Пути активации изотопного обмена дофамина с D2O

Полный текст

Влияние дофамина на функционирование живых организмов многообразно [1–4]. Он влияет на жизнедеятельность нервной системы, сердца, на сосуды, пищеварение и др. Наиболее известными патологиями, связанными с дофамином, являются шизофрения и паркинсонизм. Дофамин играет немаловажную роль в обеспечении когнитивной деятельности и используется мозгом для оценки и мотивации, закрепляя важные для выживания и продолжения рода действия. Существует по меньшей мере пять различных подтипов дофаминовых рецепторов.

Анализ процессов, происходящих в организме, упрощается при использовании изотопномеченных препаратов. Поэтому при отработке методик введения метки стараются их сделать приемлемыми для введения и дейтерия, и трития. При использовании дейтериевых аналогов в биологических исследованиях важно, чтобы в препарате присутствовало два и более атомов дейтерия для более достоверной интерпретации полученных масс-спектрометрических данных. Поэтому используются известные и новые методы стимулирования изотопного обмена. Изотопный обмен активируют, протонируя реакционную смесь, проводя реакцию в присутствии гетерогенных и гомогенных катализаторов, совмещая твердофазные и жидкофазные методы [5]. Здесь надо пояснить, какие методики получили название твердофазных и жидкофазных: твердофазные реакции проводятся без использования растворителя, жидкофазные – идут в растворе.

Естественно, в разных случаях преимущества того или иного метода зависят от природы биологически активного соединения. Например, совмещение твердофазного и жидкофазного методов может вызвать и негативные последствия. Очевидно, что активация изотопного обмена ионами D⁺ из F₃CCOOD, образовавшимися при взаимодействии дейтериевой воды с трифторуксусной кислотой, будет иметь другие характеристики, чем ионами D⁺, образовавшимися при взаимодействии газообразного дейтерия с 5% Pd/Al₂О₃ [6–8]. Катионы дейтерия, генерируемые на катализаторе, образуют на носителе и в веществе кислотные центры Бренстеда, которые, с одной стороны, способствуют увеличению подвижности протонов в молекулах вещества, с другой – сильнее протонируют функциональные группы органического соединения, что может привести к их деградации [5].

Целью данной работы было продолжение изучения условий повышения эффективности изотопного обмена с D₂O, при насыщении смеси дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ активированными частицами дейтерия. Оценку активации изотопного обмена проводили, используя при введении дейтерия кислоту или катализатор.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Катализаторы, растворители, реагенты – коммерческие препараты. Использовали солянокислый дофамин (Sigma–Aldrich, США, H8502–5g, чистота >97.5%).

Для анализа реакционных смесей использовали методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии. ВЭЖХ проводили на хроматографе Милихром-А02, колонка ProntoSIL-120-5-C₁₈ AQ (2 × 75 мм, размер частиц 5 мкм). Температура колонки 35°C. Длина волны 210 нм. Элюент А – 0.2 М LiClO₄ + 0.005М HClO₄, элюент Б – метанол, линейный градиент от 0 до 50% Б за 10 мин. Скорость подачи элюента 150 мкл/мин. Время удерживания дофамина 3.20 мин.

Масс-спектрометрические данные получали на приборе LCQ Advantage MAX (Thermo Electron, США) с ионизацией электрораспылением, прямым вводом раствора образца с концентрацией 10 мкг/мл в метаноле и дальнейшей фрагментацией молекулярного пика в анализаторе методом ионных соударений при 35 эВ. Включение дейтерия в ароматическую часть дофамина определяли по фрагменту с m/z = 109.1, в молекулу дофамина – по молекулярному пику с m/z = 154.1 (мономолекулярные массы). Выход и содержание дейтерия в дофамине приведены в табл. 1 и 2.

 

Таблица 1. Зависимость изотопного обмена дофамина с дейтериевой водой от температуры и времени проведения реакции

Температура, °C (время, мин)	Выход, %	Среднее ∑D
150 (30)	82	0.15
150 (60)	81	0.25
170 (60)	73	0.35
190 (30)	50	1.46
210 (30)	43	1.68

 

Таблица 2. Зависимость содержания дейтерия и выхода дофамина от состава реакционной среды

Условия реакции	Выход	Среднее ∑D
Смесь дофамин-5% Pd/Al2О3-Al2О3 (D2O)*	40	3.82
Смесь дофамин-5% Pd/Al2О3-Al2О3 (D2)	2	1.23
D2O	53	1.48
D2O-TFA (10 : 1)	70	2.52

* – предварительное насыщение D₂ смеси дофамин-5% Pd/Al₂О₃-Al₂О₃ (1 : 5 : 20).

