Aryliden-imidazolones as fluorogens of NanoLuc protein

全文:

Сокращения: GFP – зеленый флуоресцентный белок; PEI – полиэтиленимин.

ВВЕДЕНИЕ

Последнее время во флуоресцентной микроскопии все чаще и чаще используются так называемые флуорогенные красители [1]. Красители такого типа в свободном виде в растворе не обладают выраженной флуоресценцией. Однако яркость флуоресценции этих веществ многократно увеличивается в результате их связывания с определенными объектами. Среди всего множества флуорогенных красителей отдельное место занимают арилиден-имидазолоны – хромофоры флуоресцентных белков [2]. Они используются для флуорогенного окрашивания нуклеиновых кислот [3, 4] и других клеточных компонентов [5, 6], а также крайне эффективны в качестве лигандов для флуороген-активирующих белков [7, 8]. Такие белки, в отличие от флуоресцентных белков, не формируют внутренний хромофор из собственных аминокислот, а образуют флуоресцентный комплекс с флуорогеном, который добавляется в систему извне [9]. Так, ранее на основе арилиден-имидазолонов и их стирольных производных была синтезирована линейка разноцветных флуорогенов для популярного флуороген-активирующего белка FAST и его мутантных форм [10, 11].

Недавно нами было показано, что гетероциклические производные таких красителей также могут быть использованы для флуорогенного мечения белка NanoLuc [12]. В настоящей работе мы решили расширить возможность их применения в данной роли.

Белок NanoLuc (одна из самых известных люцифераз) катализирует реакцию биолюминесценции – процесс окисления органических молекул, сопровождающийся испусканием света [13]. Белок NanoLuc был разработан на основе люциферазы глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris. Субстрат люциферазы глубоководной креветки – целентеразин, а белка NanoLuc – фуримазин. Эти соединения по строению очень похожи на такие арилиден-имидазолоны, как хромофоры белков GFP и Kaede (схема 1). Ранее такое структурное подобие позволило нам выявить несколько флуорогенных лигандов, содержащих в арилиденовой части пиррольную группу (схема 1), которые связывались с белком NanoLuc с образованием флуоресцентных комплексов [12]. Анализ полученных данных позволил предположить, что аналогичными свойствами будут обладать не только гетероциклические производные, но и соединения, содержащие в арилиденовом фрагменте бензольное кольцо с донорными заместителями в орто-положении. В связи с этим целью настоящей работы стал синтез ряда таких более отдаленных производных хромофоров белков GFP и Kaede и анализ возможности их применения в качестве флуорогенов для белка NanoLuc.

 

Схема 1. Структуры субстратов люцифераз, хромофоры флуоресцентных белков, ранее предложенные нами флуорогены для белка NanoLuc и флуороген для белка NanoLuc, полученный в этой работе.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы мы синтезировали ряд арилиден-имидазолонов, содержащих разные заместители в орто-положении бензилиденового фрагмента (схема 2, соединения (I)). Производные (I) были получены при взаимодействии исходных ароматических альдегидов с иминоэфиром и бензиламином или тирамином. Затем из полученных арилиден- имидазолонов были синтезированы производные хромофора белка Kaede (схема 2, соединения (II)). Имидазолоны конденсировали с бензальдегидом или 4-гидроксибензальдегидом в пиридине в присутствии пиперидина.

 

Схема 2. Схема синтеза соединений (I) и (II).

 

Далее были изучены флуорогенные свойства всех полученных соединений. Сначала мы проверили, будет ли увеличиваться интенсивность флуоресценции соединений в присутствии белка NanoLuc. Было установлено, что для подавляющего большинства соединений добавление белка приводит лишь к незначительному (примерно трехкратному) усилению флуоресцентного сигнала. Однако для пары производных, содержащих диметиламинную или метоксигруппы в орто-положении, а также бензильный заместитель в имидазолоновом кольце и гидроксигруппу в пара-положении стирольного фрагмента (соединения (IIc) и (IIf)), наблюдалось заметное увеличение интенсивности флуоресценции более чем на порядок.

