Interaction of pRb and beta-catenin in cancer and normal tissue in the human prostate

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Prostate cancer (PCa) is one of the most common oncological diseases, which goes through two stages in its development. The first stage, localized prostate cancer, can proceed indefinitely in a dormant form that does not require active medical intervention, or suddenly turn into an aggressive metastatic form with lethal outcome. The pathogenesis of the transition of the dormant form of PCa to the metastatic form remains not fully understood. The signaling pathways of the tumor suppressor pRb and the proto-oncogene β-catenin are probably the most involved in the pathogenesis of PCa but the role of their interaction in the pathogenesis of prostate cancer has not been studied. The publication on the pathogenesis of tumors in other tissues suggests that pRb may lose some properties of a tumor suppressor at the initial stage of PCa development due to its interaction with β-catenin that enables tumor cells to gain competitive advantages for reproduction. In this work, we have shown that the RB and β-catenin (CTNNB1) genes are well expressed in tumor and normal prostate tissue. Unlike β-catenin, pRb is not detected by immunoblotting in tumor and normal prostate tissue, but is easily determined in this way in extracts of control T98G cells. Co-immunoprecipitation with antibodies to pRb from extracts of tumor and normal prostate tissue makes it possible to detect this protein and β-catenin by subsequent immunoblotting, which indicates the physical interaction of these proteins in prostate tissue. On the other hand, immunoprecipitation of β-catenin with antibodies to its C-terminal fragment does not detect this protein in prostate extracts by subsequent immunoblotting using the same antibody. In contrast to prostate tissue, β-catenin is readily detected by immunoprecipitation combined with immunoblotting in T98G control cell extracts. The obtained data suggest that pRb and β-catenin physically interact with each other in cells of different tissue specificity. In T98G cells, this interaction probably occurs through the C-terminal fragment of β-catenin, but in prostate cells it occurs in a different way, since the C-fragment of β-catenin is shielded from such interaction, possibly due to its physical association with pRb.

Full Text

Принятые сокращения: КР-РПЖ – кастрационно-резистентный РПЖ, ПЖ – предстательная железа, ПСА – простатический специфический антиген, ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, РПЖ – рак предстательной железы, ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени, AR – андрогенный рецептор, CTNNB1 – ген β-катенина, передающего сигналы в каноническом сигнальном пути Wnt/β-катенин, RB – ген чувствительности к ретинобластоме; pRb – продукт гена RB.

Ген RB, определяющий чувствительность к возникновению ретинобластомы, был первым опухолевым супрессором, который удалось клонировать в 1986–1987 гг. (Friend et al., 1986; Lee et al., 1987). С тех пор RB и его продукт pRb постепенно заняли центральное место в публикациях, посвященных изучению основных клеточных функций и их нарушений при онкологических заболеваниях.

Область регуляторной активности RB включает эмбриональные стволовые, соматические стволовые и дифференцированные клетки различных тканей (Sage, 2012). Онкосупрессорная активность pRb основана на его канонической роли в регуляции клеточного цикла и неканонической роли в регуляции состояния хроматина (Weinberg, 1995; Sherr, 1996; Dyson, 1998; Dick et al., 2018).

Многофункциональность pRb опосредована его свойством взаимодействовать со множеством различных регуляторных белков. Основными партнерами pRb являются транскрипционные факторы семейства E2F, которые опосредуют его регуляторное воздействие на клеточный цикл и хроматин (Dyson, 1998). В ходе такого взаимодействия белки семейства E2F, имеющие сайты связывания в промоторах множества генов, физически взаимодействуют с pRb, способствуют формированию комплекса pRb-E2F на промоторах генов-мишеней и прямому или опосредованному торможению их транскрипции путем рекрутирования комплексов или отдельных белков, например метилтрансферазы Ezh2. Ezh2 триметилирует лизин 27 гистона Н3 (Н3К27ме3). Такая модификация хроматина в промоторах генов плюрипотентности OCT4, SOX2 в эксперименте вызывает их сайленсинг, сохраняющий стволовые клетки в состоянии самоподдержания и тормозящий их дифференцировку в тканеспецифические специализированные клетки (Kareta et al., 2015; Dick et al., 2018). Потеря, мутации, метилирование промотора RB или посттрансляционные модификации его продукта ведут к изменениям внутриклеточной сигнализации и возникновению опухолей в различных тканях, включая предстательную железу (ПЖ) (Mandigo et al., 2021).

В мужской репродуктивной системе ПЖ является небольшим вспомогательным органом, который в настоящее время находится в центре биомедицинских исследований вследствие самой высокой чувствительности к онкогенной трансформации среди других органов у мужчин.

Рак предстательной железы (РПЖ) диагностируется в течение жизни у каждого восьмого лица мужского пола (Siegel et al., 2021). ПЖ формируется и функционирует в эмбриональной жизни и после рождения под контролем сигнального пути андрогенного рецептора (AR) (Сunha, 1994). AR наиболее высоко экспрессируется в люминальном эпителии ПЖ, фенотип которого доминирует при РПЖ, поэтому AR является критическим эффектором возникновения и прогрессии РПЖ и эффективности его терапии (Balk, Knudsen, 2008).

С одной стороны, AR способствует делению клетки путем индукции экспрессии циклина D1, образованию активной киназы циклин-D/Cdk4,6 и последующей инактивации pRb путем его гиперфосфорилирования (Xu et al., 2006). pRb является убиквитарным негативным регулятором клеточного цикла. В начале фазы G1 он находится в гипофосфорилированном активном состоянии и индуцирует остановку клеточного цикла в рестрикционной точке R1 перед началом репликации ДНК путем связывания и секвестрирования активаторных транскрипционных факторов E2Fs (E2F1-E2F3). Фосфорилирование pRb киназами циклин-D/Cdk4,6 и циклин-Е/Cdk2 освобождает белки E2Fs от связи с ним.

В несвязанном с pRb состоянии белки E2Fs способствуют последовательному формированию циклин-зависимых киназных комплексов, включающих циклины D, E, A, М. Такие комплексы создают механизм последовательного прохождения клеткой фаз G1, S, G2/M клеточного цикла (Dyson, 1988; Рябов и др., 2022).

С другой стороны, проксимальный и дистальный промоторы гена AR содержат сайты связывания белков E2Fs, передающих регуляторное влияние pRb на транскрипцию AR. Сигнальный путь pRb–E2F1 транскрипционно тормозит экспрессию AR и его мишеней – генов ПСА и сериновой трансмембранной протеазы (TMPRSS2). При потере RB происходит активация сигнального пути AR и связанное с ним повышение уровня продуктов ПСА и TMPRSS2. Ген TMPRSS2 у части пациентов с РПЖ формирует рекомбинантную последовательность путем слияния с геном ERG (TMPRSS2-ERG), которая является маркером РПЖ (Tomlins et al., 2008).

