Микроглия и дендритные клетки как источник IL-6 в мышиной модели рассеянного склероза

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Рассеянный склероз (РС) – это комплексное аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), приводящее к разрушению миелиновой оболочки нейронов и нарушению проводимости нервных сигналов. Изучение молекулярных механизмов развития РС критически важно, так как заболевание характеризуется ранней манифестацией, хроническим течением и терапией, основанной на симптоматическом лечении. Известно, что цитокины играют ключевую роль в патогенезе РС, при этом одним из ключевых медиаторов является интерлейкин-6 (IL-6). В настоящей работе была исследована роль IL-6, продуцируемого микроглией и дендритными клетками, в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), широко используемой модели РС на мышах. Работу проводили на мышах с клеточно-специфичным удалением IL-6 из CX3CR1+-клеток, в том числе из микроглии, и из дендритных клеток CD11c+. Было установлено, что мыши с удалением IL-6 из микроглии или из дендритных клеток развивают более слабые симптомы по сравнению с мышами дикого типа. В ЦНС мышей с инактивацией IL-6 в микроглии на пике ЕАЕ происходило повышение доли регуляторных Т-клеток (Treg) и снижение процентного содержания патогенетических IFNγ-продуцирующих CD4+ Т-клеток, что коррелировало с уменьшением количества провоспалительных моноцитов. В то же время при удалении IL-6 из микроглии наблюдалось увеличение содержания CCR6+ Т-клеток и GM-CSF-продуцирующих Т-клеток. У мышей с дефицитом IL-6 в дендритных клетках наблюдалось не только ранее описанное увеличение доли Treg и уменьшение доли Т-хелперов, продуцирующих IL-17A (TH17-клеток), но и уменьшение продукции GM-CSF и IFNγ во вторичных лимфоидных органах. Таким образом, функции IL-6 в организме зависят от источника и локализации иммунного ответа: IL-6 из микроглии выполняет как патогенетические, так и протективные функции именно в ЦНС, в то время как IL-6 из дендритных клеток, помимо критически важного участия в соотношении Treg и TH17-клеток, может стимулировать продукцию цитокинов, ассоциированных с патогенетическими функциями Т-клеток.

Полный текст

Принятые сокращения: ГЭБ – гематоэнцефалический барьер; РС – рассеянный склероз; ЦНС – центральная нервная система; ЕАЕ – экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; IL – интерлейкин; TH – Т-хелперы; Treg – регуляторные Т-клетки; ΔDC – удаление гена только в дендритных клетках; ΔMG – удаление гена только в микроглии.

Введение

Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС) и вызывающее такие серьезные последствия, как нарушения зрения, опорно-двигательного аппарата и когнитивных функций. В течение последних десятилетий наблюдается тенденция к увеличению количества людей, у которых диагностирован РС, однако на данный момент доступны методы терапии, направленные исключительно на модуляцию симптомов заболевания [1]. В связи с этим поиск новых терапевтических мишеней остается крайне актуальной задачей. Одной из наиболее востребованных экспериментальных моделей РС на мышах является экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) [2]. Патогенез EAE главным образом обусловлен активацией, последующей дифференцировкой и инфильтрацией в ЦНС CD4+ Т-клеток в ответ на иммунизацию антигенами, входящими в состав миелиновой оболочки нейронов, в полном адъюванте Фрейнда [3]. Критическую роль в патогенезе ЕАЕ выполняют цитокины, одним из которых является IL-6. В частности, было показано, что фармакологическая и генетическая инактивация IL-6 в мышиной модели рассеянного склероза приводит к уменьшению тяжести заболевания [4] или абсолютной резистентности [5].

Установлено, что патогенетическая роль IL-6 обусловлена различными механизмами, участвующими в регуляции проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и развития популяций CD4+ T-клеток. Было показано, что при иммунизации миелиновым пептидом MOG35–55 у мышей дикого типа, по сравнению с мышами, дефицитными по IL-6, на поверхности эндотелиальных клеток, входящих в состав ГЭБ, наблюдалась повышенная экспрессия таких молекул адгезии, как VCAM-1 и ICAM-1 [5]. Известно, что для передачи сигнала от IL-6 необходима активация двух субъединиц рецепторного комплекса IL-6 – IL-6Rα и gp130. Оказалось, что транс-презентация IL-6 (передача внутриклеточного сигнала за счет взаимодействия комплекса IL-6R–IL-6 на поверхности одной клетки с gp130 на поверхности другой) необходима для поляризации патогенетических Т-хелперов, продуцирующих IL-17A (TH17-клетки) в модели EAE [6]. В подтверждение этому удаление gp130 с поверхности Т-клеток подавляет дифференцировку CD4+ T-клеток в регуляторные Т-клетки (Treg), экспрессирующие транскрипционный фактор FoxP3, тем самым способствуя развитию TH17-клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор RORγt+ [7]. Примечательно, что существует положительная обратная связь между IL-6 и IL-17А, продуцируемым патогенетическими TH17-клетками: IL-17A стимулирует продукцию IL-6 астроцитами, что дополнительно способствует поляризации таких TH17-клеток [8, 9].

