Изоформы цитоскелетного белка зиксина в раннем эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Полный текст

Сокращения: LIM – от первых букв названий трех белков, у которых был впервые описан данный домен: LIN-11, Isl-1 и MEC-3; NES – сигнал ядерного транспорта (nuclear export signal).

ВВЕДЕНИЕ

Изучение функционирования высококонсервативных механочувствительных белков, к которым относится зиксин, представляет большой интерес, потому что форма эмбрионов всех животных в период развития создается организованной работой морфогенетических процессов, таких как растяжение, изгибание или сворачивание эмбриональных клеточных пластов, и строго контролируемым переходом клеток к дифференцированному статусу. Консерватизм ранних этапов эмбриогенеза у позвоночных позволяет использовать животных, развитие которых протекает во внешней среде (эмбрионы Xenopus laevis, рыбки Danio rerio), в качестве модельных организмов, поэтому исследования с использованием этих моделей имеют не только фундаментальную ценность, но и могут быть полезны в медицинских исследованиях.

Молекула белка зиксина X. laevis состоит из 664 а.о. и содержит три консервативных для всех позвоночных региона: пролин-богатую N-концевую область, лейцин-богатый сигнал экспорта из ядра (NES – nuclear export signal) и С-концевой фрагмент с тремя LIM-доменами (рис. 1а) [1].

 

Рис. 1. Схемы доменной и пространственной организации молекулы зиксина и делеционных конструкций, использованных в работе: (а) – схема доменной структуры полноразмерной молекулы зиксина, сверху обозначены номера аминокислотных остатков для всех представленных на рисунке доменов зиксина: P-домен 120–147 а.о. (пролин-богатый домен), протеолиз 334–340 а.о. (сайт возможного протеолитического расщепления), NES 438–458 а.о. (сигнал экспорта из ядра) и LIM-доменная область 469–659 а.о.; (б) – схема “закрытой” конформации молекулы зиксина; (в) – пространственная трехмерная структура зиксина, полученная по данным базы PhosphoSitePlus^® (https://www.phosphosite.org); (г) – схема С-концевого делеционного мутанта, использованного для получения антител к С-зиксину; (д) – схема N-концевого делеционного мутанта, использованного для получения антител к N-зиксину; (е) – схема укороченного по сайту протеолиза делеционного мутанта зиксина (∆зиксина).

 

N-конец зиксина необходим для взаимодействия с белками цитоскелета, прежде всего с белком, сшивающим актиновые филаменты α-актинина [2, 3], модулятором сборки актина Ena/VASP [4], цитоскелетными белками LASP-1 и LASP-2 [2]. Пролин-богатые повторы в зиксине похожи на пролин-богатые последовательности в белке ActA внутриклеточной бактерии Listeria monocytogenes [5], патогенность которой обусловлена способностью собирать актиновые филаменты на поверхности клетки. Белок ActA притягивает белки клеточных контактов Ena/VASP на место сборки актина [6]. Благодаря наличию пролин-богатых повторов зиксин, так же как и ActA, является посредником в соединении членов семейства Ena/VASP с актином и участвует в изменениях актинового цитоскелета в эукариотических клетках [7].

NES – лейцин-богатые области, которые участвуют в связывании зиксина с белком CRM1 для выхода из клеточного ядра в цитоплазму [5, 8].

C-концевой участок зиксина содержит три LIM-домена. LIM-домен – это Cys- и His-богатая последовательность длиной 60 а.о. Каждый LIMдомен имеет структуру двух цинковых пальцев. LIM-домены опосредуют специфические взаимодействия белок–белок и белок–ДНК [9]. В работе по участию LIM-доменных белков в механотрансдукции показано, что зиксин связывается своей LIM-доменной областью с F-актином в условиях напряжения и распределяется вдоль стресс-фибрилл [10]. Интересно, что свободная молекула зиксина в цитоплазме имеет “закрытую” конформацию “голова к хвосту”, которая должна быть фосфорилирована по Ser142 с помощью Act2-киназы [11, 12], ацетилирована [13, 14] или пальмитилирована [15], чтобы позволить зиксину образовывать комплексы с другими белками (рис. 1б). LIM-домены “открытого” зиксина представляют собой платформу для сборки различных белковых комплексов, прежде всего, ансамбля регуляторов транскрипции [16].

