0.05) according to RNA-Seq data (b)

下载 (191KB)
索引源数据
6. Fig. 5. Signaling pathways associated with the effect of semax and ACTH(6-9)PGP on the transcriptome of a region of the frontal cortex of rats. The analysis was performed using the DAVID v2021 program. Schematic comparison of annotations (paths) related to DEG obtained in three paired comparisons NS vs. NV, NA vs. NV and NA vs. NS in the form of a Venn diagram (a). The number of annotations is indicated by numbers in the diagram segments. The signal pathways lying in the segments on the Venn diagram are shown: common for NS vs comparisons. NV and NA vs. NV (b), as well as comparisons specific to NS vs. NV (c), NA vs. NV (d), and NA vs. NS (e). Panels (b), (c), and (e) show all paths lying in the corresponding segment on the Venn diagram, and panel (d) shows only 5 of the 22 paths with the minimum Padj value (the p value adjusted using the Benjamini–Hochberg procedure) in NA vs. NV. Padj values are presented for each pathway, as well as the number of increased and decreased gene expression in the corresponding pairwise comparison. Only DEG and pathways with Padj < 0.05 were selected for analysis. Each comparison group included 3 animals. Inflammatory bowel disease – inflammatory bowel disease; NOD-like receptor signaling pathway – NOD-like receptor signaling pathway; Tuberculosis – tuberculosis; Coronavirus disease – COVID-19 (coronavirus disease); Influenza A – influenza A; Systemic lupus erythematosus – systemic lupus erythematosus; Antigen processing and presentation – antigen processing and presentation; Phagosome – phagosome; Pertussis – whooping cough; Leishmaniasis – leishmaniasis; Complement and coagulation cascades – cascades of complement and coagulation; Epstein-Barr virus infection – Epstein–Barr virus infection; Immune System – immune system; Staphylococcus aureus infection – staphylococcus aureus infection; Innate Immune System – innate immune system); Th17 cell differentiation – differentiation of T helper cells 17; Immunoregulatory interactions between a Lymphoid and a non-Lymphoid cell - immunoregulatory interactions between lymphoid and non–lymphoid cells; Neutrophil degradation – degranulation neutrophils; Viral myocarditis – viral myocarditis; Herpes simplex virus 1 infection – infection of the herpes simplex virus 1; Natural killer cell mediated cytotoxicity – cytotoxicity mediated by natural killer cells; Neuronal System – neural system

下载 (576KB)
索引源数据
7. 6. Networks reflecting the general and specific effects of semax and ACTH(6-9)PGP on the transcriptome of the rat frontal cortex. Only the genes that changed expression under the action of both semax and ACTH(6-9)PGP (NS vs. NV and NA vs. NV) (a); only under the action of semax (NS vs. NV), but not ACTH(6-9)PGP (NA vs. NV) (b); only under the action of ACTH(6-9)PGP (NA vs. NV), but not semax (NS vs. NV) (b); under the action of ACTH(6-9)PGP relative to semax (NA vs. NS) (d). These groups of genes (a–g) are involved in the presentation of KP1–KP4, respectively. In the diagrams, the genes are presented in rectangular blocks colored according to the differential expression of the genes in the comparison groups – NS vs. NV (a and b), NA vs. NV (c), NA vs. NS (d). The paths are indicated by white ovals. The lines connecting genes and pathways indicate the involvement of the protein products of the genes in the functioning of the pathway. The DAVID v2021 program was used to annotate DEG functions in terms of paths from the KEGG and REACTOME databases. The network was built using Cytoscape 3.9.2

下载 (371KB)
索引源数据
8. Suppl. 1.
下载 (466KB)
索引源数据
9. Suppl. 2.
下载 (67KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».