Утрата RB играет ключевую роль в патогенезе и снижении эффективности медикаментозного лечения РПЖ, направленного на модуляцию сигнального пути AR. Прогрессирование РПЖ включает две отдельные стадии: локализованный РПЖ и кастрационно-резистентный РПЖ (КР-РПЖ). В первой стадии болезнь может протекать неопределенно долго в дремлющей форме, не угрожающей жизни пациента, или внезапно трансформироваться в агрессивный КР-РПЖ, сопровождающийся быстрым летальным исходом (Mandigo et al., 2021). Потеря RB обнаруживается менее, чем у 1% пациентов с локализованным РПЖ, но у 30–60% пациентов с КР-РПЖ (Sharma et al., 2010; McNair et al., 2018).

Механизм утраты pRb свойств опухолевого супрессора при локализованном РПЖ не ясен, но изучение патогенеза опухолей других тканей позволяет предположить, что в начальной стадии развития опухоли pRb может терять некоторые свойства опухолевого супрессора, что дает возможность опухолевым клеткам получить конкурентные преимущества для размножения (Viatour, Sage, 2011).

Пациенты с раком грудной железы, у которых выявляется потеря pRb, демонстрируют более продолжительный период безрецидивной выживаемости после химиотерапии по сравнению с пациентами с нормальным уровнем pRb (Derenzini et al., 2008). Сигнальный путь Wnt/β-катенин конститутивно активирован более чем в 90% случаев колоректального рака, при котором в некоторых случаях амплифицируется локус RB (Cancer Genome Atlas Network, 2012).

Опухоль может использовать разные механизмы отмены негативного влияния pRb на ее рост. В нормальных условиях pRb способствует митохондриальному апоптозу путем увеличения проницаемости внешней митохондриальной мембраны, опосредованному взаимодействием pRb с белком Bax. Потеря RB и его взаимодействия с Bax уменьшает уровень апоптоза и его защитную роль при росте опухоли (Wang et al., 2017). pRb тормозит транскрипцию E2F1, который способствует активации сигнального пути ARF-p53, вызывающего апоптоз (Weber et al., 2000).

В условиях потери pRb могут накапливаться реактивные формы кислорода, вызывающие активацию аутофагии (Ciavarra, Zacksenhaus, 2011). Функции pRb почти всегда сохраняются при раке толстого кишечника, при котором pRb способствует росту опухоли путем транскрипционной супрессии E2F1, тормозящего продукцию β-катенина (Morris et al., 2008).

Другой механизм участия β-катенина в развитии опухолей толстого кишечника реализуется при хроническом воспалении и опосредуется фактором некроза опухолей (TNF). В таких случаях TNF активирует каспазу 8, которая протеолизирует pRb в его С-концевой части, тогда как клетки с мутацией RB в С-домене проявляют устойчивость к апоптозу, индуцированному TNF (Chau et al., 2002).

Устойчивость к апоптозу также повышена в клеточных линиях, происходящих из толстого кишечника и экспрессирующих ядерный β-катенин, взаимодействие которого с pRb, вероятно, тормозит митохондриальный апоптоз (Han et al., 2013). Взаимодействие между pRb и β-катенином при локализованном РПЖ не изучалось.

Цель настоящей работы заключалась в изучении взаимодействия pRb с β-катенином в опухолевой и окружающей нормальной ткани ПЖ, полученных от пациентов, подвергнутых радикальной простатэктомии по поводу локализованного РПЖ.

Первая задача работы заключалась в оценке экспрессии эпителиальных маркеров (цитокератина 5 и AR), опухолевого маркера (AMACR), генов CTNNB1 (β-катенина) и RB в опухолевой и нормальной ткани ПЖ.

Вторая задача состояла в определении уровня белков pRb и β-катенина в тех же тканях путем иммуноблотинга и иммунопреципитации.

Третья задача включала в себя оценку взаимодействия pRb и β-катенина в указанных тканях с помощью иммуноблотинга и иммунопреципитации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Пробы ткани ПЖ. Образцы ткани получали от пациентов, подвергнутых радикальной простатэктомии по поводу РПЖ в урологическом отделении Ленинградского областного клинического онкологического диспансера им. Л.Д. Романа (ЛОКОД) в соответствии с протоколом, утвержденным биоэтическим комитетом Института цитологии РАН и согласованным с отделом клинических исследований ЛОКОД.

Пробы ткани ПЖ весом около 100 мг, включая опухолевый узел или нормальную ткань того же слоя, помещали в пробирки с 5 мл стерильной среды RPMI 1640, содержащей 50 мкг/мл гентамицина (“Биолот”, Россия). Каждую из двух проб разделяли острыми ножницами на две части, одна из которых предназначалась для экстрагирования тотальной РНК и общеклеточного белка. Вторую часть обрабатывали коллагеназой для приготовления клеточной суспензии, которую использовали в дальнейшем для получения первичных клеточных двумерных культур.

Стабильная клеточная линия T98G. Глиобластома человека T98G широко используется в качестве золотого стандарта клеток, продуцирующих белки pRb и β-катенин (Hansen et al., 2001; Петров и др., 2016; Popov et al., 2020). Клетки были получены из коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки, гентамицином (50 мкг/мл) при 6% CO2 и 100%-ной влажности.

Получение первичных клеточных культур из образцов тканей ПЖ. Пробы ткани ПЖ, предназначенные для получения клеточных культур, помещали в 100-мм чашки Петри с 10 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Далее пробы разрезали стерильными ножницами на кусочки размером 1 мм, переносили в 15 мл конические пластиковые пробирки (TTP, Новосибирск, Россия), и подвергали ферментативной обработке в 1 мл раствора, содержащего 5 мг коллагеназы II типа (Life Technologies, США) в 1 мл среды Advanced DMEM/F12, содержащей 50 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 10 мМ Hepes и 1-кратный GlutaMAX (adDMEM/F12+++, Life Technologies, CША).

Далее добавляли ингибитор Rho-киназы Y27632 (Abmole Bioscience, США) до конечной концентрации 10 мкМ и дигидротестостерон (Sigma, США) до конечной концентрации 1 нМ (Drost et al., 2016). Пробирки с материалом инкубировали на ротационном шейкере (PST-60 HL-4, “Биосан”, Латвия) 18 ч при 37 °С и 230 rpm.

Затем суспензии центрифугировали при 250 g 5 мин, клеточные осадки отмывали в 5 мл среды adDMEM/F12, фильтровали через нейлоновые сито с порами 70 мкм (Corning, CША), осаждали при 250 g 5 мин, осадок ресуспендировали в 1 мл раствора TrypLE Express (Life Technologies, США) в течение 1 ч на ротационном шейкере (PST-60 HL-4, “Биосан”, Латвия) при 37 °С и 230 rpm.