Основными источниками IL-6 в ЦНС выступают различные клетки неиммунного происхождения, а именно: нейроны, астроциты и эндотелиальные клетки [10], однако в модели EAE главный источник IL-6 представлен миелоидными клетками [6], а именно: дендритными клетками и микроглией (резидентные макрофаги ЦНС). Несмотря на то что имеется много данных, свидетельствующих о различных функциях IL-6 в модели ЕАЕ, недостаточно изучены особенности продукции цитокинов Т-клетками в ходе развития заболевания в зависимости от конкретной субпопуляции миелоидных клеток, что и стало предметом исследования настоящей работы.

Материалы и методы

Мыши. Работу проводили на линиях мышей с делецией гена Il6 в миелоидных клетках: Cd11cCre × Il6fl/fl (мыши с делецией гена Il6 преимущественно в дендритных клетках) [11] и Cx3cr1CreER × Il6fl/fl (мыши с делецией гена Il6 в миелоидных клетках CX3CR1+, в том числе в микроглии). Для получения линии мышей с делецией гена Il6 в миелоидных клетках CX3CR1+ скрещивали мышей Il6fl/fl [12] и мышей Cx3cr1CreER [13]. В экспериментах были использованы самки и самцы возрастом 9–12 недель. Мышей разводили и содержали на базе SPF-вивария ИЦиГ СО РАН и Автономного экспериментально-биологического комплекса для временного размещения и исследования генетически модифицированных линий лабораторных мышей категории SPF при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1660). Эксперименты на генетически-модифицированных мышах в модели ЕАЕ были одобрены Биоэтическим комитетом ИМБ РАН (Протокол № 3 от 21.09.2023).

Введение тамоксифена. Тамоксифен («Sigma Aldrich», США) растворяли в кукурузном масле («Sigma Aldrich») из расчета 15 мг/мл путем длительной инкубации и постоянного перемешивания на термошейкере при 37 °C в защищенном от света месте в течение ночи. Полученный раствор раскапывали по 2 мл в пробирки и хранили при +4 °С в течение 5 дней. Для удаления IL-6 в микроглии мышам Cx3cr1CreER × Il6fl/fl и контрольной группе мышей дикого типа (Il6fl/fl) в возрасте 8–9 недель вводили 100 мкл раствора тамоксифена внутрибрюшинно из расчета 75 мг/кг каждый день в течение 5 дней.

Индукция EAE. Мышей подкожно иммунизировали 100 мкл суспензии MOG35–55-пептида (миелин-олигодендроцитарный гликопротеин; «Anaspec», США) в полном адъюванте Фрейнда («Sigma Aldrich») с добавлением 5 мг/мл убитых Mycobacterium tuberculosis («Difco», США). После введения суспензии MOG35–55-пептида в тот же день и еще через 2 дня мышам вводили коклюшный токсин («Sigma Aldrich») внутрибрюшинно из расчета 200 нг на мышь для увеличения проницаемости ГЭБ. После индукции EAE проводили оценку развития клинических симптомов заболевания по шкале от 0 до 5, где 5 – наибольшая степень заболевания: 0 – нет симптомов; 0,5 – частичная потеря тонуса хвоста; 1 – полная потеря тонуса хвоста; 1,5 – частичное нарушение рефлекса переворачивания; 2 – полное нарушение рефлекса переворачивания; 3 – отказ одной задней конечности; 3,5 – отказ обеих задних конечностей; 4 – отказ одной передней конечности и обеих задних конечностей; 4,5 –- отказ всех конечностей.

Выделение клеток. Для выделения периферических лейкоцитов крови мыши проводили забор крови в пробирки, содержащие раствор гепарина; затем проводили центрифугирование в градиенте плотности Фиколла в течение 30 мин без ускорения и торможения (1,077 г/см3, «ПанЭко», Россия). Для последующего анализа отбирали фракции, содержащие периферические мононуклеазы. Суспензию клеток из селезенки и лимфатических узлов получали путем механической гомогенизации через 70-мкм фильтр («NEST», Китай) в растворе PBS с добавлением 2% FBS. Лизис эритроцитов в суспензии спленоцитов проводили путем добавления буфера АСК (Ammonium-Chloride-Potassium: 1,5 M NH4Cl; 100 мМ KHCO3; 10 мМ EDTA-2Na в дистилированной воде; pH 7,2). Иммунные клетки из ЦНС выделяли по ранее описанному протоколу [14]. Вкратце, мышей подвергали анестезии и проводили транскардиальную перфузию с использованием 0,9%-ного раствора NaCl. Затем извлекали спинной и головной мозг и механически гомогенизировали. Ферментативную диссоциацию проводили в растворе DPBS с добавлением 1,5 мг/мл коллагеназы II («Gibco») и 50 мкг/мл ДНКазы I («Roche», Швейцария). Реакцию останавливали путем добавления большого объема холодного PBS, содержащего 2% FBS. Полученную суспензию клеток гомогенизировали с помощью шприца с иглой размером 18G × 1,5′′. Затем проводили разделение фракции иммунных клеток в градиенте плотности Перколла («GE Healthcare», США) 30/37/70 при центрифугировании (500 g, 25 °C, 40 мин, без ускорения и торможения).

