Immunofluorescent Localization of Ca²⁺-Sensor Proteins in The Somatic Motor Muscles of The Earthworm Lumbricus terrestris

封面

如何引用文章

全文:

详细

The method of immunofluorescent staining of earthworm somatic muscle samples showed the presence of calmodulin, Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinases type 1 and type 2, synaptotagmin type 2 and type 7 and calcineurin A. These proteins are detected in both synaptic and extrasynaptic regions of the motor muscle. However, for synaptotagmin type 2 and type 7, calcineurin A, their predominant localization in the area of neuromuscular synapses has been established. Besides, synaptic localization for synaptotagmin 7 and calcineurin A is most clearly expressed.

全文:

Сокращения: НМ – нАХР — никотиновые ацетилхолиновые рецепторы; ТМР-α-Б — тетраметилродамин-α-бунгаротоксин.

ВВЕДЕНИЕ

Ca²⁺-акцепторные белки участвуют в модуляции различных форм секреции медиатора и нейрональной пластичности как в центральных, так и периферических синапсах [1-7]. Фермент Ca²⁺-кальмодулин зависимая протеинкиназа типа 2 широко представлен в зоне нервно-мышечных синапсов мыши, прежде всего в месте расположения никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) постсинаптической мембраны [8-10]. Установлено, что данный фермент имеет самое непосредственное отношение к процессу рециклизации и инкорпорированию нАХР в мышечную мембрану [8, 11]. Также установлено, что различные изоформы Ca²⁺-зависимых протеинкиназ участвуют в нейрональной активности и синаптогенезе в NMDA-нейронах гиппокампа крысы [12], стимулируют рост нервных окончаний и новых нейрональных бутонов в нервно-мышечных синапсах мухи Drosophila [13]. Синаптотагмин типа 2 широко представлен в нервных терминалях ГАМКергических нейронов коры головного мозга мыши [14]. Последний является триггерным механизмом запуска быстрой секреции медиатора, в ответ на возбуждение [15]. Синаптотагмин типа 7 модулирует спонтанную активность в синапсах и вызывает депрессию постсинаптических токов в клетках Пуркинье мыши [16]. Известно, что фермент Ca²⁺-кальмодулин зависимая протеинфосфатаза 3 состоит из двух субъединиц, каталитической — кальциневрин А и регуляторной — кальциневрин В [17, 18]. Кальциневрин А обладает широким спектром действия, включая: активацию секреции медиатора, стимуляцию нейрональной пластичности, регуляцию генетической экспрессии на уровне транскрипции [18]. В соматической мышце дождевого червя присутствуют два типа синапсов: холинергические [19] и ГАМКергические [20]. Иммунофлуоресцентная идентификация Ca²⁺-акцепторных белков в двигательной нервно-мышечной системе аннелид ранее не проводилась. Таким образом, остается не ясной и их роль в модуляции экзо-эндовезикулярного цикла секреции медиатора, а также предположительное участие в нейрональной пластичности периферической нервно-мышечной иннервации. Необходимо подчеркнуть, что представители типа Annelida являются первыми животными в длинном филогенетическом ряду, у которых эволюционно сформировалась сложная система управления двигательной активностью соматической мускулатуры [21-24], что делает изучение подобных структур особенно актуальным. Таким образом, целью настоящего исследования стало иммунофлуоресцентное выявление и определение локализации ряда ключевых Ca²⁺-сенсорных белков в двигательной мускулатуре аннелид на примере дождевого червя.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект и приготовление препаратов.

Для приготовления препарата, дождевой червь Lumbricus terrestris разрезался сбоку по всей длине, отрезались головной и хвостовой концы, раскрывался, удалялись внутренние органы и перегородки между сегментами [25]. Далее фрагменты кожно-мускульного мешка дождевого червя длиной 10–15 сегментов закрепляли с помощью иголок на дне чашек Петри, залитых смолой Sylgard, и перфузировали раствором Древеса-Пакса (состав в мМ: 77 NaCl, 4 KCl, 43 Na2SO4, 6 CaCl2, 2 Tris, 167 сахароза, pH 7.4) около 30 мин при комнатной температуре (22 ± 1°С). Затем в течение 30 мин препараты фиксировали в 2% растворе p-формальдегида, отмывали 3 раза по 30 мин в фосфатно-солевом буфере (состав в мМ: 137 NaCl, 2.7 KCl, 4.3 Na2SO4, 1.4 KH2PO4, pH 7.2). Мышцы последовательно инкубировали: 30 мин в 0.5% растворе Triton X-100; 15 мин в растворе, содержащем 5% козьей сыворотки, 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.5% Triton X-100; 15 мин в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.5% Triton X-100 (раствор А). Все эти растворы были приготовлены на основе фосфатно-солевого буфера.

