Влияние расположения и ориентации генетического токсин-антитоксинового элемента hok/sok на уровень биосинтеза фармацевтически значимых белков в бактериальной системе экспрессии

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Генетический токсин-антитоксиновый элемент hok/sok из плазмиды R1 Escherichia coli обеспечивает сегрегационную стабильность плазмид. Бактериальные клетки, потерявшие все копии плазмиды, кодирующей короткоживущий антитоксин, гибнут под действием долгоживущего токсина. Элемент hok/sok в составе векторных плазмид для бактериальной экспрессии может увеличивать продуктивное время биосинтеза рекомбинантных белков, замедляя накопление в популяции непродуцирующих клеток, лишенных целевой плазмиды. В настоящей работе были исследованы различные варианты расположения и ориентации элемента hok/sok в составе стандартной плазмиды pET28a с индуцибельным промотором T7lac и геном устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что элемент hok/sok сохраняет функциональную активность вне зависимости от расположения на плазмиде и ориентации, бактериальные клетки сохраняли плазмиды с hok/sok после 4-х дней культивирования без антибиотика и теряли контрольную плазмиду без данного элемента. На примере трех целевых белков - аспаргиназы E. coli тип II, гормона роста человека и нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2 было продемонстрировано, что для цитоплазматических целевых белков максимальная продуктивность бактерий сохраняется только при расположении элемента hok/sok на плазмиде выше промотора целевого гена. В случае периплазматической локализации белка продуктивность бактерий уменьшается для всех вариантов расположения hok/sok при культивировании с антибиотиком, а при периодическом культивировании бактерий без антибиотика продуктивность лучше сохраняется также при расположении элемента hok/sok выше промотора целевого гена. Данный вариант векторной плазмиды pEHU позволяет увеличить биосинтез нерастворимого в цитоплазме бактерий гормона роста человека более, чем в 2 раза при культивировании бактерий без антибиотика, а также поддерживать биосинтез аспарагиназы при периодическом культивировании без антибиотика в течение 4-х дней на уровне не менее 10 мг/литр. Разработанный сегрегационно стабилизированный плазмидный вектор может быть использован для получения в клетках E. coli различных рекомбинантных белков без применения антибиотиков.