Далее мы изучили, насколько эффективно эти два соединения связываются с белком NanoLuc. Оказалось, что соединение с диметиламинной группой в орто-положении бензилиденового фрагмента (соединение (IIc)) обладает высокой аффинностью (K_d = 0.05 мкM), в то время как производное, содержащее в том же положении метоксигруппу (соединение (IIf)), характеризуется очень слабым связыванием с белком (K_d > 5 мкМ).

На финальном этапе данного исследования мы изучили возможность окрашивания живых клеток с использованием соединения (IIc), которое обладает высокой аффинностью к белку и формирует комплекс с наиболее интенсивной флуоресценцией. Для этой цели были использованы клетки HEK293, трансфицированные конструкцией NanoLuc-H2B. Конструкт экспрессировался клетками как единая полипептидная цепь под управлением CMV-промотора. Гистоны H2B – типичная модель для изучения генетически-кодируемого флуоресцентного мечения, т.к. в этом случае наблюдается достаточно яркий сигнал с четкой локализацией. Более того, такая локализация флуороген-активирующего белка также позволяет сразу оценить проницаемость красителя, поскольку для выраженного мечения ему необходимо проникнуть в ядро клетки. Мы показали, что при добавлении предложенного нами соединения (IIc) к соответствующим образом трансфицированным клеткам наблюдается выраженное целевое мечение при отсутствии сильного фонового окрашивания (рис. 1).

 

Рис. 1. Микрофотографии живых клеток HEK293, экспрессирующих локализирующуюся в ядре конструкцию H2B-NanoLuc в присутствии 5 мкМ соединения (IIc): (a) – изображение, полученное в проходящем свете; (б) – та же область, визуализированная с использованием куба TxRed. Масштабный отрезок—10 мкм.

 

Таким образом, мы показали, что производные хромофора Kaede на основе орто-замещенных бензилиден-имидазолонов и белок NanoLuc могут быть использованы для флуоресцентного мечения живых клеток во флуоресцентной микроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование. Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) регистрировали на приборах Fourier 300 (300 МГц; Bruker, США) и Avance III NMR (700 МГц; Bruker, США) в DMSO-d₆ (внутренний стандарт – Me₄Si), спектры флуоресценции – на 96-луночном микропланшетном ридере Tecan Infinite 200 Pro M Nano (Tecan Trading AG, Швейцария). Температуры плавления определяли на приборе SMP 30 (Stuart Scientific, Великобритания) и не исправляли. Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе TripleTOF 5600⁺ (AB Sciex, США) с ионизацией методом электроспрея (ESI). Напряжение на капилляре 5.5 кВ в режиме регистрации положительных ионов, 4.5 кВ в режиме регистрации отрицательных ионов. Поток газа-носителя – 15 Arb, газа-аспылителя – 25 Arb. Ввод проб производили с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 20 мкл/мин.

Синтез (Z)-5-бензилиден-3-арил-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов (I). Соответствующий ароматический альдегид (10 ммоль) растворяли в хлороформе (50 мл) и смешивали с соответствующим амином (10.5 ммоль), пирролидином (7 мг, 0.1 ммоль) и безводным сульфатом натрия (10 г). Полученную смесь перемешивали в течение 72 ч при комнатной температуре, отфильтровывали и высушивали над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный остаток смешивали с этил((метокси)амино)ацетатом (12 ммоль), при необходимости добавляли 5–10 мл метанола для равномерного смешивания. Полученную смесь перемешивали 72 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный продукт дополнительно очищали с помощью колоночной хроматографии (элюент хлороформ–этанол 20 : 1).

Синтез (Z)-5-бензилиден-3-арил-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов (II). К раствору соответствующего (Z)-5-бензилиден-3-арил-2-метил- 3,5-дигидро-4H-имидазол-4-она (1 ммоль) в пиридине (5 мл) добавляли пиперидин (0.02 мл) и соответствующий ароматический альдегид (5 ммоль). Полученную реакционную смесь кипятили 5–48 ч, прохождение реакции отслеживали с помощью тонкослойной хроматографии (элюент хлороформ–этанол 20 : 1). Далее реакционную смесь упаривали при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в этилацетате (35 мл), промывали фосфатным буфером (рН 7.0, 3 × 15 мл), насыщенным раствором хлорида калия (3 × 25 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Полученный продукт дополнительно очищали с помощью колоночной хроматографии (элюент хлороформ–этанол 20 : 1).

