Применение бимолекулярной флуоресцентной комплементации для визуализации гистоновых модификаций в живых клетках

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Эпигенетические модификации гистонов в составе хроматина в клетках человека, животных и других эукариотических организмов играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов. Гистоны могут подвергаться разнообразным посттрансляционным модификациям в различных комбинациях (включая метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и др.) по различным аминокислотным остаткам, что определяет функциональное состояние данного локуса хроматина. Изменение эпигенетических модификаций сопровождает все нормальные и патологические клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, раковую трансформацию и др. На сегодняшний день особенно актуальны разработка и применение новых методов анализа эпигенома на уровне единичных клеток, в том числе живых клеток. В данной работе были получены новые сенсорные системы для визуализации эпигенетических модификаций H3K9me3 (триметилированный Lys9), H3K9ac (ацетилированный Lys9) и пространственного сближения H3K9me3 c H3K9ac, основанные на флуорогенных красителях. Для создания сенсоров были использованы последовательности белка splitFAST, а также природные ридерные белковые домены MPP8 и AF9. Добавление в клеточную среду флуорогенов HMBR и N871b позволило детектировать ясно различимые паттерны флуоресценции в зеленом и красном каналах соответственно. Нами также был проведен обсчет полученных флуоресцентных изображений с помощью компьютерного метода анализа LiveMIEL (Live-cell Microscopic Imaging of Epigenetic Landscape). Кластеризация полученных данных показала хорошее согласование с предполагаемыми метками классов, соответствующих представленности H3K9me3, H3K9ac и пространственному сближению H3K9me3 и H3K9ac в ядре. Разработанные сенсоры могут быть эффективно использованы для изучения гистоновых модификаций в различных клеточных процессах, а также в исследовании механизмов развития заболеваний.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. И. Степанов

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Л. В. Путляева

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

А. А. Шуваева

Московский физико-технический институт

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

М. А. Андрушкин

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

М. С. Баранов

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Н. Г. Гурская

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва; Москва

К. А. Лукьянов

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Millán-Zambrano G., Burton A., Bannister A.J., Schneider R. // Nat. Rev. Genet. 2022. V. 23. P. 563– 580. https://doi.org/10.1038/s41576-022-00468-7
  2. Yun M., Wu J., Workman J.L., Li B. // Cell Res. 2011. V. 21. P. 564–578. https://doi.org/10.1038/cr.2011.42
  3. Kungulovski G., Kycia I., Tamas R., Jurkowska R.Z., Kudithipudi S., Henry C., Reinhardt R., Labhart P., Jeltsch A. // Genome Res. 2014. V. 24. P. 1842–1853. https://doi.org/10.1101/gr.170985.113
  4. Mauser R., Kungulovski G., Keup C., Reinhardt R., Jeltsch A. // Epigenetics Chromatin. 2017. V. 10. P. 45. https://doi.org/10.1186/s13072-017-0153-1
  5. Delachat A.M.-F., Guidotti N., Bachmann A.L., Meireles-Filho A.C.A., Pick H., Lechner C.C., Deluz C., Deplancke B., Suter D.M., Fierz B. // Cell Chem. Biol. 2018. V. 25. P. 51–56.e6. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.10.008
  6. Villaseñor R., Pfaendler R., Ambrosi C., Butz S., Giuliani S., Bryan E., Sheahan T.W., Hélène D. // Nat. Biotechnol. 2020. V. 38. P. 728–736. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0434-2
  7. Stepanov A.I., Shuvaeva A.A., Putlyaeva L.V., Lukyanov D.K., Galiakberova A.A., Gorbachev D.A., Maltsev D.I., Pronina V., Dylov D.V., Terskikh A.V., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G. // Cell Mol. Life Sci. 2024. V. 81. P. 381. https://doi.org/10.1007/s00018-024-05359-0
  8. Müller I., Moroni A.S., Shlyueva D., Sahadevan S., Schoof E.M., Radzisheuskaya A., Højfeldt J.W., Pedersen D.S., Trifonov M., Mikkelsen J.G. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 3034. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23308-4
  9. Ng A.H.M., Khoshakhlagh P., Rojo Arias J.E., Pasquini G., Wang K., Swiersy A., Shipman S.L., Tian C., Miller D.M. // Nat. Biotechnol. 2021. V. 39. P. 510–519. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0742-6
  10. Tebo A.G., Gautier A. // Nat. Commun. 2019. V. 10. P. 2822. https://doi.org/10.1038/s41467-019-10855-0
  11. Plamont M.-A., Billon-Denis E., Maurin S., Gauron C., Pimenta F.M., Specht C.G., Shi J., Lamberti A., Carlier A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. P. 497–502. https://doi.org/10.1073/pnas.1513094113
  12. Povarova N.V., Zaitseva S.O., Baleeva N.S., Smirnov A.Y., Myasnyanko I.N., Zagudaylova M.B., Bozhanova N.G., Yegorov A.Y., Mikhaylov A.D. // Chemistry. 2019. V. 25. P. 9592–9596. https://doi.org/10.1002/chem.201901151
  13. Benaissa H., Ounoughi K., Aujard I., Fischer E., Goïame R., Nguyen J., Tebo A.G., Pimentel C., Nicolas C. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 6989. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27334-0
  14. Padeken J., Methot S.P., Gasser S.M. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022. V. 23. P. 623–640. https://doi.org/10.1038/s41580-022-00483-w
  15. Gates L.A., Shi J., Rohira A.D., Feng Q., Zhu B., Bedford M.T., Sagum C.A., Hewitt M.J., Cai Z. // J. Biol. Chem. 2017. V. 292. P. 14456–14472. https://doi.org/10.1074/jbc.m117.802074
  16. Kokura K., Sun L., Bedford M.T., Fang J. // EMBO J. 2010. V. 29. P. 3673–3687. https://doi.org/10.1038/emboj.2010.239
  17. Li Y., Wen H., Xi Y., Tanaka K., Wang H., Peng D., Ren Y., Li Z., Liu C. // Cell. 2014. V. 159. P. 558–571. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.049
  18. Stepanov A.I., Besedovskaia Z.V., Moshareva M.A., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 8988. https://doi.org/10.3390/ijms23168988
  19. Stepanov A.I., Zhurlova P.A., Shuvaeva A.A., Sokolinskaya E.L., Gurskaya N.G., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2023. V. 687. P. 149174. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.149174
  20. Pedregosa F., Varoquaux G., Gramfort A., Michel V., Thirion B., Grisel O., Blondel M., Linh H., Poggio T. // J. Machine Learning Res. 2012. V. 12. P. 2825–2830. https://doi.org/10.48550/arXiv.1201.0490