Недавно была опубликована работа по изучению пептидного репертуара в экссудатах ран у млекопитающих [17]. Среди идентифицированных белковых последовательностей были обнаружены два укороченных фрагмента зиксина. Показано, что этот белок подвержен протеолизу по сайту серинпептидазы 1 HtrA с образованием легкой формы 254–572 а.о., которая способна перемещаться в ядро и принимает участие в активации ряда транскрипционных регуляторов, участвующих в повышении адаптационных свойств в раневой поверхности. Имеются данные о том, что этот укороченный зиксин продуцируется при высокой плотности клеток и может регулировать количество связанных с раной белков во время заживления кожных ран [17]. Известно также, что синтезированный в условиях бесклеточного синтеза зиксин может быть субстратом для расщепления каспазами in vitro при инкубации в бесклеточном апоптотическом лизате S100 и in vitro в лизате клеточной линии HEK293 с активированной апоптотической активностью [18].

Примечательно, что на фоне довольно интенсивного изучения функций зиксина в культуре клеток работ, в которых бы исследовались аналогичные функции зиксина в эмбриогенезе, немного. Наиболее интересная работа посвящена изучению роли зиксина в стабилизации синаптических контактов во время развития синапсов в механосенсорных нейронах у круглого червя Caenorhaditis elegans. Зиксин из C. elegans, как и гомолог позвоночных, содержит N-концевую область, богатую пролином, и три тандемно расположенных С-концевых LIM-домена. В этой работе неожиданно было показано, что нейронная функция зиксина опосредуется короткой С-концевой изоформой, содержащей только LIM-домены, т.е. эта изоформа работает как полнофункциональный белок, способный к трансдукции механических реакций совершенно независимо от N-концевого домена [19].

Основной задачей данного исследования было выявление эндогенных изоформ зиксина из X. laevis и получение информации об изменениях в их количестве и внутриклеточной локализации, которые могут происходить с этими изоформами в ходе эмбрионального развития.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основной инструмент для детекции эндогенных белков – специфические антитела. Для проведения исследования нами были использованы поликлональные антитела, специфичные к C-концевой области зиксина, содержащей последовательность ядерного экспорта NES и три LIM-домена (438–663 а.о.), полученные нами ранее [1] (рис. 1г). Эти антитела имеют недостаток – они детектируют только LIM-доменную область зиксина и, соответственно, не могут детектировать его N-концевые укороченные изоформы. Поэтому мы получили поликлональные антитела к N-концевой пролин-богатой области зиксина (1–373 а.о.), которая участвует во взаимодействии с актинином и другими цитоскелетными белками (рис. 1а, схема полноразмерного белка зиксина).

Таким образом, в нашем распоряжении были антитела, которые специфично детектировали С-концевой и N-концевой фрагменты зиксина.

Зародыши X. laevis получали по стандартной отработанной схеме [20]. Зародыши собирали на стадиях от начала дробления (32 бластомера), стадии гаструлы (11-я стадия) до стадии подвижного головастика (26-я стадия) по 20 эмбрионов на стадию и проводили разделение на ядерную и цитоплазматическую фракции для каждой стадии по методике, опубликованной ранее [21]. Из полученных ядерных и цитоплазматических фракций готовили образцы для анализа методом вестерн-блоттинга после разделения в 10%-ном ПААГ по Лэммли. Изоформы зиксина детектировали с использованием поликлональных антител к N- и С-зиксину, в качестве вторичных антител использовали антикроличьи антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой.