Цитофлуориметрический анализ. Для измерения продукции цитокинов CD4+ Т-клетками супензию клеток из селезенки или лимфатических узлов инкубировали в течение 4 ч при 37 °C, в атмосфере 5% CO2 в присутствии 50 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА; «Sigma Aldrich»), 500 нг/мл иономицина («Sigma Aldrich») и 3 мкг/мл брефельдина А («eBioscience», США). Для блокировки неспецифичного связывания антител с Fcγ-рецепторами все клеточные суспензии инкубировали в течение 20 мин при 4 °C с антителами к CD16/CD32 (клон 2.4G2, коллекция in-house DRFZ), после чего клетки отмывали центрифугированием в PBS, содержащем 2% FBS. К клеткам добавляли эпитопспецифичные антитела к поверхностным маркерам: anti-CD45 (клон 30-F11, «BioLegend», США), anti-CD11b (клон M1/70, «BioLegend»), anti-Ly6C (клон HK1.4, «Invitrogen», США), anti-MHCII (клон M5/114.15.2, «BioLegend»), anti-CX3CR1 (клон SA011F11, «Biolegend»), anti-CD4 (клон RM4-5, «BioLegend»), anti-TCRb (клон H57-597, «eBioscience»), anti-IFNγ (клон XMG1.2, «Biolegend»), anti-IL-17A (клон eBio17B7, «BioLegend»), anti-GM-CSF (клон MP1-22E9, «BioLegend»), anti-FoxP3 (клон FJK-16s, «Invitrogen»), anti-RORγt (клон B2D, «Invitrogen»). Для окрашивания мертвых клеток и их исключения из последующего анализа использовали Fixable Viability Dye («eBioscience»). Цитофлуориметрический анализ проводили на приборе BD FACSCanto II или BDFACSAria III («Beckton Dickinson», США). Популяцию CD45+CD4–CX3CR1+ моноцитов крови или CD45+CD11b+CX3CR1+ микроглии сортировали на приборе BDFACSAria III с чистотой >90%. Полученные данные анализировали с помощью FlowJo Software («Beckton Dickinson»).

Иммуноферментный анализ. Отсортированные моноциты и клетки микроглии активировали липополисахаридом (LPS, (100 нг/мл в течение 4 ч)). Затем оценивали концентрацию IL-6 в супернатанте методом ИФА с использованием набора для IL-6 мыши ELISA Ready-SET-Go! («eBioscience», США), следуя протоколу производителя.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью GraphPad Prism 9. Выборки проверяли на нормальность распределения с помощью критериев Шапиро–Уилка или Колмогорова–Смирнова. В случае нормального распределения для сравнения выборок использовали t-критерий Стьюдента или однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). В противном случае использовали непараметрические тесты Манна–Уитни или Крускалла–Уоллиса. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

IL-6 из миелоидных клеток выполняет критически важную роль в патогенезе ЕАЕ. Для изучения роли IL-6 из миелоидных клеток в развитии EAE эксперименты проводили на двух группах генетически модифицированных мышей с генетической инактивацией IL-6: 1) только в дендритных клетках (Il6ΔDC), 2) только в микроглии (Il6ΔMG). Контрольная группа была представлена мышами дикого типа из того же помета (Il6fl/fl). Мыши с удалением IL-6 в дендритных клетках были ранее получены в лаборатории и характеризуются конститутивной инактивацией IL-6 в клетках CD11c+ [11, 15]. Получение мышей с дефицитом IL-6 в микроглии проводили путем скрещивания мышей Cx3cr1CreER, экспрессирующих тамоксифен-зависимую Cre-рекомбиназу под контролем промотора CX3CR1 [13], и мышей с «флоксированным» геном Il6 (Il6fl/fl) [12]. Принцип работы этой системы заключается в клеточно-специфичном удалении окаймленного loxP-сайтами («флоксированного») гена Il6 Cre-рекомбиназой, cшитой с мутантной формой эстрогенового рецептора, только в клетках CX3CR1+ в ответ на введение тамоксифена (рис. 1, а).

 

Рис. 1. Мыши с тамоксифен-зависимой инактивацией IL-6 в CX3CR1+ микроглии устойчивы к развитию ЕАЕ. а – Схема эксперимента. Мышам вводили тамоксифен из расчета 75 мкг/г в течение 5 дней. Далее, через 7–14 дней после курса тамоксифена удаление IL-6 детектировали как в тканерезидентных макрофагах, так и в моноцитах, но уже через 28 дней происходило обновление пула моноцитов из костного мозга и дефицит IL-6 наблюдали только в тканерезидентных макрофагах, в том числе в микроглии; б – концентрация IL-6 в супернатанте отсортированных моноцитов CX3CR1+, выделенных из периферической крови мышей Cx3cr1CreER × Il6fl/fl на 0, 14, 28 дни после введения тамоксифена и активированных LPS в течение 4 ч; ND – не детектируется; в – концентрация IL-6 в супернатанте отсортированной микроглии CX3CR1+, выделенной из ЦНС мышей Cx3cr1CreER × Il6fl/fl на 28 день после введения тамоксифена и активированной LPS в течение 4 ч; г – динамика развития клинических симптомов EAE у мышей дикого типа (Il6fl/fl), мышей с удалением IL-6 только в микроглии (Il6ΔMG) и мышей с удалением IL-6 только в дендритных клетках (Il6ΔDC), иммунизированных MOG35–55-пептидом в полном адъюванте Фрейнда. Результаты представлены как среднее значение ± SEM и подтверждены в трех независимых экспериментах с минимальным количеством мышей в группе n = 4 в каждом эксперименте

 

Для тканеспецифичной инактивации IL-6 исключительно в клетках микроглии мышам Cx3cr1CreER × Il6fl/fl и контрольным мышам дикого типа (Il6fl/fl) вводили тамоксифен из расчета 75 мкг/г в течение 5 дней; через 14 дней после введения тамоксифена удаление IL-6 происходило как в моноцитах (рис. 1, б), дендритных клетках, так и в микроглии [13]. После полного обновления пула миелоидных клеток CX3CR1+ из костного мозга, а именно через 28 дней после введения тамоксифена, такие мыши сохраняли делецию Il6 только в популяции долгоживущих тканерезидентных макрофагов, в том числе в клетках микроглии (рис. 1, в).