Затем к суспензии добавляли 5 мл среды adDMEM/F12, клетки осаждали центрифугированием при 250 g 5 мин, осадок ресуспендировали в 500 мкл среды adDMEM/F12+++.

Для подсчета количества клеток 5 мкл клеточной суспензии смешивали с 45 мкл 1%-ной уксусной кислоты и 50 мкл 2%-ного трипанового синего (“Биолот”, Россия), клетки подсчитывали в камере Горяева.

Для получения первичных клеточных культур 2 · 105 клеток из клеточной суспензии добавляли в 4 мл специальной среды SCBM (Lonza, Швейцария) для стромальных клеток ПЖ человека и вносили в 60 мм культуральные чашки, предварительно покрытые коллагеном (“Биолот”, Россия). Имиджи клеток первичных культур получали через 2–4 недели культивирования, используя микроскопа Axiovert 200M (Германия), камеру DFC420 в режиме проходящего света или фазового контраста, объектив 20*/0.5; размер снимка составлял 1728×1296 пикселей.

Извлечение тотальной РНК из проб ткани ПЖ пациентов, синтез кДНК. Пробы ткани ПЖ размером 2×2 мм помещали в стальную ступку, охлаждали жидким азотом и растирали пестиком. Полученный порошок переносили в отдельную пробирку и добавляли 1 мл ExtractRNA (“Евроген”, Россия), оставляли на льду на 5 мин. Затем в каждую пробирку добавляли по 200 мкл охлажденного хлороформа и суспензию перемешивали на вортексе.

После этого пробирки ставили в лед на 3 мин, центрифугировали 15 мин при 4 °С и 13 000 g, верхнюю фазу супернатанта переносили в новые пробирки и добавляли 500 мкл изопропанола (Sigma, США). Инкубировали на льду 10 мин, затем центрифугировали 10 мин при 4 °С и 13 000 g, удаляли супернатант, добавляли по 1 мл 70%-ного этанола, центрифугировали 5 мин при 4 °С и 7600 g. Полностью удаляли супернатант, осадок сушили при комнатной температуре 10 мин, растворяли в 32 мкл безнуклеазной воды (Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали 15 мин при 57.5°С.

Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Для синтеза кДНК 2 мкг РНК смешивали с 1 мкл праймера олиго-дТ18 (“Алкор Био”, Россия), объем смеси доводили до 11 мкл и инкубировали при 70 °С 10 мин; охлаждали, добавляли 2 мкл буфера для обратной транскриптазы (SibEnzyme, Россия), 2 мкл 10 мМ смеси дНТФ (Beagle, Россия), 0.5 мкл ингибитора рибонуклеаз RiboLock (Thermo Scientific, США), 40 ед. обратной транскриптазы (SibEnzyme, Россия), предварительно разведённой в буфере для обратной транскриптазы, и инкубировали 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали нагреванием до 70 °С в течение 10 мин.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ). Смесь реагентов для проведения ПЦР включала в себя: 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ (Beagle, Россия), 2.5 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы (“Алкор Био”, Россия), 2.5 мкл 10 мМ MgCl2, 1 мкМ прямого и обратного праймеров (“Алкор Био”, Россия), 2 мкл кДНК, 0.25 мкл Taq-полимеразы (“Алкор Био”, Россия) и воду до 25 мкл общего объeма реакционной смеси.

Смесь готовили при температуре тающего льда. Амплификацию проводили на термоциклере Bio-Rad T100 (США) при следующем температурном режиме: инициирующее плавление – 1 мин, 94 °С; плавление – 15 с, 94 °С; отжиг – 30 с, 58 °С; элонгация – 30 с, 72 °С (40 циклов); плато – 10 мин, 72 °С. Продукты ПЦР-амплификации подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием, размер отдельных ампликонов в агарозном геле определяли при сравнении их подвижности с маркерами 50 пар оснований (п. о.) (Invitrogen, США) на имиджах, полученных с помощью Bio-Rad ChemiDoc XRS+ (США) (табл. 1).

 

Таблица 1. Праймеры, использованные для амплификации маркерных генов, экспрессирующихся в опухолевой и нормальной ткани предстательной железы

Ген

Прямой праймер, ٥′–3′

Обратный праймер, ٥′–3′

Размер ампликона, п.о.

CK5

TTCATCGACAAGGTGCGGT

TGAGGTGTCAGAGACATGCG

423

AR

GACATGCGTTTGGAGACTGC

TTTCTTCAGCTTCCGGGCTC

294

AMACR

TGGCCACGATATCAACTATTTGG

ACTCAATTTCTGAGTTTTCCACAGAA

247

RB

GCAGTATGCTTCCACCAGGC

AATCCGTAAGGGTGAACTAGGAAAC

91

CTNNB1 (ген β-катенина)

GATTGATTCGAAATCTTGCCCT

CTGATGTGCACGAACAAGCA

101

GAPDH

CCATCTTCCAGGAGCGAGA

GGCAGTGATGGCATGGACTGT

326

 

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Общеклеточную РНК выделяли при помощи набора для выделения РНК на колонках “Биолабмикс” (Новосибирск, Россия). Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл PBS, добавляли по 350 мкл буфера для лизиса LB из набора, пипетировали, инкубировали в течение 10 мин. Добавляли к лизату равный объем этанола, переносили на колонки, центрифугировали 30 с при 10 000 g, удаляли фильтрат. Наносили на колонки по 500 мкл буфера для промывки из набора, центрифугировали 30 с при 10 000 g и удаляли фильтрат. Повторяли эту же процедуру с буфером для промывки WB2. Колонки центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин для полного удаления промывочного буфера и переносили их в новые микропробирки. Далее на фильтр каждой колонки дважды наносилось по 60 мкл буфера для элюции EB из набора, после чего колонки оба раза инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифугировали 1 мин при 10 000 g.

Количество РНК определяли спектрометрически при длине волны 260 нм. Для синтеза кДНК 2 мкг РНК смешивали с 2 мкл 20 мкМ раствора случайного гексапраймера (“Биолабмикс”, Новосибирск, Россия), объем смеси доводили до 12 мкл и инкубировали при 70 °С 3 мин, реакционную смесь охлаждали, добавляли к ней 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл (200 ед.) обратной транскриптазы M-MuLV-RH (“Биолабмикс”, Новосибирск, Россия), 1 мкл 10 мМ смеси dNTP и 2 мкл 0.1 М ДТТ, инкубировали 10 мин. при 25 °С и затем 60 мин при 42 °С.

Реакцию останавливали нагреванием до 70 °С в течение 10 мин. ПЦР-РВ проводили на амплификаторе Bio-Rad CFX96 Touch со следующими параметрами: инициирующее плавление – 6 мин. 95°С, плавление – 15 с 95 °С, отжиг – 30 с 60 °С, синтез – 60 с 70 °С, 40 циклов.