Иммуномечение препаратов.

Препараты инкубировали в течение 12 ч при температуре 4°С в растворе А с моно- и поликлональными антителами. Использовали антитела к кальмодулину; ферментам Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы 1 и 2 типов; синаптотагмину 2 и 7; кальциневрину А; синаптофизину (все в разведении 1 : 100). Антитела к Ca²⁺-акцепторным белкам и синаптофизину были выработаны в разных хозяевах (мышь, кролик, коза), что позволяло проводить двойное иммуномечение исследуемых белков. Препараты отмывали в растворе А 3 раза по 30 мин и инкубировали 1 ч при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами (ослиные против мыши, кролика или козы), конъюгированными с Alexa 488 или 647 (разведение 1 : 200) в растворе А. Для подтверждения специфичности связывания антител с соответствующими белками проводили контрольные эксперименты. Для негативного контроля препарат инкубировали с вторичными антителами без предшествующей инкубации с первичными антителами. Для позитивного контроля производили инкубацию препарата с первичными антителами в присутствии иммуногенного пептида, на который вырабатывались первичные антитела. Отсутствие мечения антителами в контрольных экспериментах указывает на специфичность связывания антител с соответствующими пептидами. Мечение постсинаптических нАХР проводили с помощью тетраметилродамин-α-бунгаротоксина (ТМР-α-Б, 20 мкг/мл) в течение 50 мин. Всего в экспериментах по мечению антителами препаратов было использовано 48 образцов.

Микроскопия.

После отмывки в фосфатно-солевом буфере, препараты помещали в раствор фосфатно-солевого буфера с глицерином (1 : 1) и размещали на предметном стекле для проведения микроскопического исследования на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP (Leica Microsystems, США) с использованием масляно-иммерсионного объектива 63×/1.4. Для возбуждения эмиссии флуорофоров применялся Ar и He-Ne лазеры. Применяли следующие длины волн лазеров: для антител, меченных флуорофорами Alexa 488 — 488 нм, Alexa 647 — 633 нм; для меченного полипептида ТМР-α-Б — 543 нм. Анализ полученных конфокальных изображений проводили в программе ImageJ (NIH, США; веб-сайт программы https://imagej.net/ij/).

Реактивы. Использовали следующие реактивы: формалин (#HT5011, Sigma-Aldrich, США); Tris (#9210-OP, Sigma-Aldrich); фосфатно-солевой буфер (#P4417, Sigma-Aldrich); Triton X-100 (#T8787, Sigma-Aldrich); нормальная ослиная сыворотка (#D9663, Sigma-Aldrich); бычий сывороточный альбумин (#BSAV-RO, Sigma-Aldrich); ТМР-α-Б (#T0195, Sigma-Aldrich); глицерин (#G5516, Sigma-Aldrich); моноклональные мышиные антитела к кальмодулину (#ab2860, RRID:AB_303362, Abcam, Великобритания); поликлональные кроличьи антитела к Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназе 1 (#LS-C354567, LSBio, США); поликлональные кроличьи антитела к Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназе 2 (#MBS541139, MyBioSource, США); поликлональные козьи к синаптотагмину 2 (#LS-C139718, RRID:AB_10943434, LSBio); поликлональные кроличьи к синаптотагмину 7 (#ab106618, Abcam); поликлональные кроличьи антитела к кальциневрину А (#ab137335, Abcam); антитела к синаптофизину поликлональные кроличьи (#ANR-013, RRID:AB_2341004, Alomone Labs, Израиль) и поликлональные козьи (#sc-7569, RRID: AB_2199010, Santa Cruz Biotechnology, США); иммуногенные пептиды, соответствующие моно- и поликлональным антителам; вторичные антитела ослиные против кролика конъюгированные с Alexa 488 (#A-21206, RRID:AB_2535792, Thermo Fisher Scientific, США); вторичные антитела ослиные против козы конъюгированные с Alexa 647 (#A-21447, RRID:AB_2535864, Thermo Fisher Scientific); вторичные антитела ослиные против мыши конъюгированные с Alexa 488 (#A-21202, RRID:AB_141607, Thermo Fisher Scientific).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Двигательные нервные окончания выявляли мечением антителами на синаптофизин — интегральный мембранный гликопротеин синаптических везикул [26, 27]. Маркирование нАХР постсинаптической мембраны проводилось окрашиванием ТМР-α-Б [28].