Индукцию ЕАЕ проводили путем иммунизации MOG35–55-пептидом в полном адъюванте Фрейнда и последующего введения коклюшного токсина для повышения проницаемости ГЭБ. Оценку клинических симптомов заболевания начинали с 8-го дня после иммунизации. Было установлено, что мыши с дефицитом IL-6 только в микроглии или только в дендритных клетках развивают более слабые симптомы заболевания по сравнению с контрольной группой мышей дикого типа (рис. 1, г). Эти результаты согласуются с литературными данными о том, что именно дендритные клетки [6] и микроглия [16] являются критически важными источниками IL-6 в модели ЕАЕ.

IL-6 из микроглии регулирует иммунный ответ в ЦНС на пике ЕАЕ. Поскольку микроглия – это тканерезидентные макрофаги ЦНС, то предполагается, что опосредуемые этими клетками функции будут в основном затрагивать процессы, происходящие в ЦНС. В связи с этим на 16-й день после иммунизации, что соответствовало эффекторной фазе заболевания, проводили цитофлуориметрический анализ содержания миелоидных клеток и антиген-специфичных CD4+ Т-клеток в ЦНС. Было установлено, что у мышей с инактивацией IL-6 в микроглии происходило уменьшение процентного (рис. 2, а) и абсолютного (рис. 2, б) содержани Ly6СhiMHCII+-моноцитов, являющихся исключительно патогенетическими в модели ЕАЕ. Кроме этого, происходило уменьшение процентного содержания IFNγ-продуцирующих CD4+ Т-клеток (рис. 2, в). Эти результаты согласуются между собой, т.к. именно IFNγ обеспечивает дифференцировку Ly6Chi-моноцитов в MHCII+-эффекторные дендритные клетки [17]. Параллельно, эти результаты соответствуют литературным данным о стимуляции развития Treg (рис. 2, г) при низких концентрациях IFNγ [18].

 

Рис. 2. IL-6, продуцируемый микроглией, стимулирует развитие патогенетических моноцитов в ЦНС и продукцию IFNγ на пике ЕАЕ. а – Доля Ly6СhiMHCII+-клеток от CD45+CD11b+-клеток в ЦНС на пике EAE; б – абсолютное количество Ly6СhiMHCII+-клеток в ЦНС на пике EAE; в – доля IFNγ-продуцирующих клеток, рестимулированных ФMA/иономицином, от клеток CD4+TCRβ+ в ЦНС на пике EAE; г – доля FoxP3+ Treg от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. Представлены объединенные (а, в и г) или репрезентативные данные (б) с числом мышей каждого генотипа n = 5–6. Данные представлены как среднее ± SEM. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; ** p < 0,01

 

Как было установлено в ходе текущей работы, мыши с делецией гена, кодирующего IL-6, в микроглии развивают более слабые симптомы ЕАЕ, по сравнению с мышами дикого типа, однако они не обладают полной устойчивостью к развитию заболевания (рис. 1, г). При этом у таких мышей происходит повышение процентного содержания Treg, подавляющих развитие ЕАЕ (рис. 2, г), то есть, возможно, присутствует дополнительный компонент, обеспечивающий развитие клинических симптомов. Нами было выдвинуто предположение, что у таких мышей может происходить увеличение инфильтрации патогенетических Т-клеток в ЦНС. Известно, что ось CCR6/CCL20 является ключевой для миграции иммунных клеток в ЦНС и особенно необходима для первой волны инфильтрации Т-клеток в ЦНС [19]. Действительно, у мышей с удалением IL-6 в микроглии было обнаружено повышение доли ССR6+ Т-клеток в ЦНС (рис. 3, а). Более того, у таких мышей увеличивалось процентное содержание GM-CSF-, но не IL-17A-продуцирующих CD4+ Т-клеток (рис. 3, б). Известно, что продукция GM-CSF Т-клетками в модели EAE критически важна для патогенеза заболевания [20, 21]. При этом GM-CSF способствует миграции иммунных клеток в ЦНС [22]. Таким образом, повышенное содержание ССR6+ Т-клеток в ЦНС коррелирует с увеличением поляризации Т-клеток в GM-CSF-продуцирующие клетки.