 

Приготовление смеси солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20)

Солянокислый дофамин (25.0 мг) растворяли в 0.1 мл дейтериевой воды, вносили 500 мг Al₂O₃ и обрабатывали ультразвуком для равномерного распределения раствора в порошке. Замораживали смесь жидким азотом и вакуумировали 5 ч. Образовавшийся осадок измельчали и лиофилизировали 16 ч. Высушенный остаток растирали с 5% Pd/Al₂O₃ (125 мг) и вновь лиофилизировали 16 ч. В результате получали смесь солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20).

Использование смеси солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20)

(а) Смесь солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (15 мг) помещали в ампулу (объем 2 мл) и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч в атмосфере газообразного дейтерия (давление 400 гПа). К насыщенной дейтерием смеси солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ добавляли 0.2 мл дейтериевой воды, ампулу продували аргоном, запаивали и выдерживали 30 мин при 190°C (по расчетам, при такой температуре 80% D₂O присутствует в жидкой фазе). Затем растворитель удаляли лиофилизацией. К смеси добавляли 0.5 мл метанола, катализатор отфильтровывали и промывали метанолом три раза по 0.5 мл. Экстракты упаривали. Сухой остаток растворяли в 0.58 мл воды и анализировали. После определения выхода [D]дофамина раствор в воде выдерживали 1 ч для обмена лабильного дейтерия и снимали масс-спектр.

(б) Смесь солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (13 мг) выдерживали в атмосфере газообразного дейтерия (давление 400 гПа) в течение 30 мин при 190°C. Затем обрабатывали, как описано выше.

Использование солянокислого дофамина

(а) Готовили раствор солянокислого дофамина (5.0 мг) в дейтериевой воде (1 мл). Раствор (50 мкл) помещали в ампулу и разбавляли 200 мкл дейтериевой воды. Ампулу заполняли аргоном, запаивали и грели в термостате при 150–210°C в течение 30–60 мин. Затем обрабатывали, как описано выше.

(б) Готовили раствор солянокислого дофамина (5.0 мг) в дейтериевой воде (1 мл). Раствор (50 мкл) помещали в ампулу и разбавляли 200 мкл дейтериевой воды, содержащей трифторуксусную кислоту (TFA). Конечное соотношение дейтериевая вода–TFA составило 10 : 1. Ампулу заполняли аргоном, запаивали и грели в термостате при 190 или 210°C в течение 30 мин. Затем обрабатывали, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Устойчивость солянокислого дофамина оказалась относительно высокой (табл. 1). Выход был приемлемым даже при температуре выше 200°C. По масс-спектрометрическим данным, включение дейтерия в алифатическую часть дофамина было примерно в два раза ниже, чем в ароматическую.

Необходимо отметить, что при увеличении температуры на 20°C, со 150 до 170°C, включение дейтерия и выход дофамина не сильно отличались. В то же время при увеличении температуры со 170 до 190°C изотопный обмен существенно возрастал. При нагревании еще на 20°C, со 190 до 210°C, рост включения дейтерия замедлялся. По-видимому, это связано с тем, что более подвижные протоны в дофамине находятся в ароматическом кольце. Поэтому, начиная с определенной температуры, включение дейтерия в кольцо заметно возрастало и достигало равновесных значений для данного соединения. Дальнейший рост температуры мало сказывался на изотопном обмене и в большей степени способствовал только деградации дофамина.

При использовании TFA или предварительно насыщенной дейтерием смеси солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20), удалось активировать изотопный обмен (табл. 2). Для достоверной оценки эффективности изотопного обмена при сравнении этих двух методик запаянные ампулы с разным составом реакционной среды одновременно грели при 190°C в течение 30 мин. Ампулы охлаждали до комнатной температуры и анализировали.

Как следует из приведенных данных (табл. 2), использование дейтериевой воды имеет преимущества перед использованием газообразного дейтерия. Интересно отметить, что при использовании дейтериевой воды в ароматическое кольцо включалось 40–50% метки, в то время как при использовании газообразного дейтерия около 28–30%.

При использовании дейтериевой воды или смеси дейтериевая вода–трифторуксусная кислота (соотношение 10: 1) выход [D]дофамина был выше, чем при использовании 5% Pd/Al₂О₃. Но включение дейтерия оказывается больше в присутствии активированного катализатора.

Попытки увеличить изотопный обмен при проведении реакций при 210°C были неудачными: включение дейтерия изменялось незначительно при заметном падении выхода [D]дофамина.