(Z)-5-(2-(Диметиламино)бензилиден)-3-бензил-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (Ia). Желтый порошок (2.07 г, 65%); т. пл. 135–137°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.57 (дд, J 7.9, 1.2, 1H), 7.33–7.40 (м, 4H), 7.30 (т, J 7.4, 1H), 7.26 (д, J 7.2, 2H), 7.14 (д, J 8.0, 1H), 7.08 (т, J 7.5, 1H), 4.84 (с, 2H), 2.73 (с, 6H), 2.27 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (176 МГц, DMSO-d₆): 170.1, 162.8, 154.8, 137.3, 136.7, 132.7, 130.8, 128.8, 127.5, 126.9, 126.6, 122.3, 122.0, 118.4, 45.0, 43.0, 15.5. HRMS (ESI) m/z: найдено М 320.1753; рассчитано для C₂₀H₂₂N₃O⁺, [M + H]⁺ 320.1757.

(Z)-5-(2-(Диметиламино)бензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (Ib). Желтый порошок (2.55 г, 73%); т. пл. 172–174°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 9.22 (с, 1H), 8.52 (дд, J 7.8, 1.3, 1H), 7.34 (т, J 8.5, 1H), 7.25 (с, 1H), 7.13 (д, J 7.6, 1H), 7.06 (т, J 7.5, 1H), 6.98 (д, J 8.4, 2H), 6.68 (д, J 8.6, 2H), 3.72 (т, J 7.2, 2H), 2.75 (т, J 7.1, 2H), 2.72 (с, 6H), 2.07 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 170.0, 163.2, 156.0, 154.7, 137.6, 132.7, 130.7, 129.8, 128.3, 126.7, 122.1, 121.5, 118.4, 115.3, 45.0, 42.1, 33.5, 15.0. HRMS (ESI) m/z: найдено М 350.1862; рассчитано для C₂₁H₂₄N₃O₂⁺, [M + H]⁺ 350.1863.

(Z)-5-(2-(Метоксибензилиден)-3-бензил-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (Ic). Желтый порошок (2.40 г, 79%); т. пл. 123–125°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.72 (дд, J 7.8, 1.1, 1H), 7.39–7.43 (м, 2H), 7.37 (т, J 7.5, 2H), 7.30 (т, J 7.3, 1H), 7.24 (д, J 7.4, 2H), 7.09 (д, J 8.2, 1H), 7.04 (т, J 7.5, 1H), 4.83 (с, 2H), 3.89 (с, 3H), 2.27 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.9, 163.3, 158.5, 137.9, 136.7, 132.2, 132.0, 128.8, 127.5, 126.8, 122.2, 120.6, 118.7, 111.3, 55.7, 43.0, 15.6. HRMS (ESI) m/z: найдено М 307.1483; рассчитано для C₁₉H₁₉N₂O₂⁺, [M + H]⁺ 307.1441.

(Z)-5-(2-(Метоксибензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (Id). Желтый порошок (2.18 г, 65%); т. пл. 105–107°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 9.22 (с, 1H), 8.68 (дд, J 7.7, 1.4, 1H), 7.40 (т, J 8.7, 1H), 7.30 (с, 1H), 7.08 (д, J 8.4, 1H), 7.02 (т, J 7.5, 1H), 6.96 (д, J 8.4, 2H), 6.67 (д, J 8.4, 2H), 3.89 (с, 3H), 3.72 (т, J 7.1, 2H), 2.74 (т, J 7.1, 2H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.8, 163.7, 158.4, 156.0, 138.1, 132.1, 131.8, 129.8, 128.2, 122.3, 120.6, 117.7, 115.3, 111.3, 55.7, 42.0, 33.4, 15.1. HRMS (ESI) m/z: найдено М 337.1551; рассчитано для C₂₀H₂₁N₂O₃⁺, [M + H]⁺ 337.1547.