В результате применения антител, специфичных к различным доменам белка зиксина, нам удалось детектировать его изоформы, укороченные с N- и С-концов, проследить их распределение между ядром и цитоплазмой, а также выявить изменения, происходящие с этими изоформами в ходе развития эмбриона. Прежде всего с использованием имеющихся антител были выявлены полноразмерные формы зиксина с молекулярной массой 105 и 70 кДа, которые детектировались антителами как к N-, так и к С-доменам (рис. 2а). Поскольку расчетная молекулярная масса немодифицированного белка без посттрансляционных модификаций составляет ~70 кДа, то полноразмерный зиксин c массой 105 кДа представляет собой модифицированную изоформу.

 

Рис. 2. Изоформы зиксина, их стабильность и распределение между ядром и цитоплазмой: (а) – изоформы зиксина, детектируемые антителами к С-зиксину и антителами к N-зиксину в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток эмбрионов на 11-й стадии; (б) – изменения количества укороченных форм зиксина в ходе развития, детекция антителами к С-зиксину и антителами к N-зиксину, в качестве референсной полосы использовали α-тубулин; (в) –электрофоретическая подвижность укороченного мутанта ∆зиксина (334– 664 а.о.) совпадает с эндогенной изоформой С-зиксина 37 кДа, детекция антителами к С-зиксину.

 

Наиболее изученная модификация зиксина млекопитающих – фосфорилирование по аминокислотному остатку Ser 142 [11, 12], кроме этого остатка в молекуле зиксина имеется еще 35 потенциальных участков фосфорилирования (по данным базы PhosphoSitePlus^®, https://www. phosphosite.org). Поскольку известно, что фосфорилирование сильно замедляет электрофоретическую подвижность белков [22], наиболее вероятная модификация полноразмерной формы – именно фосфорилирование. Есть также работы, в которых показана возможность обратимых модификаций полноразмерного зиксина, таких как пальмитилирование и ацетилирование [13–15]. Возможно, сразу несколько модификаций приводит к замедлению электрофоретической подвижности полноразмерного зиксина.

В результате разделения лизатов из клеток зародышей на ядерную и цитоплазматическую фракции нам удалось показать, что у X. laevis модифицированная и немодифицированная формы полноразмерного зиксина имеют различия во внутриклеточной локализации: в цитоплазматической фракции преобладает форма 105 кДа, а в ядерной – 70 кДа (рис. 2а); в ходе развития уровень этих форм существенно не изменяется. При понижении уровня экспрессии зиксина за счет подавления трансляции его мРНК морфолиновыми олигонуклеотидами мы наблюдали уменьшение интенсивности обеих полос в вестерн-блот-анализе лизатов из зародышей на 13-й стадии с использованием антител к С-зиксину (данные не приведены).

При вестерн-блот-анализе лизатов из зародышей на ранних стадиях развития (начиная с 32-клеточного зародыша) мы заметили, что антитела к разным доменам зиксина детектируют более легкие полосы с разной электрофоретической подвижностью. Так, при использовании антител к С-зиксину детектируется полоса с подвижностью в области 37 кДа, а при использовании антител к N-зиксину – полоса в области 45 кДа (рис. 2б).

При этом следует отметить, что перекрестное окрашивание полностью отсутствует, антитела к разным доменам детектируют строго определенные полосы, т.е. можно сказать, что нам удалось “увидеть” две половины молекулы зиксина, которые, вероятнее всего, появились в результате протеолитического расщепления. Наиболее интенсивной полосой, соответствующей укороченному зиксину, была полоса 37 кДа, которая детектировалась антителами к С-зиксину как в ядерной, так и в цитоплазматической фракции на ранних стадиях, но уже начиная со стадии гаструлы ее интенсивность в цитоплазме резко падала и в ходе дальнейшего развития исчезала, тогда как в ядре она оставалась хорошо детектируемой до стадии подвижного головастика (26-я стадия) (рис. 2б). Поскольку эта полоса окрашивается только антителами к С-зиксину, можно предположить, что это С-концевая, LIM-доменная часть молекулы зиксина, укороченная с N-конца (С-зиксин).