 

Рис. 1. Флуоресцентное тройное мечение препарата соматических мышечных клеток дождевого червя Lumbricus terrestris. (a) — Иммуномечение антителами к кальмодулину (зеленый цвет); стрелки указывают на места более интенсивного мечения; (b) — иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) — мечение ТМР-α-Б постсинаптических нАХР (синий цвет); (d) — наложение изображений (a) и (b); (e) — наложение изображений (a) и (c); (f) — наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

Иммуногистохимическое мечение фрагментов соматической мускулатуры дождевого червя с целью обнаружения белка кальмодулина показало следующие результаты. Иммунофлуоресценция носит точечный характер, встречаясь по всей поверхности мембран соматических мышечных клеток (рис. 1a), сочетаясь с наличием ограниченных мест более интенсивного мечения (рис. 1a, стрелки). Необходимо отметить, что данные зоны частично перекрываются с районами свечения, маркированными на присутствие белка синаптофизина (рис. 1a, b, d, f) и с мечением ТМР-α-Б нАХР (рис. 1a, c, e, f). Полученные данные позволяют считать, что белок кальмодулин присутствует как в синаптических, так и во внесинаптических зонах мембран соматических мышечных клеток и его локализация не демонстрирует выраженной привязки к районам нервно-мышечных контактов.

 

Рис. 2. Выявление Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 1 при флуоресцентном тройном мечении препарата соматических мышечных клеток дождевого червя. (a) — Иммуномечение антителами к Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназе типа 1 (зеленый цвет); стрелки указывают на места более интенсивного мечения; (b) — иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) — мечение ТМР-α-Б постсинаптических нАХР (синий цвет); (d) — наложение изображений (a) и (b); (e) — наложение изображений (a) и (c); (f) – наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

Выявление антителами наличия фермента Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 1 показало неоднородное мечение всей поверхности мембран соматических мышечных клеток (рис. 2a), которое сочеталось с наличием ограниченных мест более интенсивного иммуномечения (рис. 2a, стрелки). При этом участки интенсивного мечения на данный фермент мало совпадали с мечением на синаптофизин (рис. 2a, b, d, f) и постсинаптические никотиновые нАХР (рис. 2a, c, e, f). Полученные результаты демонстрируют наличие в соматических мышечных клетках фермента Ca²⁺-зависимой протеинкиназы типа 1, причем последний присутствует в большей концентрации во внесинаптических зонах и, в меньшей, в синаптических.

 

Рис. 3. Наличие Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 2 при тройном флуоресцентном мечении препарата соматических мышечных клеток дождевого червя. (a) – Иммуномечение антителами к Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназе типа 2 (зеленый цвет); (b) – иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) – мечение нАХР при помощи ТМР-α-Б (синий цвет); (d) – наложение изображений (a) и (b); (e) – наложение изображений (a) и (c); (f) – наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

Иммуногистохимическая реакция, поставленная с целью идентификации Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 2 показала неравномерную флуоресценцию мышечных клеток (рис. 3a). Иммуномечение на данный фермент практически полностью перекрывалось с зонами выявления белка синаптофизина (рис. 3a, b, d, f), а также постсинаптических нАХР (рис. 3a, c, e, f). Таким образом, полученные результаты указывают на присутствие Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 2 как в синаптических, так и во внесинаптических регионах мышечной мембраны. Нельзя исключить, что данный фермент может присутствовать как в двигательных нервных окончаниях, так и в концевой пластинке постсинаптической мембраны, что может указывать на его предположительное участие в процессах рециклирования нАХР [8].