Реакционная смесь состояла из 15 мкл 2-кратного раствора HS-qPCR SYBR Blue, содержащего дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), ПЦР-буфер, MgCl2, Taq ДНК-полимеразу, SYBR Green I и инертный краситель (“БиоМастер”, Россия), 0.2 мкМ прямого и обратного праймеров (см. табл. 1), синтезированных в компании “Евроген” (Россия), 0.2 мкл кДНК и воды до объeма 30 мкл.

В качестве контрольного гена использовали GAPDH. Нормализованную экспрессию рассчитывали по формуле ÄÄCq = ÄCqGOI / ÄCqGAPDH, где GOI – ген интереса, а ÄCq – относительное количество, рассчитанное из разницы между средним значением цикла выхода Cq и самым низким средним значением Cq среди образцов в эксперименте. Для всех генов ПЦР-РВ повторяли шесть раз.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблотинг. Электрофорез белков проводили в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS). Пробы ткани ПЖ размером 2×2 мм помещали в стальную ступку, охлаждали жидким азотом и растирали пестиком. Затем добавляли 100 мкл буферного раствора, содержащего 25 мМ Трис-НСl (pH 7.4), 250 мM NaCl, 0.25%-ный детергент NP-40, 1 мM PMSF – коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Sigma, США) в разведении 1:100.

Полученные экстракты центрифугировали 15 мин при 13 000 g и температуре 4 °С, супернатанты использовали для последующих экспериментов. Пробы уравнивали по количеству общего белка, определяемого с помощью Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, США), переносили в микропробирки, содержащие равный объeм буфера для нанесения проб на гель (4% SDS, 20% глицерина, 200 мМ дитиотреита, 120 мМ Трис-Cl (pH 6.8), 0.002% бромфенолового синего), кипятили 5 мин на водяной бане и наносили в объeме 25 мкл, содержащем 50 мкг общего белка, на одну дорожку ПААГ. Электрофоретически разделенные белки переносили с геля на мембрану PVDF с помощью полусухого электропереноса. Белки на мембране выявляли специфическими антителами и визуализировали реактивом ECL (Sigma, США).

Иммунопреципитация. Для преципитации комплексов антиген–антитело образцы ткани растирали в стальной ступке при помощи жидкого азота, лизировали при температуре тающего льда 30 мин. специальным буферным раствором, содержащим 20 мМ Tris-Cl (pH 8.0), 137 мМ NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 мМ EDTA и ингибиторы протеаз и фосфатаз (Sigma, США) в разведении 1:100. Экстракты клеток центрифугировали 15 мин при 13 000 g и температуре 4 °С и супернатанты использовали для последующей иммунопреципитации.

С этой целью к 500 мкл клеточного экстракта, содержащего 500 мкг белка, добавляли 5 мкг специфических антител на 90 мин, обработку антителами проводили при постоянной ротации при 4 °С. Затем к экстрактам добавляли 30 мкг антител к иммуноглобулинам кролика (Sigma, США) на 1.5 ч с последующим добавлением 30 мкл 10% протеин-А сефарозы на 1.5 ч.

Преципитаты отмывали путeм 3-кратного центрифугирования при 2000 об./мин. в буфере для иммунопреципитации и 2-кратного центрифугирования в таком же буфере без детергента. Последующая обработка включала в себя кипячение проб в течение 5 мин в буфере для нанесения на гель, центрифугирование для отделения сефарозы и нанесение на ПААГ.

Иммунофлюоресцентное окрашивание. Покровные стекла с клетками, распластанными при росте в культуре, переносили в чашки 35 мм, однократно отмывали PBS 5 мин, фиксировали 4%-ным параформальдегидом 15 мин, затем 70%-ным этиловым спиртом в течение ночи при 4 ºС; обрабатывали 0.2%-ным “Тритоном X-100” 10 мин, промывали PBS 2 раза по 5 мин; сайты неспецифического связывания антител блокировали 1 ч раствором, содержащим 3% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% “Твина 20”.

Затем на клетки наносили специфические антитела (разведение в 50–200 раз) в блокирующем растворе на 1 ч при комнатной температуре, промывали 3 раза по 5 мин. PBS, обрабатывали 1 ч при комнатной температуре вторыми антителами, конъюгированными с флюоресцентной меткой, отмывали 3 раза по 5 мин PBS и заключали в среду Аnti-Fade (BioRad, США), уменьшающую неспецифическую флюоресценцию и содержащую краситель DAPI для окраски ДНК. Иммунофлюоресцентные изображения получали на конфокальном электронном сканирующем микроскопе Olimpus FV3000 (“Олимпус”, Япония), используя лазеры с длиной волны 405, 561 и 640 нм и объектив с увеличением 60×.

Антитела. Для иммунопреципитации и иммуноблотинга использовали следующие антитела: кроличьи поликлональные антитела анти-β-катенин (CAT-15, Thermo Fisher Scientific, США), мышиные моноклональные антитела против pRb (C-2) и Gapdh (G-9) (sc-74562 и sc-365062, соответственно; Santa-Cruz, Biothech, США), мышиные моноклональные антитела против AMACR были получены самостоятельно (Popov et al., 2018). Для иммуноблотинга использовали анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Cell Signaling, США) и анти-мышиные антитела, конъюгированные с HRP (BioRad, США).

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием средней арифметической величины, ее ошибки и критерия Стьюдента (при P = 0.05), посчитанных при помощи программы Microsoft Office Exсel 2010. Уровень β-катенина определяли по соотношению этого белка с Gapdh на одних и тех же электрофоретических блотах.

Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Для количественной оценки и сравнения содержания белков на отдельных электрофоретических полосах использовали приложение GelAnalyzer2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика пациентов с локализованным РПЖ, у которых брали пробы ткани простаты. Объектом нашего исследования служили пробы опухолевой и окружающей нормальной ткани предстательной железы 17 пациентов, подвергнутых радикальной простатэктомии по поводу локализованного РПЖ. В момент операционного вмешательства пациентам было от 55 до 73 лет, уровень ПСА в сыворотке их крови составлял 3.5–16.8 нг/мл и коэффициент Глисона – от 5 (3 + 2) до 7 (3 + 4) (табл. 2).

 

Таблица 2. Общая информация, описывающая статус пациентов с локализованным РПЖ, подвергнутых радикальной простатэктомии и давших добровольное согласие на использование ткани ПЖ в исследовании

Номер п.п.