(Z)-5-(2-Гидроксибензилиден)-3-бензил-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (Ie). Желтый порошок (2.57 г, 88%); т. пл. 136–138°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 11.49 (с, 1H), 8.26 (д, J 7.8, 1H), 7.37 (т, J 7.5, 2H), 7.34 (с, 1H), 7.32–7.27 (м, 2H), 7.26 (д, J 7.0, 2H), 6.91–6.85 (м, 2H), 4.85 (с, 2H), 2.29 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.0, 161.6, 157.7, 136.6, 135.5, 133.7, 132.6, 128.8, 127.6, 126.9, 122.8, 120.4, 119.4, 116.7, 43.1, 15.5. HRMS (ESI) m/z: найдено М 293.1287; рассчитано для C₁₈H₁₇N₂O₂⁺, [M + H]⁺ 293.1285.

(Z)-5-(2-Гидроксибензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-метил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (If). Желтый порошок (2.19 г, 68%); т. пл. 221–223°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 11.71 (с, 1H), 9.23 (с, 1H), 8.15 (д, J 7.0, 1H), 7.27 (т, J 8.6, 1H), 7.23 (с, 1H), 6.97 (д, J 8.5, 2H), 6.90–6.83 (м, 2H), 6.67 (д, J 8.5, 2H), 3.74 (т, J 7.1, 2H), 2.75 (т, J 7.1, 2H), 2.06 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 168.7, 161.7, 157.6, 156.0, 135.4, 133.9, 132.6, 129.9, 128.2, 122.5, 120.3, 119.3, 116.9, 115.3, 42.2, 33.4, 14.9. HRMS (ESI) m/z: найдено М 323.1396; рассчитано для C₁₉H₁₉N₂O₃⁺, [M + H]⁺ 323.1390.

5-((Z)-2-(Диметиламино)бензилиден)-3-бензил-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIa). Оранжевый порошок (360 мг, 89%); т. пл. 153–155°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.75 (дд, J 7.9, 1.7, 1H), 7.97 (д, J 15.6, 1H), 7.76 (д, J 6.6, 2H), 7.46–7.40 (м, 4H), 7.40–7.35 (м, 3H), 7.32 (д, J 7.0, 2H), 7.27 (т, J 7.2, 1H), 7.22 (д, J 15.7, 1H), 7.16 (д, J 8.3, 1H), 7.14 (т, J 7.2, 1H), 5.08 (с, 2H), 2.76 (с, 6H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 170.3, 159.4, 155.0, 140.2, 138.0, 137.3, 134.9, 133.0, 131.0, 130.2, 129.0, 128.8, 128.3, 127.5, 127.0, 126.9, 122.5, 122.3, 118.5, 113.9, 45.2, 42.6. HRMS (ESI) m/z: найдено М 408.2069; рассчитано для C₂₇H₂₆N₃O⁺, [M + H]⁺ 408.2070.

5-((Z)-2-(Диметиламино)бензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIb). Красный порошок (326 мг, 54%); т. пл. 136–138°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 9.13 (с, 1H), 8.70 (дд, J 7.7, 1.4, 1H), 7.88 (д, J 16.0, 1H), 7.75 (д, J 7.2, 2H), 7.47–7.43 (м, 3H), 7.37 (т, J 7.9, 1H), 7.30 (с, 1H), 7.15 (д, J 8.3, 1H), 7.12 (т, J 7.8, 1H), 7.02 (д, J 8.5, 2H), 6.93 (д, J 15.7, 1H), 6.64 (д, J 8.5, 2H), 3.98 (т, J 7.0, 2H), 2.78 (т, J 7.2, 2H), 2.75 (с, 6H). ¹³C-ЯМР (176 МГц, DMSO-d₆): 170.1, 159.7, 156.0, 154.9, 139.7, 138.2, 135.1, 132.9, 130.8, 130.0, 129.9, 128.9, 128.3, 128.1, 127.1, 122.2, 121.7, 118.4, 115.1, 113.8, 45.1, 41.2, 34.1. HRMS (ESI) m/z: найдено М 438.2172; рассчитано для C₂₈H₂₈N₃O₂⁺, [M + H]⁺ 438.2176.