При использовании антител к N-зиксину для детекции в образцах из лизата зародышей на ранних стадиях (32 бластомера) мы наблюдали полосу 45 кДа в ядерной и цитоплазматической фракциях. Эта полоса имеет значительно меньшую интенсивность по сравнению с полосой 37 кДа; в ходе развития полоса сильно ослабевает и к 26-й стадии детектируется очень слабо, особенно в ядре (рис. 2б). При этом полосы 105 и 70 кДа не меняют своей интенсивности в зависимости от стадии. Полоса 45 кДа окрашивается только при использовании антител к N-зиксину и совсем не детектируется антителами к С-зиксину, поэтому можно предположить, что это укороченная с С-конца изоформа (N-зиксин). Во всех экспериментах нормирование количества нанесенного образца проводили по полосе тубулина с использованием моноклональных антител к тубулину (Sigma, США).

Таким образом, нам удалось детектировать две стабильные ядерные изоформы зиксина: полноразмерную немодифицированную (70 кДа) и LIM-доменную С-концевую укороченную изоформу (37 кДа). В небольшом количестве в ядре наблюдается и изоформа 105 кДа, которая слабо детектируется антителами к N-зиксину, что может быть связано с модификациями N-области этой изоформы. Изоформа 105 кДа – мажорная и самая стабильная в цитоплазматической фракции, детектируется двумя типами антител. Изоформа с электрофоретической подвижностью ~45 кДа, которая детектируется антителами к N-зиксину, показала низкую стабильность и хорошо заметна только до стадии гаструлы.

Полученные в работе данные о наличии укороченных форм зиксина в зародышах X. laevis коррелируют с данными работы Sabino et al. [17] об обнаружении укороченных С-концевых форм зиксина при исследовании пептидного репертуара в экссудатах ран млекопитающих. Указанный в этой работе сайт протеолитического расщепления серинпептидазой 1 HtrA совпадает с участком 332–338 а.о. для X. laevis, имеет высококонсервативную последовательность аминокислот APGF/GSF/G в районе 332–338 а.о. При анализе пространственной структуры зиксина из X. laevis видна структурная петля, которая находится в наружной части молекулы и доступна для протеолиза, а LIM-доменная область расположена в центре молекулы и имеет компактную третичную структуру из чередующихся спиралей и структур типа цинковые пальцы (рис. 1в).

Для того чтобы подтвердить, что протеолиз проходит именно по этому участку, мы создали делеционный мутант ∆зиксин (334–664 а.о.) (рис. 1е) и показали, что его электрофоретическая подвижность полностью совпадает с подвижностью эндогенного фрагмента 37 кДа, но экзогенный фрагмент локали-зуется преимущественно в цитоплазме (рис. 2в), тогда как по результатам многих экспериментов большая часть эндогенного зиксина 37 кДа детектируется в ядерной фракции.

Кроме этого, с использованием специфических антител мы показали, что N-концевой фрагмент зиксина также присутствует в ядре. Это интересный и новый результат, поскольку известно, что N-концевая область взаимодействует с белками цитоскелета – последовательность 16– 36 а.о. является сайтом для связывания α-актинина. Поэтому можно было бы предложить гипотезу, что биологическая функция протеолиза молекулы зиксина заключается в диссоциации его LIM-доменной области от области, связанной с белками цитоскелета, и ее транслокации в ядро, где появляется возможность для взаимодействия с регуляторными факторами транскрипции.

Но по результатам наших исследований N-концевой фрагмент зиксина с массой 45 кДа присутствует в ядре на ранних стадиях развития. Данных о функции N-концевого фрагмента в ядре пока нет в мировой литературе. Считается, что эта область отвечает за взаимодействие с белками цитоскелета, поэтому феномен появления N-концевого фрагмента в ядре на стадиях начала дробления заслуживает дальнейшего изучения.