Последовательный номер клинической пробы

Возраст пациента (лет)

Уровень ПСА сыворотки крови при операции, (нг/мл)

Коэффициент Глисона

1

49

73

7.0

6 (3+3)

2

55

56

14.8

5 (3+2)

3

56

60

5.0

6 (3+3)

4

57

68

8.0

5

58

62

7.0

6

59

65

8.0

7

60

73

8

61

61

9.7

7 (3+4)

9

62

61

8.0

6 (3+3)

10

63

65

9.0

7 (3+4)

11

64

72

11.1

12

65

69

16.8

6 (3+3)

13

66

66

16.1

14

67

68

5.1

15

68

55

5.4

16

69

61

9.8

17

70

61

9.7

 

Гены RB и CTNNB1 стабильно экспрессируются в опухолевой и нормальной ткани предстательной железы человека. Результаты ПЦР-ОТ с использованием мРНК, полученной из опухолевой и нормальной ткани ПЖ пациентов, оперированных по поводу локализованного РПЖ, показали, что и в той, и в другой ткани экспрессируются маркер базального слоя эпителия ПЖ цитокератин 5 (ЦК5) и маркер люминального слоя эпителия – андрогенный рецептор (AR).

В опухолевой ткани выявляется экспрессия маркера РПЖ AMACR, который экспрессируется в меньшем количестве или отсутствует в нормальной ткани (рис. 1а, б). В образцах опухолевой и нормальной ткани пациентов стабильно экспрессируются гены RB и CTNNB1 (β-катенина) (рис. 1а, б). ПЦР в реальном времени показала, что уровень экспрессии этих генов в опухолевой и нормальной ткани ПЖ примерно одинаков (рис. 1в, г).

 

Рис. 1. Амплификация RB и CTNNB1 (ген β-катенина) в опухолевой и нормальной ткани предстательной железы (ПЖ) пациентов, оперированных по поводу РПЖ. ОТ-ПЦР-амплификация маркеров: эпителиальных (ЦК5, AR), опухолевого (AMACR), RB и CTNNB1 (гена β-катенина) в опухолевой (а) нормальной (б) ткани ПЖ: 1 – маркер мол. массы 50 п.о., 2 – ЦК5 (423 п.о.), 3 – AR (294 п.о.), 4 – AMACR (247 п.о.), 5 – RB (91 п.о.), 6 – CTNNB1 (101 п.о.), 7 – GAPDH (326 п.о.); в, г – ПЦР-РВ-амплификация RB и CTNNB1 соответственно; в, г – данные ПЦР-РВ представляют собой среднюю арифметическую величину и ее ошибку (n = 3)

 

Уровень β-катенина в опухолевой и нормальной ткани при РПЖ варьирует от пациента к пациенту, а pRb вовсе не определяется в иммуноблотинге. При использовании нагрузки по общему белку в 50 мкг на дорожку 10%-ного ПААГ β-катенин выявляется в пробах опухолевой и нормальной тканей пациентов с РПЖ. Выявляемый уровень β-катенина варьирует от пациента к пациенту, но не доминирует ни в опухолевой, ни в нормальной ткани (рис. 2а). В противоположность β-катенину, pRb не определяется в тех же экстрактах тканей ПЖ при иммуноблотинге, тогда как в контрольных клетках T98G продукция обоих белков стабильно выявляется на высоком уровне (рис. 2а). Сравнение средних величин уровня β-катенина в опухолевой и нормальной ткани показывает отсутствие различий (рис. 2б). Отсутствие pRb на иммуноблотах клеток ПЖ отчасти связано с низким уровнем его продукции относительно β-катенина, поскольку использование тех же антител против pRb, распознающих эпитоп в С-концевой части белка, позволяет выявить этот белок в иммунопреципитации, совмещенной с иммуноблотингом, как в опухолевой, так и в нормальной ткани ПЖ (рис. 2в). Результаты иммунофлюоресценции на первичных 2D-культурах, полученных из опухолевой или нормальной ткани ПЖ, показывают, что pRb продуцируется на очень низком уровне и выявляется преимущественно в цитоплазме некоторых клеток, тогда как β-катенин визуализируется на значительно более высоком уровне в цитоплазматической, мембранной и ядерной формах (рис. 2г).

 

Рис. 2. Уровень β-катенина и pRb в опухолевой (1) и нормальной (2) ткани ПЖ трех клинических проб (65, 66, 67) от пациентов, оперированных по поводу локализованного РПЖ. Иммуноблотинг (WB) и иммунопреципитация (ИП); а – WB: белки экстрактов ПЖ разделяли путем электрофореза в 10%-ном ПААГ при нагрузке по общеклеточному белку 50 мкг на дорожку; Gapdh определяли для выравнивания нагрузки на разных дорожках, экстракты клеток линии T98G использовали в качестве положительного контроля; б – уровень β-катенина в опухолевой (1) и нормальной (2) ткани ПЖ, показаны средние арифметические величины и их ошибки (n = 7); в – ИП: pRb из опухолевой и нормальной ткани ПЖ; экстракты, содержащие 50 мкг общеклеточного белка на дорожку, разделяли при электрофорезе в ПААГ и визуализировали с помощью WB; г – иммунофлюоресцентное выявление pRb (зеленый цвет) и β-катенина (красный цвет) в клетках первичных культур из опухолевой (1) и нормальной (2) ткани ПЖ (клиническая проба 70): ядра окрашены DAPI (голубой цвет); конфокальный лазерный сканирующий микроскоп FV3000 (Япония; лазеры 405, 561 и 640 нм), увеличение объектива 60x

 

Иммунопреципитация β-катенина и его ко-иммунопреципитация с pRb из экстрактов опухолевой и нормальной ткани пациентов с локализованным РПЖ. Мы нашли, что хотя β-катенин стабильно выявляется у всех пациентов с РПЖ при иммуноблотинге, использование тех же антител не приводит к его выявлению в иммунопреципитации, совмещенной с иммуноблотингом как в опухолевой, так и в нормальной ткани. В противоположность результатам с иммунопреципитацией из экстрактов тканей ПЖ, β-катенин стабильно выявляется при иммунопреципитации теми же антителами из экстрактов клеток линии T98G (рис. 3а).

 

Рис. 3. Белки pRb и β-катенин физически взаимодействуют друг с другом и формируют комплекс в экстрактах ткани предстательной железы человека: а – β-катенин (клинические пробы 58 и 59) не преципитируется из экстрактов ткани ПЖ, но выявляется на иммуноблоте антителами CAT-15 (Thermo Fisher Scientific, США), распознающими эпитоп в С-концевом участке молекулы; б – антитела к pRb ко-иммунопреципитируют β-катенин из экстрактов ткани ПЖ (клинические пробы 56 и 57). Клетки T98G использовали как положительный контроль. ИП, WB – то же, что и на рис. 2. Показаны результаты для опухолевой (1) и нормальной (2) ткани ПЖ

 

Мы предполагаем, что отсутствие иммунопреципитации β-катенина из экстрактов ПЖ связано с тем, что сайты его распознавания антителами CAT-15 (Thermo Fisher Scientific, США) экранированы в ПЖ в результате взаимодействия β-катенина с pRb. Это предположение соответствует тому факту, что используемые антитела иммунопреципитируют β-катенин из экстрактов клеток T98G, в которых взаимодействие β-катенина и pRb происходит, вероятно, иначе (см. рис. 3а).