 

Рис. 4. Обнаружение синаптотагмина типа 2 при флуоресцентном тройном мечении препарата соматических мышечных клеток дождевого червя. (a) – Иммуномечение антителами к синаптотагмину 2 (зеленый цвет); (b) – иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) – мечение нАХР при помощи ТМР-α-Б (синий цвет); (d) – наложение изображений (a) и (b); (e) – наложение изображений (a) и (c); (f) – наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

Иммуногистохимическое выявление мышечных препаратов с целью обнаружения белка синаптотагмина типа 2 показало неравномерное мечение мембран соматических мышечных клеток (рис. 4a). Необходимо отметить, что иммуномечение на синаптотагмин типа 2 полностью повторяло мечение на белок синаптофизин (рис. 4a, b, d, f) и постсинаптические нАХР (рис. 4a, c, e, f). Полученные данные позволяют считать с высокой вероятностью, что белок синаптотагмин 2 присутствует как на пре-, так и на постсинаптических мембранах соматических мышечных клеток дождевого червя.

 

Рис. 5. Выявление синаптотагмина типа 7 при флуоресцентном тройном мечении препарата соматических мышечных клеток дождевого червя. (a) – Иммуномечение антителами к синаптотагмину 7 (зеленый цвет); стрелки указывают на места более интенсивного окрашивания; (b) – иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) – мечение нАХР при помощи ТМР-α-Б (синий цвет); (d) – наложение изображений (a) и (b); (e) – наложение изображений (a) и (c); (f) – наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

 

Мечение антителами мышечных препаратов на белок синаптотагмин типа 7 выявило неравномерное иммуномечение препарата, которое в некоторых участках имело более интенсивное свечение (рис. 5a, стрелки). Эти участки более яркого свечения совпадали с мечением на синаптофизин (рис. 5a, b, d, f) и нАХР (рис. 5a, c, e, f). Таким образом, синаптотагмин типа 7 в большей степени локализуется на пре- и постсинаптических мембранах мышечных клеток, и меньшей степени представлен вне зон нервно-мышечных синапсов.

Иммуногистохимическая реакция на определение белка кальциневрина А показала неравномерное мечение мышечных клетках (рис. 6a). При этом мечение антителами на белок кальциневрин А в большей степени повторяло маркирование на нАХР (рис. 6a, c, e, f), чем мечение на синаптофизин (рис. 6a, b, d, f). Полученные результаты позволяют считать, что белок кальциневрин А в большей степени концентрируется в зоне нервно-мышечных синапсов. Более того, возможно он тесно связан с канально-рецепторной организацией концевых пластинок нервно-мышечных синапсов.

 

Рис. 6. Наличие кальциневрина А при флуоресцентном тройном мечении препарата соматических мышечных клеток дождевого червя. (a) – Иммуномечение антителами к кальциневрину А (зеленый цвет); (b) – иммуномечение антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красный цвет); (c) – мечение нАХР при помощи ТМР-α-Б (синий цвет); (d) – наложение изображений (a) и (b); (e) – наложение изображений (a) и (c); (f) – наложение изображений (a), (b) и (c). Масштаб 20 µm.

 

Подводя итог полученным результатам, можно прийти к следующему заключению. Методом иммунофлуоресцентного мечения препаратов соматической мышцы дождевого червя показано присутствие в последних ряда ключевых Ca²⁺-акцепторных белков, а именно: кальмодулина, Ca²⁺-кальмодулин зависимой протеинкиназы типа 1 и типа 2, синаптотагмина типа 2 и типа 7 и кальциневрина А. Некоторые из данных белков, такие как кальмодулин и Ca²⁺-кальмодулин зависимая протеинкиназа типа 1 определяются как в синаптических, так и внесинаптических областях мышечных препаратов, без выраженной привязки своей локализации к зонам нервно-мышечных контактов. В тоже время такие белки как Ca²⁺-кальмодулин зависимая протеинкиназа 2, синаптотагмин 2, синаптотагмин 7 и кальциневрин А хотя представлены и во внесинаптических регионах соматической мышцы, отчетливо демонстрируют свое присутствие именно в зонах концевых пластинок мионевральных синапсов. При этом для синаптотагмина типа 7 и кальциневрина А это присутствие выражено наиболее отчетливо. Основываясь на данных литературы [1, 11, 18] можно думать, что данные белки играют существенную роль как в процессах квантовой секреции медиатора, рециклировании постсинаптических канально-рецепторных комплексов, так и нейрональной пластичности двигательных нервно-мышечных синапсов.