5-((Z)-2-(Диметиламино)бензилиден)-3-бензил- 2-((E)-4-гидроксистирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIc). Красный порошок (233 мг, 55%); т. пл. ~200°C с разложением. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 10.04 (с, 1H), 8.75 (дд, J 7.7, 1.7, 1H), 7.89 (д, J 15.7, 1H), 7.61 (д, J 8.8, 2H), 7.38–7.33 (м, 4H), 7.31 (д, J 6.8, 2H), 7.27 (т, J 7.3, 1H), 7.16–7.11 (м, 2H), 6.96 (д, J 15.6, 1H), 6.82 (д, J 8.7, 2H), 5.05 (с, 2H), 2.75 (с, 6H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 170.4, 159.9, 159.8, 154.8, 140.6, 138.3, 137.4, 132.9, 130.7, 130.4, 128.7, 127.5, 127.3, 126.9, 126.2, 122.3, 121.1, 118.4, 115.9, 110.0, 45.1, 42.5. HRMS (ESI) m/z: найдено М 424.2016; рассчитано для C₂₇H₂₆N₃O₂⁺, [M + H]⁺ 424.2020.

5-((Z)-2-Метоксибензилиден)-3-бензил-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IId). Оранжевый порошок (183 мг, 47%); т. пл. 196–198°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.91 (дд, J 7.8, 1.8, 1H), 7.99 (д, J 15.8, 1H), 7.77 (д, J 6.5, 2H), 7.48 (с, 1H), 7.46–7.41 (м, 4H), 7.36–7.34 (м, 2H), 7.30 (д, J 7.1, 2H), 7.26 (т, J 7.2, 1H), 7.21 (д, J 15.8, 1H), 7.13–7.09 (м, 2H), 5.08 (с, 2H), 3.92 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 170.1, 159.8, 158.7, 140.5, 138.6, 137.3, 134.9, 132.5, 132.1, 130.3, 129.0, 128.8, 128.3, 127.5, 126.9, 122.7, 120.9, 118.7, 113.8, 111.3, 55.8, 42.6. HRMS (ESI) m/z: найдено М 395.1757; рассчитано для C₂₆H₂₃N₂O₂⁺, [M + H]⁺ 395.1754.

5-((Z)-2-Метоксибензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIe). Оранжевый порошок (209 мг, 49%); т. пл. 153–155°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 9.12 (с, 1H), 8.88 (дд, J 7.7, 1.9, 1H), 7.90 (д, J 15.7, 1H), 7.76 (д, J 7.2, 2H), 7.48–7.41 (м, 4H), 7.37 (с, 1H), 7.11–7.07 (м, 2H), 7.00 (д, J 8.6, 2H), 6.92 (д, J 15.6, 1H), 6.63 (д, J 8.5, 2H), 3.98 (т, J 7.0, 2H), 3.91 (с, 3H), 2.77 (т, J 7.1, 2H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.9, 160.1, 158.5, 156.0, 140.0, 138.7, 135.0, 132.4, 131.9, 130.1, 129.9, 128.9, 128.4, 128.0, 122.8, 120.8, 117.8, 115.2, 113.7, 111.2, 55.8, 41.2, 34.1. HRMS (ESI) m/z: найдено М 425.1859; рассчитано для C₂₇H₂₅N₂O₃⁺, [M + H]⁺ 425.1860.

5-((Z)-2-Метоксибензилиден)-3-бензил-2-((E)-4-гидроксистирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIf). Красный порошок (98 мг, 24%); т. пл. ~230°C с разложением. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.91 (дд, J 8.2, 1.7, 1H), 7.91 (д, J 15.5, 1H), 7.58 (д, J 8.8, 2H), 7.41 (тд, J 8.1, 1.8, 1H), 7.38 (с, 1H), 7.35 (т, J 7.6, 2H), 7.29 (д, J 7.0, 2H), 7.26 (т, J 7.3, 1H), 7.09 (д, J 8.0, 2H), 6.89 (д, J 15.6, 1H), 6.77 (д, J 8.7, 2H), 5.04 (с, 2H), 3.91 (с, 3H). ¹³C-ЯМР (176 МГц, DMSO-d₆): 170.2, 160.3, 158.4 (2C), 141.2, 138.8, 137.3, 132.3, 131.6, 130.5 (2C), 128.7, 127.4, 126.9, 123.0, 120.8, 116.9, 116.3, 111.2 (2C), 55.8, 42.5. HRMS (ESI) m/z: найдено М 411.1708; рассчитано для C₂₆H₂₃N₂O₃⁺, [M + H]⁺ 411.1703.