Не менее интересным и важным для дальнейших исследований представляется обнаружение эндогенного С-концевого, содержащего LIM-домен фрагмента зиксина с массой 37 кДа и его ядерной локализации. Ранее с использованием модели эмбрионов X. laevis мы показали, что в эмбриогенезе именно за счет своей LIM-доменной области зиксин выполняет важные для развития функции: 1) модулирует активность регулятора передних отделов мозга, транскрипционного фактора Xanf1 [23, 24]; 2) регулирует активность сигнальных путей SHH (sonic hedgehog) [25]; 3) оказывает влияние на стабильность мРНК маркеров плюрипотентности семейства Pou 5F3, гомологов известного фактора стволовых клеток Oct 4 и рецептора ретиноидов Rxrg [26, 27]. Во всех работах с использованием методов двугибридной дрожжевой системы и коиммунопреципитации мы доказали, что транскрипциoнные факторы, такие как Xanf1, Gli1, Zic1 и Ybx1, взаимодействуют именно с LIMдоменной областью, причем для всех приведенных белков было показано, что взаимодействие с полноразмерным зиксином значительно слабее, чем взаимодействие с его LIM-доменным фрагментом. Для коиммунопреципитации мы использовали экзогенный С-концевой фрагмент, несущий пептидные метки для возможности соосаждения белковых комплексов с применением смол с иммобилизованными коммерческими антителами. Экспрессия меченых пептидами белков в клетках эмбрионов достигается за счет микроинъекций синтетических мРНК в зародыши на стадии первого деления, и количество таких экзогенных белков превышает уровень эндогенных. Поэтому ослабление связывания исследуемых факторов с эндогенным полноразмерным зиксином не вызывало у нас сомнений. Идентификация укороченного эндогенного С-концевого фрагмента, содержащего LIM-домены, ставит вопрос о том, какая (полноразмерная или укороченная) изоформа зиксина участвует во взаимодействии с найденными ранее партнерами – транскрипционными факторами, и может ли укороченная изоформа модулировать активность соответствующих сигнальных каскадов.

Поскольку в настоящей работе мы получили уникальные данные о внутриклеточном распределении модифицированной и немодифицированной полноразмерной форм зиксина, а также об укороченных изоформах зиксина X. laevis, необходимо дальнейшее изучение возникновения и возможного влияния этих изоформ на генную экспрессию в процессе эмбриогенеза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение моноспецифичных антител к N- и C-фрагментам зиксина. Антитела к С-концевому фрагменту зиксина были получены нами ранее по методике, представленной в работе Martynova et al. [1].

Антисыворотка против N-концевого фрагмента зиксина (UniProt: A5H447) наработана в результате иммунизации кролика укороченным белком, содержащим 1–373 а.о. Соответствующую вставку кДНК клонировали в вектор pQE80 (Qiagen, США) и экспрессировали гибридный белок, несущий шесть остатков His и Myc-пептид на N-конце, в Escherichia coli DH-5α. Для иммунизации экспрессированный в бактериальной системе белок очищали с помощью Ni-NTA-хроматографии и детектировали количество и степень очистки при помощи иммуноблоттинга с антителами к 6His и Myc-пептиду, конъюгированными с щелочной фосфатазой.

Иммунизацию кролика (здоровая самка, 1 год, вес 1.8 кг, Питомник лабораторных животных – Филиал “Столбовая”, Россия) проводили по методике Martynova et al. [1] с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда (Sigma, США).

Для получения моноспецифических антител была создана аффинная колонка на основе BrCN-сефарозы (Sigma, США) с иммобилизованным гибридным с GST (глутатион-S-трансфераза, глутатион-связывающий белок) N-фрагментом зиксина.

Для приготовления такой аффинной колонки последовательность, кодирующую N-домен зиксина (1–373 а.о), клонировали в вектор pGEX-4T-1 (Pharmacia, Швеция). Экспрессию белка GST-N-зиксина осуществляли в E. coli BL21. Выделение гибридного c GST белка из бактериального лизата проводили при помощи аффинной хроматографии на глутатион-агарозе, очищенный белок использовали для ковалентного сшивания с BrCN-сефарозой (Sigma, США). Очистку моноспецифических антител на аффинной колонке проводили по стандартной методике Martynova et al. [1].