Для проверки этого предположения мы использовали иммунопреципитацию антителами к pRb, совмещенную с иммуноблотингом антителами против β-катенина. В таком опыте антитела к pRb ко-иммунопреципитируют β-катенин, который выявляется как в экстрактах опухолевых и нормальных клеток ПЖ, так и в экстрактах клеток T98G (см. рис. 3б).

ОБСУЖДЕНИЕ

Белок pRb играет различную роль в патогенезе локализованного РПЖ и КР-РПЖ. При локализованном РПЖ мутации или потеря гена RB встречаются менее, чем у 1% пациентов в противоположность КР-РПЖ, при котором такие нарушения выявляются в 30–60% заболеваний (McNair et al., 2018; Рябов и др., 2022).

Мы предположили, что низкая частота мутаций RB и сохранение синтеза его продукта при локализованном РПЖ могут быть связаны с тем, что pRb теряет некоторые функции опухолевого супрессора. Возможно, при локализованном РПЖ подобно тому, что происходит при раке толстого кишечника, опухолевые клетки создают конкурентные преимущества для роста путем модификации и использования pRb в своих целях (Morris et al., 2008; Viatour, Sage, 2011).

Механизм частичной утраты свойств опухолевого супрессора продуктом RB может быть основан на его взаимодействии с β-катенином в клетках РПЖ, как это происходит в клетках при раке толстого кишечника (Han et al., 2013). Для оценки такого предположения мы сначала оценили экспрессию генов в опухолевой и нормальной ткани ПЖ с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ.

Результаты опытов показали, что гены CTNNB1 (ген β-катенина) и RB экспрессируются в опухолевой и нормальной ткани ПЖ подобно маркерам базального (ЦК5) и люминального (AR) эпителия. Экспрессия CTNNB1 и RB в опухолевой и нормальной ткани ПЖ существенно не отличается. В опухолевой ткани дополнительно выявляется AMACR – маркер РПЖ (рис. 1а, б).

При оценке уровня продуктов CTNNB1 и RB (pRb) мы нашли, что β-катенин выявляется в опухолевой и нормальной ткани ПЖ, хотя его уровень изменяется от пациента к пациенту, не показывая доминирования ни в опухолевой, ни нормальной ткани (см. рис. 2а, б). В отличие от β-катенина, pRb не выявляется на иммуноблотах ни в опухолевой, ни в нормальной ткани ПЖ, тогда как в контрольных клетках T98G этот белок выявляется на высоком уровне (см. рис. 2а). C помощью иммунопреципитации pRb выявляется как в опухолевой, так и в нормальной ткани ПЖ, причем в опухолевой ткани его уровень значительно превышает таковой в нормальной ткани (см. рис. 2в).

Следующим шагом была оценка физического взаимодействия β-катенина и pRb. Путем ко-иммунопреципитации антителами к pRb нам удалось показать, что эти белки физически взаимодействуют друг с другом и преципитируются в одном комплексе. Ко-иммунореципитированный антителами против pRb из экстрактов опухолевой и нормальной ткани ПЖ β-катенин выявляется специфическими антителами на иммуноблотах (см. рис. 3а). Уровень ко-иммунопреципитированного β-катенина из экстрактов ткани ПЖ подобен таковому из клеток линии T98G (см. рис. 3а).

Интересно, что β-катенин не иммунопреципитируется из экстрактов ПЖ теми же специфическими антителами, которыми он распознается в иммублотинге, но иммунопреципитируется из экстрактов контрольных клеток T98G (см. рис 3б).

Эти данные дают возможность предположить, что в клетках ткани ПЖ сайт распознавания β-катенина антителами CAT-15 (Thermo Fisher Scientific, США) экранирован от распознавания, поскольку он занят взаимодействующим с ним pRb. В клетках T98G взаимодействие этих белков происходит, вероятно, иначе, поэтому сайт распознавания антителами CAT-15 оказывается открытым и β-катенин эффективно ко-иммунопреципитируются теми же антителами против β-катенина (см. рис. 3б).

Найденные нами особенности взаимодействия β-катенина и pRb в клетках ПЖ проходят как в опухолевой, так и нормальной ткани. Возможно, что этот процесс инициируется в опухоли и распространяется на нормальную ткань путем передачи неизвестного фактора, который взаимодействует с С-концевым участком β-катенина, экранируя находящийся там эпитоп связывания антител CAT-15 (Thermo Fisher Scientific, США).

β-Катенин опосредует регуляторное действие на клетку эволюционно консервативного семейства белков Wnt (Wodarz, Nusse, 1998). В присутствии лигандов Wnt цитоплазматичский β-катенин становится стабильным, транслоцируется в ядро и активирует транскрипционные факторы семейства LEF/TCF, инициируя продукцию Myc, циклина D1, AR, что ассоциируется с возникновением РПЖ (Kypta, Waxman, 2012). Мутации β-катенина идентифицированы в 5% проб тканей с РПЖ (Voeller et al., 1998).

Кроме того, инактивация β-катенина способствуют мутации опухолевых супрессоров APC и AXIN1, продукты которых входят в состав комплекса, способствующего его деструкции (Schneider, Logan, 2018). Подобно pRb, β-катенин имеет множественные точки влияния на продукцию AR. В регуляторной области гена AR находятся три активных сайта связывания LEF/TCF, передача сигналов Wnt/β-катенин может сопровождаться повышением уровня транскрипции AR (Yang et al., 2006).

Торможение GSK-3β, эффекторной киназы комплекса, инактивирующего β-катенин в цитоплазме, может способствовать репрессии AR и росту РПЖ (Mazor et al., 2004). Мишень сигнального пути Wnt/β-катенин, продукт гена циклина D1, может подавлять сигнальный путь AR (Petre et al., 2002). В опытах in vivo на мышиной модели РПЖ показано, что сверхэкспрессия β-катенина вызывает выраженную интраэпителиальную неоплазию и резистентность к антиандрогенной терапии (Yu et al., 2009).