5-((Z)-2-Гидроксибензилиден)-3-бензил-2-((E)-стирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIg). Красный порошок (167 мг, 44%); т. пл. 148–150°C. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 11.54 (с, 1H), 8.43 (дд, J 8.2, 1.9, 1H), 7.90 (д, J 15.8, 1H), 7.77 (д, J 6.4, 2H), 7.47–7.42 (м, 4H), 7.37–7.34 (м, 2H), 7.33–7.30 (м, 3H), 7.27 (т, J 7.2, 1H), 7.24 (д, J 15.8, 1H), 6.94 (д, J 8.1, 2H), 5.10 (с, 2H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.2, 157.9 (2C), 140.5, 137.2, 136.4, 134.8, 133.8, 132.7, 130.4, 129.0, 128.8, 128.4, 127.5, 126.9, 122.6, 121.0, 119.6, 116.6, 113.5, 42.7. HRMS (ESI) m/z: найдено М 381.1599; рассчитано для C₂₅H₂₁N₂O₂⁺, [M + H]⁺ 381.1598.

5-((Z)-2-Гидроксибензилиден)-3-бензил-2-((E)-4-гидроксистирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIh). Красный порошок (218 мг, 55%); т. пл. ~200°C с разложением. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 8.29 (д, J 7.6, 1H), 7.79 (д, J 15.4, 1H), 7.58 (д, J 8.6, 2H), 7.35 (т, J 7.6, 2H), 7.25–7.32 (м, 5H), 6.86–6.93 (м, 3H), 6.78 (д, J 8.6, 2H), 5.06 (с, 2H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 169.1, 161.6, 158.6, 158.0, 141.1, 137.3, 136.1, 133.7, 132.4, 130.6, 128.7, 127.5, 126.9, 125.1, 121.8, 121.2, 119.0, 117.0, 116.3, 108.5, 42.6. HRMS (ESI) m/z: найдено М 397.1552; рассчитано для C₂₅H₂₁N₂O₃⁺, [M + H]⁺ 397.1547.

5-((Z)-2-Гидроксибензилиден)-3-(4-гидроксифенэтил)-2-((E)-4-гидроксистирил)-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (IIi). Красный порошок (350 мг, 83%); т. пл. ~210°C с разложением. ¹H-ЯМР (700 МГц, DMSO-d₆): 12.11 (с, 1H), 10.07 (с, 1H), 9.13 (с, 1H), 8.18 (д, J 8.0, 1H), 7.70 (д, J 15.6, 1H), 7.61 (д, J 8.8, 2H), 7.29 (т, J 6.8, 1H), 7.20 (с, 1H), 7.01 (д, J 8.5, 2H), 6.92–6.87 (м, 2H), 6.85 (д, J 8.7, 2H), 6.70 (д, J 15.6, 1H), 6.63 (д, J 8.5, 2H), 3.98 (т, J 7.1, 2H), 2.77 (т, J 7.0, 2H). ¹³C-ЯМР (75 МГц, DMSO-d₆): 168.6, 160.0, 158.0, 157.6, 156.0, 140.7, 136.0, 134.2, 132.5, 130.5, 129.9, 128.0, 126.0, 121.9, 121.0, 119.5, 117.0, 115.9, 115.2, 109.3, 41.4, 34.0. HRMS (ESI) m/z: найдено М 427.1646; рассчитано для C₂₆H₂₃N₂O₄⁺, [M + H]⁺ 427.1652.

Выделение и очистка белка NanoLuc. Препарат выделенного белка NanoLuc получали согласно описанной ранее методике [12].

Регистрация спектров флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции определяли как отношение интенсивности флуоресценции раствора хромофора в смеси с раствором белка к интенсивности флуоресценции раствора хромофора. Растворы соединений (I) и (II) в фосфатном буфере смешивали с раствором белка NanoLuc и через 15 мин регистрировали спектры флуоресценции. Конечная концентрация соединений (I) и (II) составляла 1 мкМ, белка NanoLuc – 10 мкМ. Величину K_d определяли спектрофлуориметрическим титрованием раствора белка NanoLuc растворами хромофора с различной концентрацией. Концентрация белка NanoLuc составляла 0.1 мкМ.