Получение зародышей, разделение лизата на ядерную и цитоплазматическую фракции и подготовка образцов для вестерн-блот-анализа. Зародышей X. laevis получали в результате оплодотворения in vitro по методике, разработанной ранее [1]. Зародышей инкубировали в растворе 0.1 MMR (модифицированный раствор Рингера для культивирования зародышей амфибий (0.1 MMR): 0.1 М NaCl, 2.0 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂ ^. 6H₂O, 2 мМ CaCl₂ ^. 2H₂O, 5 мМ HEPES, pH 7.4) до стадии 32 бластомера, стадии гаструлы (12 стадия), стадии подвижного головастика (26-я стадия). На каждой стадии отбирали по 20 зародышей, половину зародышей использовали для приготовления лизата в буфере для коиммунопреципитации (1× буфер (pH 7.2–7.4): 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 8.1 мМ Na₂HPO₄ ^. 7H₂O, 1.5 мМ KH₂PO₄, 1% Triton-X100). Зародыши гомогенизировали пипетированием, полученный грубый лизат центрифугировали 30 мин при 15 000 g, отбирали супернатант и готовили образцы для электрофореза по стандартной методике. Другую половину зародышей использовали для разделения лизата на ядерную и цитоплазматическую фракции по ранее опубликованной методике [21] c небольшой модификацией – ядра после очистки в 0.8 М сахарозе растворяли в буфере для коиммунопреципитации и центрифугировали 30 мин при 16 000 g и 4°С. Супернатант использовали для приготовления образцов для электрофореза.

SDS-PAGE. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE в 10%-ных гелях по методу Лэммли и подвергали электроблоттингу на PVDF-мембране (Millipore Corp. Inc. Франция). В качестве первичных антител использовали моноспецифичные поликлональные антитела кролика к С- или N-зиксину и моноклональные антитела к α-тубулину (Sigma, США) в качестве референсных антител. В качестве вторичных антител использовали козий антикроличий Fab-фрагмент антитела, конъюгированный с щелочной фосфатазой (Sigma, США), и антимышиный Fab-фрагмент антитела, конъюгированный с щелочной фосфатазой (Sigma, США). Для детекции использовали стабилизированный субстрат для щелочной фосфатазы Western Blue (Promega, США). Результаты электрофореза и блоттинга оценивали визуально по окраске колометрического субстрата. Эксперименты по анализу изменений в экспрессии и локализации изоформ зиксина на проявленных специфическими антителами PVDF-мембранах проводили в более чем трехкратной повторности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе мы обнаружили, что зиксин из X. laevis имеет несколько изоформ: помимо полноразмерного модифицированного белка с молекулярной массой ~105 кДа мы детектировали немодифицированную форму зиксина с приблизительной молекулярной массой 70 кДа и две укороченные формы 45 и 37 кДа. Мы установили, что количество и внутриклеточное распределение коротких форм зависит от стадии развития эмбриона. Показано, что на начальных стадиях развития количество укороченных ядерных форм 45 и 37 кДа увеличено, но в процессе гаструляции и нейруляции, когда начинается движение клеточных слоев и возникают поля механических напряжений, преобладает цитоплазматическая форма зиксина 105 кДа и ядерные формы 70 и 37 кДа. В результате проведенной работы впервые получен важный блок данных об изменении уровня и локализации изоформ механочувствительного белка зиксина в эмбриональном развитии, что может быть связующим звеном в передаче генному аппарату механических напряжений, которые возникают в эктодерме и мезодерме эмбриона в ходе формирования его осевых структур.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00227 (https://rscf.ru/project/23-25-00227/).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Эксперименты на животных одобрены комиссией Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по контролю и использованию лабораторных животных (протокол-заявка, рег. № 249).

Об авторах

Э. Д. Иванова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Островитянова, 1

Е. А. Паршина

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

А. Г. Зарайский

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Н. Ю. Мартынова

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: martnat61@gmail.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Список литературы

Дополнительные файлы