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, трансфицированных сенсорами MPP8-FAST-NLS-MPP8 и AF9-FAST-NLS-AF9 (NLS для удобства убран из надписей на рисунках). Флуороген – HMBR.

Скачать (74KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (а) – Список созданных плазмид, разбитый по группам. Звездочка указывает на внесение мутаций MPP8 W80A и AF9 Y78A в соответствующие последовательности ДНК; (б) – флуоресцентная микроскопия котрансфицированных различными вариантами плазмид в клетки НЕК293T. Флуороген – HMBR; (в) – флуоресцентная микроскопия котрансфицированных плазмид в клетках НЕК293T в двух каналах, над изображениями указаны использованные флуорогены; NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (196KB)
Метаданные
4. Рис. 3. (а) – Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, экспрессирующих MPP8-FAST-NLS-AF9. Флуороген – HMBR; (б) – флуоресцентная микроскопия клеток HEK293Т, экспрессирующих различные комбинации плазмид системы splitFAST. Флуороген – HMBR. Звездочка указывает на то, что домены имеют мутацию MPP8 W80A и AF9 Y78A; (в) – флуоресцентная микроскопия HEK293 AF9-NFAST-NLS и MPP8-CFAST11-NLS в двух каналах, над изображениями указаны использованные флуорогены. NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (199KB)
Метаданные
5. Рис. 4. (а) – Анализ эпигенетических модификаций H3K9me3, H3K9ac и H3K9me3-H3K9ac методом LiveMIEL. Сегментированные ядра клеток HEK293T, экспрессирующие MPP8-NFAST + MPP8-CFAST11, AF9-NFAST + AF9-CFAST11 и AF9-NFAST + MPP8-CFAST11; (б) – анализ текстурных особенностей, извлеченных из одиночных изображений ядер, методом главных компонент (PCA) (значения признаков были усреднены по n = 40 ядер); (в) – значения коэффициента силуэта si для EM-кластеризации данных PCA (n = 3). Красная линия соответствует среднему значению коэффициента силуэта s = 0.31 в наборе данных; (г) – визуализация кластеризации EM для n = 3 кластеров. Точки представляют текстурные особенности, полученные на основе изображений, визуализирующих представленность H3K9me3, H3K9ac и H3K9me3-H3K9ac в ядрах. NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (175KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».