Дождевой червь, который относится к типу Аннелиды, имеет характеристики свойственные для последнего общего предка билатеральных животных [29]. Кольчатые черви являются первыми целомическими сегментированными животными в филогенетическом ряду, которые обладают соматической мускулатурой и способны к сложным управляемым локомоциям [23]. Нами получены сведения о наличии кальций-сенсорных белков в синапсах эволюционно-первичной двигательной мускулатуры. Аналогичные белки имеются в нервно-мышечном аппарате более высокоорганизованных животных, в том числе у различных классов типов Моллюски, Членистоногие и Хордовые, включая Млекопитающих [2–8]. Таким образом, можно утверждать, что система кальциевой регуляции квантовой секреции медиатора с помощью изученных нами кальций-акцепторных белков обладает высокой генетической консервативностью и сформировалась на самых ранних этапах эволюции нервно-мышечной регуляции двигательной активности у животных.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (Л.Ф.Н. и Е.М.В.), сбор данных (Н.Д.А.), обработка данных (Л.Ф.Н., Н.Д.А), написание и редактирование манускрипта (Л.Ф.Н., Е.М.В.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям комиссии по биоэтике ФИЦ КазНЦ РАН (протокол №23/5 от 12.05.2023 г.).

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 23-24-00239, https://rscf.ru/project/23-24-00239/).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

×

作者简介

L. Nurullin

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Federal Research Center “Kazan Scientific Center of Russian Academy of Sciences”; Kazan State Medical University