 

Рис. 3. Делеция гена, кодирующего IL-6 в микроглии, приводит к увеличению миграции Т-клеток и индукции GM-CSF-продуцирующих CD4+ Т-клеток в ЦНС. а – Процентное содержание ССR6+-клеток от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. б – Доля GM-CSF-продуцирующих клеток, рестимулированных ФMA/иономицином, от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. Представлены объединенные (а) или репрезентативные данные (б) с числом мышей каждого генотипа n = 5–6. Данные представлены как среднее ± SEM. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; *** p < 0,001; ns – недостоверные отличия

 

Таким образом, у мышей с инактивацией IL-6 в микроглии, в соответствии с уменьшением тяжести клинических симптомов ЕАЕ, обнаружено снижение процентного и количественного содержания воспалительных Ly6СhiMHCII+-моноцитов в ЦНС, коррелирующее со сниженной продукцией IFNγ Т-клетками и увеличением доли протективных Treg. В то же время у мышей с инактивацией IL-6 в микроглии частичная устойчивость к EAE может быть связана с повышением миграции Т-клеток в ЦНС в совокупности с увеличением процентного содержания GM-CSF-продуцирующих CD4+ Т-клеток.

IL-6 из дендритных клеток не только определяет соотношение TH17/Treg, но и влияет на продукцию IFNγ и GM-CSF в периферических лимфоидных органах в модели ЕАЕ. Известно, что одной из функций IL-6 в модели EAE является ингибирование транскрипционного фактора FoxP3, что, в свою очередь, подавляет развитие протективных Treg [23]. С другой стороны, IL-6 критически важен для развития TH17-клеток [6]. Действительно, у мышей с удалением IL-6 в дендритных клетках было обнаружено уменьшение процентного содержания RORγt+ TH17-клеток и увеличение процентного содержания FoxP3+ Treg (рис. 4, а) в лимфатических узлах на пике ЕАЕ, что согласуется со всеми литературными сведениями о патогенетической роли IL-6, продуцируемого дендритными клетками.

 

Рис. 4. IL-6 из дендритных клеток стимулирует продукцию цитокинов CD4+ Т-клетками в периферических лимфоидных органах на пике ЕАЕ. а – Репрезентативные поточечные диаграммы (слева) и процентное содержание (справа) RORγt+ и FoxP3+ CD4+ Т-клеток, выделенных из лимфатических узлов мышей Il6fl/fl и Il6ΔDC на пике ЕАЕ. б–г – Процентное содержание IL-17A-, GM-CSF-, IFNγ-продуцирующих CD4+ Т-клеток, выделенных из селезенки и лимфатических узлов и рестимулированных ФМА/иономицином. Результаты представлены как среднее значение ± SEM и подтверждены в двух независимых экспериментах. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; *** p < 0,001; ns – недостоверные отличия

 

На следующем этапе изучали продукцию цитокинов Т-клетками, выделенными из лимфатических узлов и селезенки мышей Il6fl/fl и Il6ΔDC на пике ЕАЕ и рестимулированными ФМА/иономицином. Было выявлено, что удаление IL-6 из дендритных клеток не влияет на продукцию IL-17A Т-клетками (рис. 4, б), что согласуется с литературными данными [6]. Однако Il6ΔDC-мыши характеризовались снижением продукции GM-CSF (рис. 4, в) и IFNγ (рис. 4, г) как в лимфатических узлах, так и в селезенке.

Таким образом, мыши с удалением IL-6 в дендритных клетках характеризуются увеличением доли Treg и уменьшением продукции IFNγ и GM-CSF Т-клетками в периферических лимфоидных органах, что объясняет развитие слабых симптомов ЕАЕ. При этом результаты настоящей работы говорят о том, что IL-6 из дендритных клеток может не только участвовать в индукции патогенетических TH17-клеток [6], но и стимулировать продукцию GM-CSF и IFNγ Т-клетками.

Заключение

Цитокины играют ключевую роль в патогенезе ЕАЕ. IL-6 является одним из немногих цитокинов, абсолютно необходимых для развития ЕАЕ [24, 25]. Несмотря на то что в ЦНС главным источником IL-6 являются астроциты [10], показано, что в модели ЕАЕ главным источником IL-6 являются миелоидные клетки [6]. При этом удаление IL-6 в миелоидных клетках LysM+ (макрофагах, нейтрофилах) не влияет на течение заболевания [6, 26]. Оказалось, что критически важными для патогенеза ЕАЕ популяциями, продуцирующими IL-6, являются микроглия и дендритные клетки [6].

Действительно, результаты этой работы демонстрируют, что удаление IL-6 в микроглии приводит к развитию слабых симптомов ЕАЕ по сравнению с мышами дикого типа. Стоит отметить, что в другом исследовании было выявлено, что удаление IL-6 в микроглии обеспечивало уменьшение тяжести клинических симптомов EAE у самок, но не у самцов [16], тем самым подтверждая корреляцию преобладания развития РС у женщин. В настоящей работе было установлено, что у мышей с удалением IL-6 в микроглии происходит уменьшение количества провоспалительных Ly6СhiMHCII+-моноцитов, играющих центральную роль в процессе демиелинизации. Этот результат согласуется с литературными данными, демонстрирующими снижение уровня демиелинизации в спинном мозге при удалении IL-6 в микроглии [16]. С другой стороны, речь может идти об одной из вырожденных функций IL-6, поскольку тот же фенотип наблюдается при удалении IL-6 из различных его источников в ЦНС, а именно астроцитов и нейронов [16]. Кроме этого, при удалении IL-6 в микроглии наблюдалось уменьшение продукции IFNγ Т-клетками, что, с одной стороны, объясняет снижение количества Ly6СhiMHCII+-моноцитов [17], с другой стороны, согласуется с увеличением процентного содержания протективных Treg в ЦНС [18].