Изложенные данные из литературы показывают, что pRb и β-катенин имеют множественные точки синергичного и антагонистичного влияния на продукцию AR и прогрессирование РПЖ. Дальнейшее изучение механизмов сочетанной роли этих факторов может раскрыть новые стороны патогенеза локализованного РПЖ и его перехода в КР-РПЖ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность сотрудникам группы конфокальной микроскопии и анализа изображений Института цитологии РАН за помощь в проведении фазoво-контрастной и сканирующей микроскопии, а также сотрудникам ЦКП “Коллекция культур клеток позвоночных”, имеющего финансовую поддержку Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2021-683), за предоставление клеточной линии T98G.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 23-25-00162).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Образцы ткани предстательной железы получали от пациентов, подвергнутых радикальной простатэктомии по поводу рака ПЖ в отделении урологии Ленинградского областного клинического онкологического диспансера им. Л. Д. Романа. Забор материала проводили согласно протоколу № 19, утвержденному биоэтической комиссией Института цитологии РАН 4 мая 2023 г. и согласованному с отделом клинических исследований онкологического диспансера им. Л. Д. Романа. Экспериментов с участием животных авторы не проводили.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

V. M. Ryabov

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

N. I. Tyapkin

Roman Leningrad Regional Clinical Oncological Dispensary, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, Kuzmolovo

A. P. Rodimzev

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

O. G. Lyublinskaya

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

I. V. Guzhova

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

B. V. Popov

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: voldemryabov@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

  1. Петров Н.С., Воскресенский М.А., Грозов Р.В., Коршак О.В., Зарицкий А.Ю., Верещагина Н.А., Комяков Б.К., Попов Б.В. 2016. Маркеры клеток базального слоя эпителия предстательной железы являются эффективными индикаторами ее злокачественной трансформации. Цитология. Т. 58. С. 526. (Petrov N.S., Voskresenskiy M.A., Grozov R.V., Korshak O.V., Zaritskey A.Y., Vereschagina N.A., Komyakov B.K. and Popov B.V. 2017. Markers of the basal cell layer of prostate are effective indicators of its malignant transformation. Cell Tiss. Biol. V. 11. P. 205). https:// doi.org/10.1134/S1990519X17030099
  2. Рябов В.M., Воскресенский М.А., Попов Б.В. 2022. Роль опухолевого супрессора RB в развитии локализованного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы. Цитология. T. 64. С. 208. (V.M. Ryabov, M.A. Voskresenskiy, B.V. Popov. 2022. Role of the tumor suppressor RB in the development of localized and castration-resistant prostate cancer. Cell Tiss. Biol. V. 16. P. 434). https://doi.org/10.1134/S1990519X2205008X
  3. Balk S.P., Knudsen K.E. 2008. AR, the cell cycle, and prostate cancer. Nucl Recept Signal. V. 6. P. e001. https://doi: 10.1621/nrs.06001
  4. Cancer Genome Atlas Network. 2012. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. V. 487. P. 330. https://doi.org/10.1038/nature11252
  5. Chau B.N., Borges H.L., Chen T.T., Masselli A., Hunton I.C., Wang J.Y. 2002. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat. Cell Biol. V. 4. P. 757. https://doi.org/10.1038/ncb853
  6. Ciavarra G., Zacksenhaus E. 2011. Direct and indirect effects of the pRb tumor suppressor on autophagy. Autophagy. V. 7. P. 544. https://doi.org/10.4161/auto.7.5.15056
  7. Cunha G.R. 1994. Role of mesenchymal-epithelial interactions in normal and abnormal development of the mammary gland and prostate. Cancer. V. 74. P. 1030. https://doi.org/10.1002/1097-0142(19940801)74:3+<1030:aid-cncr2820741510>3.0.co;2-q.
  8. Derenzini M., Donati G., Mazzini G., Montanaro L., Vici M., Ceccarelli C., Santini D., Taffurelli M., Treré D. 2008. Loss of retinoblastoma tumor suppressor protein makes human breast cancer cells more sensitive to antimetabolite exposure. Clin. Cancer Res. V. 14. P. 2199. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-07-2065
  9. Dick F.A., Goodrich D.W., Sage J., Dyson N.J. 2018. Non-canonical functions of the RB protein in cancer. Nat. Rev. Cancer. V. 18. P. 442. https://doi.org/10.1038/s41568-018-0008-5
  10. Dyson N.1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev. V 12. P. 2245. https://doi.org/10.1101/gad.12.15.2245
  11. Friend S.H., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R.A., Rapaport J.M., Albert D.M., Dryja T.P. 1986. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature. V. 323. P. 643. https://doi.org/10.1038/323643a0
  12. Han J., Soletti R.C., Sadarangani A., Sridevi P., Ramirez M.E., Eckmann L., Borges H.L., Wang J.Y. 2013. Nuclear expression of β-catenin promotes RB stability and resistance to TNF-induced apoptosis in colon cancer cells. Mol. Cancer Res. V. 11. P. 207. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-12-0670
  13. Hansen K., Farkas T., Lukas J., Holm R., Rönnstrand L., and Bartek J. 2001. Phosphorylation-dependent and -independent functions of p130 cooperate to evoke a sustained G1 block. EMBO J. V. 20. P. 422. https//doi.org/10.1093/emboj/20.3.422
  14. Kareta M.S., Gorges L.L., Hafeez S., Benayoun B.A., Marro S., Zmoos A.F., Cecchini M.J., Spacek D., Batista L.F., O’Brien M., Ng Yi-H., Ang C.E., Vaka D., Artandi S.E., Dick F.A., Brunet A. et al. 2015. Inhibition of pluripotency networks by the Rb tumor suppressor restricts reprogramming and tumorigenesis. Cell Stem Cell. V. 16. P. 39. https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.10.019
  15. Kypta R.M., Waxman J. 2012. Wnt/β-catenin signalling in prostate cancer. Nat. Rev. Urol. V. 9. P. 418. https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.10.019
  16. Lee W.H., Bookstein R., Hong F., Young L.J., Shew J.Y., Lee E.Y. 1987. Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence. Science. V. 235. P. 1394. https://doi.org/10.1126/science.3823889
  17. Mandigo A.C., Tomlins S.A., Kelly W.K., Knudsen K.E. 2021. Relevance of pRB Loss in Human Malignancies. Clin. Cancer Res. V. 28. P. 255. https:// doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-21-1565
  18. Mazor M., Kawano Y., Zhu H., Waxman J., Kypta R.M. 2004. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 represses androgen receptor activity and prostate cancer cell growth. Oncogene. V. 23. P. 7882. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1208068
  19. McNair C., Xu K., Mandigo A.C., Benelli M., Leiby B., Rodrigues D., Lindberg J., Gronberg H., Crespo M., De Laere B., Dirix L., Visakorpi T., Li F., Feng F.Y., de Bono Jуе Demichelis F. et al. 2018. Differential impact of RB status on E2F1 reprogramming in human cancer. J. Clin. Invest. V. 128. P. 341. https://doi.org/10.1172/JCI93566
  20. Morris E.J., Ji J.Y., Yang F., Di Stefano L., Herr A., Moon N.S., Kwon E.J., Haigis K.M., Näär A.M., Dyson N.J. 2008. E2F1 represses beta-catenin transcription and is antagonized by both pRB and CDK8. Nature. V. 455. P. 552. https://doi.org/10.1038/nature07310
  21. Petre C.E., Wetherill Y.B., Danielsen M., Knudsen K.E. 2002. Cyclin D1: mechanism and consequence of androgen receptor co-repressor activity. J. Biol. Chem. V. 277. P. 2207. https://doi: 10.1074/jbc.M106399200
  22. Popov B.V., Sutula G.I., Petrov N.S., Yang X.J. 2018. Preparation and characterization of the antibody recognizing AMACR inside its catalytic center. Int. J. Oncol. V. 52. P. 547. https://doi.org/10.3892/ijo.2017.4220
  23. Popov B., Petrov N., Ryabov V., Evsyukov I. 2020. p130 and pRb in the maintenance of transient quiescence of mesenchymal stem cells. Stem Cells Int. Article ID 8883436. https://doi.org/10.1155/2020/8883436
  24. Sage J. 2012. The retinoblastoma tumor suppressor and stem cell biology. Genes Dev. V. 26. P. 1409. https://doi.org/10.1101/gad.193730.112
  25. Schneider J.A., Logan S.K. 2018. Revisiting the role of Wnt/β-catenin signaling in prostate cancer. Mol. Cell Endocrinol. V. 462. P. 3. https://doi.org/10.1016/j.mce.2017.02.008
  26. Sharma A., Yeow W.S, Ertel A., Coleman I., Clegg N., Thangavel C., Morrissey C., Zhang X., Comstock C.E., Witkiewicz A.K. et al. 2010. The retinoblastoma tumor suppressor controls androgen signaling and human prostate cancer progression. J. Clin. Invest. V. 120. P. 4478. https://doi.org/10.1172/JCI44239
  27. Sherr C.J. 1996. Cancer cell cycles. Science. V. 274. P. 1672. https://doi.org/10.1126/science.274.5293.1672
  28. Siegel R.L., Miller K.D., Fuchs H.E., Jemal A. 2021. Cancer Statistics, 2021. CA Cancer J. Clin. V. 71. P. 7. https://doi.org/10.3322/caac.21654
  29. Tomlins S.A., Laxman B., Varambally S., Cao X., Yu J., Helgeson B.E., Cao Q., Prensner J.R., Rubin M.A., Shah R.B., Mehra R., Chinnaiyan A.M. 2008. Role of the TMPRSS2-ERG gene fusion in prostate cancer. Neoplasia. V. 10. P. 177. https://doi.org/10.1593/neo.07822
  30. Truica C.I., Byers S., Gelmann E.P. 2000. Beta-catenin affects androgen receptor transcriptional activity and ligand specificity. Cancer Res. V. 60. P. 4709.
  31. Viatour P., Sage J. 2011. Newly identified aspects of tumor suppression by RB. Dis. Model. Mech. V. 4. P. 581. https://doi.org/10.1242/dmm.008060
  32. Voeller H.J., Truica C.I., Gelmann E.P. 1998. Beta-catenin mutations in human prostate cancer. Cancer Res. V. 58. P. 2520.
  33. Wang C.Y., Xu Z.B., Wang J.P., Jiao Y., Zhang B. 2017. Rb deficiency accelerates progression of carcinoma of the urinary bladder in vivo and in vitro through inhibiting autophagy and apoptosis. Int. J. Oncol. V. 50. P. 1221. https://doi.org/10.3892/ijo.2017.3889
  34. Weber J.D., Kuo M.L., Bothner B., DiGiammarino E.L., Kriwacki R.W., Roussel M.F., Sherr C.J. 2000. Cooperative signals governing ARF-mdm2 interaction and nucleolar localization of the complex. Mol. Cell Biol. V. 20. P. 2517. https://doi.org/10.1128/MCB.20.7.2517-2528.2000
  35. Weinberg R.A. 1995. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. V. 81. P. 323. https://doi.org/10.1016/0092-8674(95)90385-2
  36. Wodarz A., Nusse R. 1998. Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. V. 14. P. 59. https://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.14.1.59
  37. Yang X., Chen M.W., Terry S., Vacherot F., Bemis D.L., Capodice J., Kitajewski J., de la Taille A., Benson M.C., Guo Y., Buttyan R. 2006. Complex regulation of human androgen receptor expression by Wnt signaling in prostate cancer cells. Oncogene. V. 25. P. 3436. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209366
  38. Yu X., Wang Y., Jiang M., Bierie B., Roy-Burman P., Shen M.M., Taketo M.M., Wills M., Matusik R.J. 2009. Activation of beta-catenin in mouse prostate causes HGPIN and continuous prostate growth after castration. Prostate. V. 69. P. 249. https://doi.org/10.1002/pros.20877
  39. Xu Y., Chen S.Y., Ross K.N., Balk S.P. 2006. Androgens induce prostate cancer cell proliferation through mammalian target of rapamycin activation and post-transcriptional increases in cyclin D proteins. Cancer Res. V. 66. P. 7783. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-4472