编辑信件的主要联系方式.
Email: lenizn@yandex.ru
俄罗斯联邦, Kazan; Kazan

N. Almazov

Kazan State Medical University

Email: lenizn@yandex.ru
俄罗斯联邦, Kazan

E. Volkov

Kazan State Medical University

Email: euroworm@mail.ru
俄罗斯联邦, Kazan

参考

  1. Südhof TC (2012) Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harb Perspect Biol 4: a011353. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a011353
  2. DeLorenzo RJ (1982) Calmodulin in neurotransmitter release and synaptic function. Fed Proc 41: 2265–2272.
  3. Xue R, Meng H, Yin J, Xia J, Hu Z, Liu H (2021) The Role of Calmodulin vs. Synaptotagmin in Exocytosis. Front Mol Neurosci 14: 691363.https://doi.org/10.3389/fnmol.2021.691363
  4. Sakaba T, Neher E (2001) Calmodulin mediates rapid recruitment of fast-releasing synaptic vesicles at a calyx-type synapse. Neuron 32: 1119–1131.https://doi.org/10.1016/s0896-6273(01)00543-8
  5. Liu Q, Chen B, Ge Q, Wang ZW (2007) Presynaptic Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II modulates neurotransmitter release byactivating BK channels at Caenorhabditis elegans neuromuscular junction. J Neurosci 27: 10404–10413.https://doi.org/10.1523/jneurosci.5634-06.2007
  6. Fujii T, Sakurai A, Littleton JT, Yoshihara M (2021) Synaptotagmin 7 switches short-term synaptic plasticity from depression to facilitation by suppressing synaptic transmission. Sci Rep 11: 4059.https://doi.org/10.1038/s41598-021-83397-5
  7. Pang ZP, Melicoff E, Padgett D, Liu Y, Teich AF, Dickey BF, Lin W, Adachi R, Südhof TC (2006) Synaptotagmin-2 is essential for survival and contributes to Ca²⁺ triggering of neurotransmitter release in central and neuromuscular synapses. J Neurosci 26: 13493–13504. https://doi.org/10.1523/jneurosci.3519-06.2006
  8. Martinez-Pena y Valenzuela I, Mouslim C, Akaaboune M (2010) Calcium/calmodulin kinase II-dependent acetylcholine receptor cycling at the mammalian neuromuscular junction in vivo. J Neurosci 30: 12455–12465.https://doi.org/10.1523/jneurosci.3309-10.2010
  9. Schworer CM, Rothblum LI, Thekkumkara TJ, Singer HA (1993) Identification of novel isoforms of the delta subunit of Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II. Differential expression in rat brain and aorta. J Biol Chem 268: 14443–14449. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9258(19)85259-6
  10. Bayer KU, Harbers K, Schulman H (1998) alphaKAP is an anchoring protein for a novel CaM kinase II isoform in skeletal muscle. EMBO J 17: 5598–5605. https://doi.org/10.1093%2Femboj%2F17.19.5598
  11. Martinez-Pena y Valenzuela I, Akaaboune M (2021) The Metabolic Stability of the Nicotinic Acetylcholine Receptor at the Neuromuscular Junction. Cells 10: 358.https://doi.org/10.3390/cells10020358
  12. Saneyoshi T, Wayman G, Fortin D, Davare M, Hoshi N, Nozaki N, Natsume T, Soderling TR (2008) Activity-dependent synaptogenesis: regulation by a CaM-kinase kinase/CaM-kinase I/betaPIX signaling complex. Neuron 57: 94–107.https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.11.016
  13. Nesler KR, Starke EL, Boin NG, Ritz M, Barbee SA (2016) Presynaptic CamKII regulates activity-dependent axon terminal growth. Mol Cell Neurosci 76: 33–41.https://doi.org/10.1016/j.mcn.2016.08.007
  14. Chen C, Arai I, Satterfield R, Young SM Jr, Jonas P (2017) Synaptotagmin 2 Is the Fast Ca²⁺ Sensor at a Central Inhibitory Synapse. Cell Rep 18: 723–736.https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.067
  15. Xu J, Mashimo T, Südhof TC (2007) Synaptotagmin-1, –2, and –9: Ca(2+) sensors for fast release that specify distinct presynaptic properties in subsets of neurons. Neuron 54: 567–581.https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.05.004
  16. Weyrer C, Turecek J, Harrison B, Regehr WG (2021) Introduction of synaptotagmin 7 promotes facilitation at the climbing fiber to Purkinje cell synapse. Cell Rep 36: 109719.https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109719
  17. Yakel JL (1997) Calcineurin regulation of synaptic function: from ion channels to transmitter release and gene transcription. Trends Pharmacol Sci 18: 124–134. https://doi.org/10.1016/S0165-6147(97)01046-8
  18. Creamer TP (2020) Calcineurin. Cell Commun Signal 18: 137.https://doi.org/10.1186/s12964-020-00636-4
  19. Volkov EM, Nurullin LF (2005) Effects of cholinergic receptor agonists and antagonists on miniature stimulatory postsynaptic ionic currents in somatic muscle cells of Lumbricus terrestris. Bull Exp Biol Med 139: 360–362.https://doi.org/10.1007/s10517-005-0294-2
  20. Nurullin LF, Almazov ND, Volkov EM (2023) Immunofluorescent Identification of GABAergic Structures in the Somatic Muscle of the Earthworm Lumbricus terrestris. Biochem (Mosc) Suppl Ser A Membr Cell Biol 17: 208–213.https://doi.org/10.1134/S1990747823040074
  21. Parry L, Tanner A, Vinther J (2014) The origin of annelids. Front Palaeontology 57: 1091–1103.https://doi.org/10.1111/pala.12129
  22. Purschke G, Müller MCM (2006) Evolution of body wall musculature. Integr Comp Biol 46: 497–507.https://doi.org/10.1093/icb/icj053
  23. Allentoft-Larsen MC, Gonzalez BC, Daniels J, Katija K, Osborn K, Worsaae K (2021) Muscular adaptations in swimming scale worms (Polynoidae, Annelida). R Soc Open Sci 8: 210541.https://doi.org/10.1098/rsos.210541
  24. Denes AS, Jékely G, Steinmetz PR, Raible F, Snyman H, Prud'homme B, Ferrier DE, Balavoine G, Arendt D (2007) Molecular architecture of annelid nerve cord supports common origin of nervous system centralization in bilateria. Cell 129: 277–288.https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.02.040
  25. Volkov EM, Nurullin LF, Nikolsky EE, Švandová I, Vyskočil F (2000) Participation of electrogenic Na+-K⁺-ATPase in the membrane potential of earthworm body wall muscles. Physiol Res 49: 481–484.http://www.biomed.cas.cz/physiolres/pdf/49/49_481.pdf
  26. Valtorta F, Pennuto M, Bonanomi D, Benfenati F (2004) Synaptophysin: Leading actor or walk-on role in synaptic vesicle exocytosis? Bioessays 26: 445–453.https://doi.org/10.1002/bies.20012
  27. Kwon SE, Chapman ER (2011) Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron 70: 847–854. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2011.04.001
  28. Krause M, Wernig A (1985) The distribution of acetylcholine receptors in the normal and denervated neuromuscular junction of the frog. J Neurocytol 14: 765–780. https://doi.org/10.1007/bf01170827
  29. Christodoulou F, Raible F, Tomer R, Simakov O, Trachana K, Klaus S, Snyman H, Hannon GJ, Bork P, Arendt D (2010) Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature 463: 1084–1088.https://doi.org/10.1038/nature08744