При этом в противоречии с уменьшением клинических симптомов ЕАЕ у мышей с удалением IL-6 в микроглии происходило увеличение миграции CD4+ Т-клеток в ЦНС и продукции ими GM-CSF. Действительно, в другом исследовании было показано, что инфильтрация Т-клеток при удалении IL-6 из различных клеточных источников в ЦНС не изменяется [16]. Кроме того, полученные результаты служат доказательством корреляции коэкспрессии CCR6 и GM-CSF в инфильтрирующих ЦНС Т-клетках [27]. В совокупности эти данные позволяют предположить, что в контексте нейровоспаления клетки микроглии выполняют как протективные, так и патогенетические функции.

С другой стороны, результаты настоящей работы указывают на исключительно патогенетическую роль IL-6 из дендритных клеток [6]. Действительно, IL-6 из дендритных клеток важен для поддержания баланса RORγt+ TH17-клеток и FoxP3+ Treg. В недавних исследованиях был предложен вариант терапевтического таргетирования этого сигнального пути за счет ингибирования STAT3 малой молекулой [28] для иммуномодуляции клинической картины у пациентов с РС. Примечательно, что в настоящей работе показано, что IL-6 из дендритных клеток также важен для стимуляции продукции Т-клетками IFNγ и GM-CSF, хотя IL-6 не считался цитокином, необходимым для стимуляции продукции GM-CSF [21].

Таким образом, IL-6, продуцируемый клетками микроглии, может выполнять как патогенетические, так и протективные функции, тогда как IL-6 из дендритных клеток играет исключительно патогенетическую роль.

Вклад авторов. М.С. Друцкая – концепция и руководство работой; В.С. Гоголева, К.Т. Нгуен – проведение экспериментов, обсуждение результатов исследования, написание текста; М.С. Друцкая – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-24-00389).

Благодарности. Авторы выражают благодарность К.-С.Н. Атретханы, Д.М. Поташниковой, А.П. Дыгай, Р.В. Зварцеву за ценные советы и методическую помощь в работе. Авторы выражают признательность С.А. Недоспасову за ценные замечания и общее руководство проектом. Работа по сортировке клеток поддержана программой развития МГУ (комплекс для клеточной сортировки на базе FACSAria SORP; «Beckton Dickinson», США).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам учреждения, в котором проводились исследования, и утвержденным правовым актам РФ и международных организаций.

×

Об авторах

В. С. Гоголева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: violettegogoleva@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, 117997, Москва

К. Т. Нгуен

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: violettegogoleva@mail.ru

биологический факультет

Россия, 119991, Москва

М. С. Друцкая

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: violettegogoleva@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, 117997, Москва