Об авторах

Ю. А Ходак

ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии

117312 Москва, Россия

Р. Р Шайфутдинов

ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии

117312 Москва, Россия

Д. С Хасанов

ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии

117312 Москва, Россия

Н. А Орлова

ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии

117312 Москва, Россия

И. И Воробьев

ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии

Email: ptichman@gmail.com
117312 Москва, Россия

Список литературы

  1. Collins, T., Azevedo-Silva, J., da Costa, A., Branca, F., Machado, R., and Casal, M. (2013) Batch production of a silk-elastin-like protein in E. coli BL21(DE3): key parameters for optimisation, Microb. Cell Fact., 12, 21, doi: 10.1186/1475-2859-12-21.
  2. Pandey, D. P., and Gerdes, K. (2005) Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes, Nucleic Acids Res., 33, 966-976, doi: 10.1093/nar/gki201.
  3. Gerdes, K., Rasmussen, P. B., and Molin, S. (1986) Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3116-3120, doi: 10.1073/pnas.83.10.3116.
  4. Lehnherr, H., Maguin, E., Jafri, S., and Yarmolinsky, M. B. (1993) Plasmid addiction genes of bacteriophage P1: doc, which causes cell death on curing of prophage, and phd, which prevents host death when prophage is retained, J. Mol. Biol., 233, 414-428, doi: 10.1006/jmbi.1993.1521.
  5. Singh, G., Yadav, M., Ghosh, C., and Rathore, J. S. (2021) Bacterial toxin-antitoxin modules: classification, functions, and association with persistence, Curr. Res. Microb. Sci., 2, 100047, doi: 10.1016/j.crmicr.2021.100047.
  6. Van Melderen, L., Thi, M. H., Lecchi, P., Gottesman, S., Couturier, M., and Maurizi, M. R. (1996) ATP-dependent degradation of CcdA by Lon protease. Effects of secondary structure and heterologous subunit interactions, J. Biol. Chem., 271, 27730-27738, doi: 10.1074/jbc.271.44.27730.
  7. Michel, B. (2005) After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us, PLoS Biol., 3, e255, doi: 10.1371/journal.pbio.0030255.
  8. Fineran, P. C., Blower, T. R., Foulds, I. J., Humphreys, D. P., Lilley, K. S., and Salmond, G. P. (2009) The phage abortive infection system, ToxIN, functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 894-899, doi: 10.1073/pnas.0808832106.
  9. Jankevicius, G., Ariza, A., Ahel, M., and Ahel, I. (2016) The toxin-antitoxin system DarTG catalyzes reversible ADP-ribosylation of DNA, Mol. Cell, 64, 1109-1116, doi: 10.1016/j.molcel.2016.11.014.
  10. Wang, X., Lord, D. M., Hong, S. H., Peti, W., Benedik, M. J., Page, R., and Wood, T. K. (2013) Type II toxin/antitoxin MqsR/MqsA controls type V toxin/antitoxin GhoT/GhoS, Environ. Microbiol., 15, 1734-1744, doi: 10.1111/1462-2920.12063.
  11. Aakre, C. D., Phung, T. N., Huang, D., and Laub, M. T. (2013) A bacterial toxin inhibits DNA replication elongation through a direct interaction with the beta sliding clamp, Mol. Cell, 52, 617-628, doi: 10.1016/j.molcel.2013.10.014.
  12. Wang, X., Yao, J., Sun, Y. C., and Wood, T. K. (2021) Type VII toxin/antitoxin classification system for antitoxins that enzymatically neutralize toxins, Trends Microbiol., 29, 388-393, doi: 10.1016/j.tim.2020.12.001.
  13. Choi, J. S., Kim, W., Suk, S., Park, H., Bak, G., Yoon, J., and Lee, Y. (2018) The small RNA, SdsR, acts as a novel type of toxin in Escherichia coli, RNA Biol., 15, 1319-1335, doi: 10.1080/15476286.2018.1532252.
  14. Gerdes, K., and Maisonneuve, E. (2012) Bacterial persistence and toxin-antitoxin loci, Annu. Rev. Microbiol., 66, 103-123, doi: 10.1146/annurev-micro-092611-150159.
  15. Yamaguchi, Y., and Inouye, M. (2011) Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems, Nat. Rev. Microbiol., 9, 779-790, doi: 10.1038/nrmicro2651.
  16. Gerdes, K., Larsen, J. E., and Molin, S. (1985) Stable inheritance of plasmid R1 requires two different loci, J. Bacteriol., 161, 292-298, doi: 10.1128/JB.161.1.292-298.1985.
  17. Pecota, D. C., Osapay, G., Selsted, M. E., and Wood, T. K. (2003) Antimicrobial properties of the Escherichia coli R1 plasmid host killing peptide, J. Biotechnol., 100, 1-12, doi: 10.1016/s0168-1656(02)00240-7.
  18. Gerdes, K. (2016) Hypothesis: type I toxin-antitoxin genes enter the persistence field-a feedback mechanism explaining membrane homoeostasis, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 371, 20160189, doi: 10.1098/rstb.2016.0189.
  19. Unterholzner, S. J., Poppenberger, B., and Rozhon, W. (2013) Toxin-antitoxin systems: Biology, identification, and application, Mob. Genet. Elements, 3, e26219, doi: 10.4161/mge.26219.
  20. Van Melderen, L. (2010) Toxin-antitoxin systems: why so many, what for? Curr. Opin. Microbiol., 13, 781-785, doi: 10.1016/j.mib.2010.10.006.
  21. Pedersen, K., and Gerdes, K. (1999) Multiple hok genes on the chromosome of Escherichia coli, Mol. Microbiol., 32, 1090-1102, doi: 10.1046/j.1365-2958.1999.01431.x.
  22. Pedersen, K., Christensen, S. K., and Gerdes, K. (2002) Rapid induction and reversal of a bacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins, Mol. Microbiol., 45, 501-510, doi: 10.1046/j.1365-2958.2002.03027.x.
  23. Wilmaerts, D., Dewachter, L., De Loose, P. J., Bollen, C., Verstraeten, N., and Michiels, J. (2019) HokB monomerization and membrane repolarization control persister awakening, Mol. Cell, 75, 1031-1042.e4, doi: 10.1016/j.molcel.2019.06.015.
  24. Chukwudi, C. U., and Good, L. (2015) The role of the hok/sok locus in bacterial response to stressful growth conditions, Microb. Pathog., 79, 70-79, doi: 10.1016/j.micpath.2015.01.009.
  25. Pecota, D. C., Kim, C. S., Wu, K., Gerdes, K., and Wood, T. K. (1997) Combining the hok/sok, parDE, and pnd postsegregational killer loci to enhance plasmid stability, Appl. Environ. Microbiol., 63, 1917-1924, doi: 10.1128/AEM.63.5.1917-1924.1997.
  26. De Moerlooze, L., Struman, I., Renard, A., and Martial, J. A. (1992) Stabilization of T7-promoter-based pARHS expression vectors using the parB locus, Gene, 119, 91-93, doi: 10.1016/0378-1119(92)90070-6.
  27. Mishima, N., Mizumoto, K., Iwasaki, Y., Nakano, H., and Yamane, T. (1997) Insertion of stabilizing loci in vectors of T7 RNA polymerase-mediated Escherichia coli expression systems: a case study on the plasmids involving foreign phospholipase D gene, Biotechnol. Prog., 13, 864-868, doi: 10.1021/bp970084o.
  28. Galen, J. E., Nair, J., Wang, J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein, M. B., and Levine, M. M. (1999) Optimization of plasmid maintenance in the attenuated live vector vaccine strain Salmonella typhi CVD 908-htrA, Infect. Immun., 67, 6424-6433, doi: 10.1128/IAI.67.12.6424-6433.1999.
  29. Morin, C. E., and Kaper, J. B. (2009) Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 57, 69-79, doi: 10.1111/j.1574-695X.2009.00580.x.
  30. Kolesov, D. E., Sinegubova, M. V., Safenkova, I. V., Vorobiev, I. I, and Orlova, N. A. (2022) Antigenic properties of the SARS-CoV-2 nucleoprotein are altered by the RNA admixture, PeerJ, 10, e12751, doi: 10.7717/peerj.12751.
  31. Gerdes, K., Jacobsen, J. S., and Franch, T. (1997). Plasmid Stabilization by Post-Segregational Killing, in Genetic Engineering (Setlow, J. K., ed), Vol. 19, Springer, Boston, MA, doi: 10.1007/978-1-4615-5925-2_3.
  32. Liao, Y. C., Saengsawang, B., Chen, J. W., Zhuo, X. Z., and Li, S. Y. (2022) Construction of an antibiotic-free vector and its application in the metabolic engineering of Escherichia coli for polyhydroxybutyrate production, Front. Bioeng. Biotechnol., 10, 837944, doi: 10.3389/fbioe.2022.837944.
  33. Sun, B. Y., Wang, F. Q., Zhao, J., Tao, X. Y., Liu, M., and Wei, D. Z. (2023) Engineering Escherichia coli for l-homoserine production, J. Basic Microbiol., 63, 168-178, doi: 10.1002/jobm.202200488.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2023

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».