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Fluorescent triple labeling of a preparation of somatic muscle cells of the earthworm Lumbricus terrestris. (a) — Immunolabeling with antibodies to calmodulin (green); arrows indicate areas of more intense labeling; (b) — immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) — labeling of TMP-α-B of postsynaptic nAChRs (blue); (d) — superposition of images (a) and (b); (e) — superposition of images (a) and (c); (f) — superposition of images (a), (b), and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (968KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Detection of Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type 1 by fluorescent triple labeling of earthworm somatic muscle cell preparation. (a) — Immunolabeling with antibodies to Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type 1 (green); arrows indicate sites of more intense labeling; (b) — immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) — TMP-α-B labeling of postsynaptic nAChRs (blue); (d) — superposition of images (a) and (b); (e) — superposition of images (a) and (c); (f) — superposition of images (a), (b) and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (1MB)
索引源数据
4. Fig. 3. The presence of Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type 2 in triple fluorescent labeling of earthworm somatic muscle cell preparation. (a) – Immunolabeling with antibodies to Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type 2 (green); (b) – immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) – labeling of nAChRs using TMP-α-B (blue); (d) – superposition of images (a) and (b); (e) – superposition of images (a) and (c); (f) – superposition of images (a), (b) and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (688KB)
索引源数据
5. Fig. 4. Detection of synaptotagmin type 2 by fluorescent triple labeling of earthworm somatic muscle cell preparation. (a) Immunolabeling with antibodies to synaptotagmin 2 (green); (b) Immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) Labeling of nAChRs with TMP-α-B (blue); (d) Overlay of images (a) and (b); (e) Overlay of images (a) and (c); (f) Overlay of images (a), (b), and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (731KB)
索引源数据
6. Fig. 5. Detection of synaptotagmin type 7 by fluorescent triple labeling of earthworm somatic muscle cell preparation. (a) – Immunolabeling with antibodies to synaptotagmin 7 (green); arrows indicate areas of more intense staining; (b) – immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) – labeling of nAChRs using TMP-α-B (blue); (d) – superposition of images (a) and (b); (e) – superposition of images (a) and (c); (f) – superposition of images (a), (b) and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (783KB)
索引源数据
7. Fig. 6. The presence of calcineurin A in fluorescent triple labeling of earthworm somatic muscle cell preparation. (a) – Immunolabeling with antibodies to calcineurin A (green); (b) – immunolabeling with antibodies to the presynaptic protein synaptophysin (red); (c) – labeling of nAChRs using TMP-α-B (blue); (d) – superposition of images (a) and (b); (e) – superposition of images (a) and (c); (f) – superposition of images (a), (b) and (c). Scale bar 20 µm.

下载 (815KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».