Список литературы

  1. Charabati, M., Wheeler, M. A., Weiner, H. L., and Quintana, F. J. (2023) Multiple sclerosis: neuroimmune crosstalk and therapeutic targeting, Cell, 186, 1309-1327, https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.008.
  2. Steinman, L., Patarca, R., and Haseltine, W. (2023) Experimental encephalomyelitis at age 90, still relevant and elucidating how viruses trigger disease, J. Exp. Med., 220, https://doi.org/10.1084/jem.20221322.
  3. Krishnarajah, S., and Becher, B. (2022) T(H) cells and cytokines in encephalitogenic disorders, Front. Immunol., 13, 822919, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.822919.
  4. Gijbels, K., Brocke, S., Abrams, J. S., and Steinman, L. (1995) Administration of neutralizing antibodies to interleukin-6 (IL-6) reduces experimental autoimmune encephalomyelitis and is associated with elevated levels of IL-6 bioactivity in central nervous system and circulation, Mol. Med., 1, 795-805.
  5. Eugster, H. P., Frei, K., Kopf, M., Lassmann, H., and Fontana, A. (1998) IL-6-deficient mice resist myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced autoimmune encephalomyelitis, Eur. J. Immunol., 28, 2178-2187, https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-4141(199807)28:07<2178::AID-IMMU2178>3.0.CO;2-D.
  6. Heink, S., Yogev, N., Garbers, C., Herwerth, M., Aly, L., Gasperi, C., Husterer, V., Croxford, A. L., Moller-Hackbarth, K., Bartsch, H. S., Sotlar, K., Krebs, S., Regen, T., Blum, H., Hemmer, B., Misgeld, T., Wunderlich, T. F., Hidalgo, J., Oukka, M., Rose-John, S., et al. (2017) Trans-presentation of IL-6 by dendritic cells is required for the priming of pathogenic T(H)17 cells, Nat. Immunol., 18, 74-85, https://doi.org/10.1038/ni.3632.
  7. Korn, T., Mitsdoerffer, M., Croxford, A. L., Awasthi, A., Dardalhon, V. A., Galileos, G., Vollmar, P., Stritesky, G. L., Kaplan, M. H., Waisman, A., Kuchroo, V. K., and Oukka, M. (2008) IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 18460-18465, https://doi.org/10.1073/pnas.0809850105.
  8. Ogura, H., Murakami, M., Okuyama, Y., Tsuruoka, M., Kitabayashi, C., Kanamoto, M., Nishihara, M., Iwakura, Y., and Hirano, T. (2008) Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction, Immunity, 29, 628-636, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.07.018.
  9. Ma, X., Reynolds, S. L., Baker, B. J., Li, X., Benveniste, E. N., and Qin, H. (2010) IL-17 enhancement of the IL-6 signaling cascade in astrocytes, J. Immunol., 184, 4898-4906, https://doi.org/10.4049/jimmunol.1000142.
  10. Erta, M., Quintana, A., and Hidalgo, J. (2012) Interleukin-6, a major cytokine in the central nervous system, Int. J. Biol. Sci., 8, 1254-1266, https://doi.org/10.7150/ijbs.4679.
  11. Круглов А. А., Носенко, М. А., Корнеев, К. В. Свиряева Е. Н., Друцкая М. С., Идальго Х., Недоспасов, С. А. (2016) Получение и предварительная характеристика мышей с генетическим дефицитом IL-6 в дендритных клетках, Иммунология, 37, 316-319, https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-316-319.
  12. Quintana, A., Erta, M., Ferrer, B., Comes, G., Giralt, M., and Hidalgo, J. (2013) Astrocyte-specific deficiency of interleukin-6 and its receptor reveal specific roles in survival, body weight and behavior, Brain Behav. Immun., 27, 162-173, https://doi.org/10.1016/j.bbi.2012.10.011.
  13. Yona, S., Kim, K. W., Wolf, Y., Mildner, A., Varol, D., Breker, M., Strauss-Ayali, D., Viukov, S., Guilliams, M., Misharin, A., Hume, D. A., Perlman, H., Malissen, B., Zelzer, E., and Jung, S. (2013) Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis, Immunity, 38, 79-91, https://doi.org/10.1016/ j.immuni.2012.12.001.
  14. Mufazalov, I. A., and Waisman, A. (2016) Isolation of central nervous system (CNS) infiltrating cells, Methods Mol. Biol., 1304, 73-79, https://doi.org/10.1007/7651_2014_114.
  15. Gubernatorova, E. O., Gorshkova, E. A., Namakanova, O. A., Zvartsev, R. V., Hidalgo, J., Drutskaya, M. S., Tumanov, A. V., and Nedospasov, S. A. (2018) Non-redundant functions of IL-6 produced by macrophages and dendritic cells in allergic airway inflammation, Front. Immunol., 9, 2718, https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02718.
  16. Sanchis, P., Fernandez-Gayol, O., Comes, G., Escrig, A., Giralt, M., Palmiter, R. D., and Hidalgo, J. (2020) Interleukin-6 derived from the central nervous system may influence the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in a cell-dependent manner, Cells, 9, 330, https://doi.org/10.3390/cells9020330.
  17. Amorim, A., De Feo, D., Friebel, E., Ingelfinger, F., Anderfuhren, C. D., Krishnarajah, S., Andreadou, M., Welsh, C. A., Liu, Z., Ginhoux, F., Greter, M., and Becher, B. (2022) IFNgamma and GM-CSF control complementary differentiation programs in the monocyte-to-phagocyte transition during neuroinflammation, Nat. Immunol., 23, 217-228, https://doi.org/10.1038/s41590-021-01117-7.
  18. Ottum, P. A., Arellano, G., Reyes, L. I., Iruretagoyena, M., and Naves, R. (2015) Opposing roles of interferon-gamma on cells of the central nervous system in autoimmune neuroinflammation, Front. Immunol., 6, 539, https:// doi.org/10.3389/fimmu.2015.00539.
  19. Reboldi, A., Coisne, C., Baumjohann, D., Benvenuto, F., Bottinelli, D., Lira, S., Uccelli, A., Lanzavecchia, A., Engelhardt, B., and Sallusto, F. (2009) C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE, Nat. Immunol., 10, 514-523, https://doi.org/10.1038/ ni.1716.
  20. Codarri, L., Gyulveszi, G., Tosevski, V., Hesske, L., Fontana, A., Magnenat, L., Suter, T., and Becher, B. (2011) RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation, Nat. Immunol., 12, 560-567, https://doi.org/10.1038/ni.2027.
  21. Komuczki, J., Tuzlak, S., Friebel, E., Hartwig, T., Spath, S., Rosenstiel, P., Waisman, A., Opitz, L., Oukka, M., Schreiner, B., Pelczar, P., and Becher, B. (2019) Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta, Immunity, 50, 1289-1304.e1286, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.04.006.
  22. McQualter, J. L., Darwiche, R., Ewing, C., Onuki, M., Kay, T. W., Hamilton, J. A., Reid, H. H., and Bernard, C. C. (2001) Granulocyte macrophage colony-stimulating factor: a new putative therapeutic target in multiple sclerosis, J. Exp. Med., 194, 873-882, https://doi.org/10.1084/jem.194.7.873.
  23. Korn, T., and Hiltensperger, M. (2021) Role of IL-6 in the commitment of T cell subsets, Cytokine, 146, 155654, https://doi.org/10.1016/j.cyto.2021.155654.
  24. Samoilova, E. B., Horton, J. L., Hilliard, B., Liu, T. S., and Chen, Y. (1998) IL-6-deficient mice are resistant to experimental autoimmune encephalomyelitis: roles of IL-6 in the activation and differentiation of autoreactive T cells, J. Immunol., 161, 6480-6486.
  25. Okuda, Y., Sakoda, S., Bernard, C. C., Fujimura, H., Saeki, Y., Kishimoto, T., and Yanagihara, T. (1998) IL-6-deficient mice are resistant to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein, Int. Immunol., 10, 703-708, https://doi.org/10.1093/intimm/10.5.703.
  26. Drutskaya, M. S., Gogoleva, V. S., Atretkhany, K. S. N., Gubernatorova, E. O., Zvartsev, R. V., Nosenko M. A., and Nedospasov, S. A. (2018) Proinflammatory and immunoregulatory functions of interleukin 6 as identified by reverse genetics, Mol. Biol., 52, 963-974, https://doi.org/10.1134/S0026893318060055.
  27. Restorick, S. M., Durant, L., Kalra, S., Hassan-Smith, G., Rathbone, E., Douglas, M. R., and Curnow, S. J. (2017) CCR6+ Th cells in the cerebrospinal fluid of persons with multiple sclerosis are dominated by pathogenic non-classic Th1 cells and GM-CSF-only-secreting Th cells, Brain Behav. Immun., 64, 71-79, https://doi.org/10.1016/ j.bbi.2017.03.008.
  28. Aqel, S. I., Yang, X., Kraus, E. E., Song, J., Farinas, M. F., Zhao, E. Y., Pei, W., Lovett-Racke, A. E., Racke, M. K., Li, C., and Yang, Y. (2021) A STAT3 inhibitor ameliorates CNS autoimmunity by restoring Teff:Treg balance, JCI Insight, 6, e142376, https://doi.org/10.1172/jci.insight.142376.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Мыши с тамоксифен-зависимой инактивацией IL-6 в CX3CR1+ микроглии устойчивы к развитию ЕАЕ. а – Схема эксперимента. Мышам вводили тамоксифен из расчета 75 мкг/г в течение 5 дней. Далее, через 7–14 дней после курса тамоксифена удаление IL-6 детектировали как в тканерезидентных макрофагах, так и в моноцитах, но уже через 28 дней происходило обновление пула моноцитов из костного мозга и дефицит IL-6 наблюдали только в тканерезидентных макрофагах, в том числе в микроглии; б – концентрация IL-6 в супернатанте отсортированных моноцитов CX3CR1+, выделенных из периферической крови мышей Cx3cr1CreER × Il6fl/fl на 0, 14, 28 дни после введения тамоксифена и активированных LPS в течение 4 ч; ND – не детектируется; в – концентрация IL-6 в супернатанте отсортированной микроглии CX3CR1+, выделенной из ЦНС мышей Cx3cr1CreER × Il6fl/fl на 28 день после введения тамоксифена и активированной LPS в течение 4 ч; г – динамика развития клинических симптомов EAE у мышей дикого типа (Il6fl/fl), мышей с удалением IL-6 только в микроглии (Il6ΔMG) и мышей с удалением IL-6 только в дендритных клетках (Il6ΔDC), иммунизированных MOG35–55-пептидом в полном адъюванте Фрейнда. Результаты представлены как среднее значение ± SEM и подтверждены в трех независимых экспериментах с минимальным количеством мышей в группе n = 4 в каждом эксперименте