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Amplification of RB and CTNNB1 (β-catenin gene) in tumor and normal prostate gland (PG) tissue of patients operated on for prostate cancer. OT-PCR amplification of markers: epithelial (CK5, AR), tumor marker (AMACR), RB and CTNNB1 (β-catenin gene) in tumor (a) normal (b) prostate tissue: 1 - 50 bp mol% marker, 2 - CK5 (423 bp), 3 - AR (294 bp), 4 - AMACR (247 bp), 5 - RB (91 bp), 6 - CTNNB1 (101 bp), 7 - GAPDH (326 bp. ); c, d - PCR-RV amplification of RB and CTNNB1, respectively; c, d - PCR-RV data represent the arithmetic mean and its error (n = 3)

Download (393KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Levels of β-catenin and pRb in tumor (1) and normal (2) PG tissue of three clinical samples (65, 66, 67) from patients operated on for localized RPV. Immunoblotting (WB) and immunoprecipitation (IP); a - WB: proteins of PB extracts were separated by electrophoresis in 10% PAGE at a total cellular protein load of 50 μg per lane; Gapdh was determined to equalize the load on different lanes, extracts of T98G cell line were used as positive control; b - β-catenin levels in tumor (1) and normal (2) PB tissue, arithmetic mean values and their errors are shown (n = 7); c - IP: pRb from tumor and normal PB tissue; extracts containing 50 μg of total cellular protein per lane were separated by electrophoresis in PAH and visualized by WB; d - immunofluorescence detection of pRb (green) and β-catenin (red) in primary culture cells from tumor (1) and normal (2) PB tissue (clinical trial 70): nuclei stained with DAPI (blue color); confocal laser scanning microscope FV3000 (Japan; 405, 561 and 640 nm lasers), objective magnification 60x

Download (552KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Proteins pRb and β-catenin physically interact with each other and form a complex in human prostate tissue extracts: a - β-catenin (clinical samples 58 and 59) is not precipitated from prostate tissue extracts but is detected on immunoblot by CAT-15 antibodies (Thermo Fisher Scientific, USA) recognizing an epitope in the C-terminal region of the molecule; b - antibodies to pRb co-immunoprecipitate β-catenin from prostate tissue extracts (clinical samples 56 and 57). T98G cells were used as positive controls. IP, WB are the same as in Fig. 2. Results for tumor (1) and normal (2) PG tissue are shown

Download (276KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».