Получение ДНК-конструкций. Кодирующая последовательность NanoLuc была синтезирована фирмой Клонинг Фасилити (Россия) и получена в плазмиде Level 0, созданной для клонирования MoClo. Для локализации в клеточном ядре последовательность, кодирующую NanoLuc [13], сливали с последовательностью белка-гистона H2B (UniProt ID: P06899), используя технологию Golden Gate согласно синтаксису MoClo. Конструкт был помещен между CMV-промотором и последовательностью SV40 poly(A). Для клонирования использовали эндонуклеазу рестрикции Eco31I (BsaI) (Thermo Scientific, США) и T4 ДНК-лигазу (Евроген, Россия). Правильность полученных конструкций была подтверждена секвенированием по Сэнгеру (Евроген, Россия).

Поддержание и трансфекция клеточной культуры HEK293. Клеточная культура эмбриональных почек человека HEK293 была получена из коллекции клеточных линий ИБХ РАН, отдел биофотоники. Клетки культивировали в среде DМЕМ (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ПанЭко, Россия) и смеси антибиотиков пенициллина (50 ед./мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) (ПанЭко, Россия), DМЕМ с данными добавками далее именуется полной DМЕМ. Для культивирования использовали CO₂-инкубатор (Sanyo, Япония) при 5% CO₂, 37°С. Перед трансфекцией клетки высевали на культуральные чашки диаметром 35 мм со стеклянным дном (SPL Life Sciences, Корея). Трансфекцию проводили при помощи полиэтиленимина (PEI; Polysciences, США). За 1 ч до начала трансфекции культуральную среду заменяли на 500 мкл Opti-MEM (ПанЭко, Россия). Далее в расчете на одну культуральную чашку смешивали 6 мкл PEI с 250 мкл Opti-MEM, 2 мкг плазмидной ДНК также смешивали с 250 мкл Opti-MEM в отдельном эппендорфе, инкубировали в течение 5 мин и смешивали два полученных раствора, после чего смесь инкубировали еще 20 мин и по каплям добавляли в культуральные чашки. Клетки инкубировали в присутствии смеси PEI–ДНК в течение 3 ч, затем заменяли среду на полную DМЕМ.

Микроскопия. Через 48 ч после трансфекции полную DМЕМ заменяли на среду для визуализации, состоящую из раствора Хэнкса (ПанЭко, Россия) с добавлением 20 мМ HEPES (Sigma, Германия) и 5 мкМ соединения (IIc) (разведено из 20 мМ стокового раствора в DМSО (Sigma-Aldrich, США)), и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Микроскопию проводили при помощи инвертированного микроскопа BZ-9000 (Япония, Keyence), оснащенного масляным объективом 60× PlanApo 1.40 NA (США, Nikon) и кубом TxRed, длины волн возбуждающего света 560/40, фильтр 594, длины волн детектируемого света 630/60. Полученные изображения обрабатывали в программе Fiji (https://fiji.sc/), в которой с помощью плагина “background subtraction from ROI” из изображения вычитали фоновые значения интенсивности флуоресценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был синтезирован ряд арилиден-имидазолонов – производных хромофоров белка GFP и Kaede, содержащих орто-заместители в арилиденовом фрагменте. Было установлено, что соединения (IIc) и (IIf) способны связываться с белком NanoLuc и формировать флуоресцентные комплексы. Показано, что соединение (IIc), содержащее диметиламинный заместитель в бензилиденовом фрагменте и гидроксигруппу в стирольном фрагменте, можно применять для флуорогенного мечения белка NanoLuc. В паре соединение (IIc) и белок NanoLuc могут быть использованы в качестве генетически-кодируемой флуоресцентной метки для окрашивания живых клеток, что было продемонстрировано на примере окрашивания клеток HEK293.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-73-10195).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей и использованием животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

E. Zaitseva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: nsbaleeva@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; ul. Ostrovitianova 1, Moscow, 117997

Yu. Bogdanova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: nsbaleeva@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

N. Baleeva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: nsbaleeva@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. Smirnov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: nsbaleeva@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; ul. Ostrovitianova 1, Moscow, 117997

M. Baranov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: nsbaleeva@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; ul. Ostrovitianova 1, Moscow, 117997

参考

补充文件