Скачать (190KB)
Метаданные
3. Рис. 2. IL-6, продуцируемый микроглией, стимулирует развитие патогенетических моноцитов в ЦНС и продукцию IFNγ на пике ЕАЕ. а – Доля Ly6СhiMHCII+-клеток от CD45+CD11b+-клеток в ЦНС на пике EAE; б – абсолютное количество Ly6СhiMHCII+-клеток в ЦНС на пике EAE; в – доля IFNγ-продуцирующих клеток, рестимулированных ФMA/иономицином, от клеток CD4+TCRβ+ в ЦНС на пике EAE; г – доля FoxP3+ Treg от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. Представлены объединенные (а, в и г) или репрезентативные данные (б) с числом мышей каждого генотипа n = 5–6. Данные представлены как среднее ± SEM. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; ** p < 0,01

Скачать (149KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Делеция гена, кодирующего IL-6 в микроглии, приводит к увеличению миграции Т-клеток и индукции GM-CSF-продуцирующих CD4+ Т-клеток в ЦНС. а – Процентное содержание ССR6+-клеток от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. б – Доля GM-CSF-продуцирующих клеток, рестимулированных ФMA/иономицином, от CD4+TCRβ+-клеток в ЦНС на пике EAE. Представлены объединенные (а) или репрезентативные данные (б) с числом мышей каждого генотипа n = 5–6. Данные представлены как среднее ± SEM. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; *** p < 0,001; ns – недостоверные отличия

Скачать (84KB)
Метаданные
5. Рис. 4. IL-6 из дендритных клеток стимулирует продукцию цитокинов CD4+ Т-клетками в периферических лимфоидных органах на пике ЕАЕ. а – Репрезентативные поточечные диаграммы (слева) и процентное содержание (справа) RORγt+ и FoxP3+ CD4+ Т-клеток, выделенных из лимфатических узлов мышей Il6fl/fl и Il6ΔDC на пике ЕАЕ. б–г – Процентное содержание IL-17A-, GM-CSF-, IFNγ-продуцирующих CD4+ Т-клеток, выделенных из селезенки и лимфатических узлов и рестимулированных ФМА/иономицином. Результаты представлены как среднее значение ± SEM и подтверждены в двух независимых экспериментах. Использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни; * p < 0,05; *** p < 0,001; ns – недостоверные отличия

Скачать (308KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».