Препаративный синтез [D]дофамина вели со смесью дейтериевой воды и TFA (соотношение 10 : 1) при 190°C в течение 30 мин. В ампулу вносили 50 мг дофамина и 1.5 мл смеси D₂O–TFA. Ампулу заполняли аргоном, запаивали и помещали в термостат. Выход [D]дофамина 65–70%, среднее содержание дейтерия 2.42–2.49 атомов.

Препаративный синтез [D]дофамина реакцией со смесью солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20) вели (после часового выдерживания в атмосфере дейтерия) в 1.5 мл D₂O при 190°C в течение 30 мин. Выход [D]дофамина составлял 35–40% при среднем содержании 3.50–3.60 атомов дейтерия. Более низкий выход [D]дофамина при использовании смеси солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20), по-видимому, связан с тем, что устойчивость дофамина выше в растворе с TFA, чем в нейтральной среде.

Анализ методом ВЭЖХ показал, что при использовании смеси дейтериевой воды и трифторуксусной кислоты не только выход [D]дофамина выше, но и реакционная смесь содержит меньше побочных продуктов, чем при использовании 5% Pd/Al₂О₃ (рис. 1).

 

Рис. 1. Анализ на хроматографе Милихром А-02 реакционной смеси после проведения препаративных опытов (первый пик – дофамин): а – активация изотопного обмена TFA; б – активация изотопного обмена 5% Pd/Al2О3.

 

Содержание изотопомеров в дофамине после препаративных опытов с дейтериевой водой приведено на рис. 2.

 

Рис. 2. Изотопомеры в [D]дофамине после проведения препаративных опытов: а – активация изотопного обмена TFA; б – активация изотопного обмена 5% Pd/Al2О3.

 

Как видно из приведенных данных (рис. 2), при использовании обеих методик содержание изотопомера дофамина без дейтерия было небольшим, что важно для масс-спектрометрического анализа.

Фрагментация молекулярных пиков показала, что в ароматическое кольцо дофамина при активации изотопного обмена TFA включается около 70–75% дейтерия. При активации изотопного обмена 5% Pd/Al₂О₃ – около 39–43% дейтерия. Видно, что при использовании методики с 5% Pd/Al₂О₃ включение метки происходит более равномерно. При активации TFA метка преимущественно включается в ароматическое кольцо дофамина.

В целом можно разделить работу на несколько этапов.

Реакции с дейтериевой водой позволяют представить изначальную эффективность изотопного обмена данного соединения в зависимости от температуры и времени проведения реакции. Определяли, насколько легко ввести дейтерий в данное соединение изотопным обменом. Оказалось, что наиболее эффективно метка включается при температуре около 190°C (табл. 1). Дальнейшее исследование проводили с учетом этих данных. Сравнение твердофазного изотопного обмена, когда используется газообразный дейтерий и реакцию проводят без растворителя, с жидкофазным изотопным обменом с использованием растворителя приведено в табл. 2. Смесь солянокислый дофамин-5% Pd/Al₂О₃–Al₂О₃ (1 : 5 : 20) можно было и обработать D₂ при 190 °C, и насытить D₂ при комнатной температуре с последущей реакцией с D₂O при 190°C. При этом оказалось, что даже при температуре, когда выход меченого дофамина составлял всего 2%, включение дейтерия в дофамин при использовании твердофазного изотопного обмена было меньше, чем при изотопном обмене с D₂O. Таким образом, было установлено, что в данном случае новая методика более предпочтительна для введения дейтерия в дофамин.

Данная работа подтвердила связь между повышением эффективности изотопного обмена дофамина с D₂O и предварительной обработкой дофамина активированными частицами дейтерия (D⁺, ē), образовавшимися при взаимодействии газообразного дейтерия с катализатором [5]. Здесь еще раз нужно подчеркнуть большую роль, которую играет связка катион дейтерия–электрон [9–13]. По-видимому, это связано с тем, что генерируемые катализатором частицы D⁺, ē более эффективны при образовании кислоты Бренстеда, чем частицы D⁺ из кислот. А кислотные центры Бренстеда понижают активационный барьер при взаимодействии изотопов водорода с С–Н группами вещества, что повышает вероятность изотопного обмена. Для того, чтобы убедиться в этом, провели изотопный обмен дофамина с D₂O–TFA (10 : 1). Результат приведен в табл. 2. Включение метки при этом упало на треть.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

В. П. Шевченко

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» (НИЦ “Курчатовский институт”)

Email: nagaev.img@yandex.ru
Россия, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2

И. Ю. Нагаев

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» (НИЦ “Курчатовский институт”)

Автор, ответственный за переписку.
Email: nagaev.img@yandex.ru
Россия, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2

Н. Ф. Мясоедов

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» (НИЦ “Курчатовский институт”)

Email: nagaev.img@yandex.ru
Россия, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы