Amino acid substitution patterns in the E6 and E7 Proteins of HPV type 16: Phylogeography and Evolution

全文:

Сокращения:

АК-замены – замены аминокислотных остатков; ВПЧ – вирус папилломы человека; РШМ – рак шейки матки.

 

Вирус папилломы человека (ВПЧ) – ДНК-содержащий вирус диаметром 45‒55 нм, семейства Papillomaviridae. На сегодняшний день известно более 200 штаммов папилломавирусов, патогенных для человека, которые можно разделить на три основные группы по степени онкогенного риска [1]:

• ‒ неонкогенные типы (1, 2, 3 и 5);
• ‒ типы низкого канцерогенного риска (6, 11, 42, 43 и 44);
• ‒ типы высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82).

Штаммы ВПЧ высокого канцерогенного риска относятся к основным этиологическим агентам развития рака шейки матки (РШМ), а также других злокачественных новообразований: ротоглотки, полового члена, анальной области, вульвы и влагалища [2]. Продукты трансляции ранних генов: онкобелки Е5, E6 и E7 ‒ вовлечены в пролиферацию и малигнизацию инфицированных клеток.

Белок E6 принимает непосредственное участие в трансформации инфицированных клеток в неопластические. Он ингибирует остановку клеточного цикла и апоптоз путем блокады активности главного онкосупрессора – белка р53, ‒ способствует потере полярности клеток и инициирует гиперплазию [3]. Белок E6 также подавляет интерфероновый ответ организма через взаимодействие с IRF3 (interferon regulatory factor 3) [4].

Онкобелок E7 способствует дестабилизации генома и накоплению хромосомных альтераций. Взаимодействие белка E7 с IRF1 (interferon regulatory factor 1) приводит к уклонению инфицированных клеток от интерферонового ответа иммунной системы организма и тем самым поддерживает длительную персистенцию ВПЧ [5], что считается ведущим звеном в ВПЧ-ассоциированном канцерогенезе. Также белок E7 ингибирует один из главных онкосупрессоров – белок RB1 (retinoblastoma 1), ‒ способствуя бесконтрольному делению инфицированных клеток [6].

В отличие от капсидных белков L1 и L2, онкобелки E6 и E7 высококонсервативны [7]. Тем не менее, согласно ряду исследований, определенные аминокислотные замены (АК-замены) в этих белках ассоциированы с хронической персистенцией ВПЧ и последующей малигнизацией инфицированных клеток [8‒10].

В силу их роли в ВПЧ-ассоциированном канцерогенезе онкобелки E6 и E7 рассматривают как основу для разработки терапевтических вакцин против ВПЧ высокого канцерогенного риска, поэтому большое значение имеет информация относительно их вариабельности и ее определяющих параметрах.

Нами проведен анализ глобальной изменчивости первичной структуры онкобелков E6 и E7 ВПЧ типа 16 (ВПЧ16) и направлений их эволюции с привязкой к основным географическим регионам мира. Выбор ВПЧ16 обусловлен тем, что он превалирует среди генотипов высокого канцерогенного риска и ассоциирован с развитием ряда злокачественных опухолей. Кроме того, полногеномные последовательности ВПЧ16 широко представлены в международных базах данных, что важно для корректного филогенетического анализа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Отбор образцов из баз данных. Из международной базы GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) 6 октября 2022 года были выгружены все имеющиеся на тот момент фрагменты генома ВПЧ16, кодирующие белки E6 и E7. С использованием программы MEGA11 (https://www.megasoftware.net/) были отобраны образцы, содержащие полную нуклеотидную последовательность в пределах хотя бы одной из двух интересующих нас рамок считывания (ORF). Полученные после выборки и выравнивания нуклеотидные последовательности были переведены в аминокислотные в программе MEGA11. Оценку стабильности генома проводили на основе сравнения с референсными последовательностями белков E6 и E7 ВПЧ16: NP_041325.1 (GeneID: 1489078) и NP_041326.1 (GeneID: 1489079) соответственно.

Филогенетический анализ. Для выявления популяционноспецифических АК-замен ВПЧ16 из исследуемой выборки были отобраны образцы с известной датой сбора биоматериала и страной происхождения. Всего была выгружена 3 651 последовательность гена E6 и 4 578 последовательностей гена E7. Для филогенетического анализа базы образцов проверяли на избыточность и исключали все последовательности, идентичность которых превышала 99.8%. Для построения филогенетических деревьев для гена E6 было отобрано 356 нуклеотидных последовательности, для E7–143.

Для оценки временного сигнала полученных выборок использовали программу TempEst (https://www.beast.community/tempest). Параметры для расчета модели замен для построения филогенетических деревьев выбирали с помощью программы Jmodeltest 2.1.20 (https://www.mybiosoftware.com/tag/jmodeltest). Оптимальным оказался вариант GTR (General Time Reversible) с Gamma, равным 4. Для построения филогенетического дерева использовали программы из пакета BEAST v1.10.4 (https://www.beast.community/2018-11-14.10.4_released.html). Вначале были сгенерированы тестовые запуски, позволившие на основании AIC-критерия (Akaike Information Criterion) выбрать оптимальный вариант комбинации параметров, а именно: Fixed local clock, Skyline Growth. Длина MCMC (Markov chain Monte Carlo) составила 100 млн генераций. Для дальнейшей визуализации использована программа FigTree-1.4.4 (https://www.mybiosoftware.com/figtree-1-3-1-produce-figures-phylogenetic-trees.html). Выделение кластеров для последующего анализа было основано на принципе гомологии нуклеотидных последовательностей.

Ковариационный анализ. Для анализа ковариаций использовали пакет Fastcov (http://www.yanlilab.github.io/fastcov), а также пакет Biostrings (https://www.doi.org/10.7554/eLife.08932.001).

Данные по локализации В- и Т-клеточных эпитопов белков E6 и E7 были получены из международной базы данных открытого доступа IEDB Analysis Resource (http://www.tools.iedb.org, даты выгрузки – 02.07.2019 и 12.10.2022). Эпитопные карты строили в программе JalView 2.11.14 (https://www.www.jalview.org/).

Статистический анализ. Для выявления статистически значимых различий между группами сравнения применяли двусторонний тест Фишера. Различия считались значимыми при p < 0.05. Анализ проводили с помощью языка R с визуализацией через Rstudio (https://www.posit.co/download/rstudio-desktop/).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика вариабельности онкобелков E6 и E7

В общей сложности нами проанализирована 3 651 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок E6 ВПЧ16, из 29 стран и 4 578 нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок E7, из 23 стран. Все страны оказались распределены по 5 регионам мира: Европе, Африке, Америке, Юго-Западной и Южной Азии, а также Юго-Восточной Азии (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение отобранных образцов последовательностей генов белков E6 и E7 ВПЧ16 по географическим регионам: Европе (серая рамка), Африке (оранжевая рамка), Америке (фиолетовая рамка), Юго-Восточной Азии (зеленая рамка), Южной и Юго-Западной Азии (красная рамка). N ‒ число последовательностей E6 и E7, депонированных в базе GenBank, с указанием представительства отдельных стран в каждом из регионов.

 

Из 158 аминокислотных остатков (а. о.) E6 39 оказались консервативными во всех анализируемых последовательностях, хотя в кодирующих их триплетах нуклеотидов встречались синонимичные замены. В остальных 119 а. о. белка E6 выявлены АК-замены.

Из 99 а. о. E7 43 оказались консервативными (100%) во всех анализируемых последовательностях, при этом в соответствующей им нуклеотидной последовательности встречались синонимичные замены. Остальные 56 кодонов содержали замены нуклеотидов, приводящие к АК-заменам. Частота наиболее распространенных АК-замен в белках E6 и E7 ВПЧ16 представлена на рис. 2а и 2б соответственно.

 

Рис. 2. Изменчивость онкобелков E6 и E7 ВПЧ16. Аминокислотные замены, встречающиеся в >1% последовательностей E6 (а) и E7 (б); распределение образцов по числу АК-замен в обогащенных выборках белка E6 (284 образца из 356 последовательностей) (в) и белка E7 (92 образца из 132 последовательностей) (г). Обогащенные выборки исключали последовательности, идентичность которых превышала 99.8%. Цветовое обозначение числа АК-замен общее для панелей (в) и (г).

 

В 170 из 356 (47.8%) анализируемых образцов E6 выявлено не менее двух АК-замен (рис. 2в). Заметим, что среди последовательностей одновременно с двумя АК-заменами наиболее частым было их сочетание в позициях 21 и 85, а также различные тандемы с аминокислотой валин в позиции 90. Стоит отметить, что сочетание замен в позициях 85 и 90 встречалось крайне редко. Среди трех и более замен чаще встречалась комбинация Q21H, H85Y и L90V.

Для последовательностей белка E7 подобных сочетаний не выявлено, в большинстве образцов АК-замены были единичные (рис. 2г).

Вариабельность по отдельным географическим регионам

На втором этапе был проведен анализ нуклеотидных последовательностей для выявления географических и/или популяционных особенностей белков E6 и E7 ВПЧ16 на основании образцов, для которых была известна страна и год сбора. Распределение АК-замен в популяции указывало на кластеризацию последовательностей белков E6 и E7 ВПЧ16 по географическому признаку. Выявлено, что характер вариабельности различался в 5 географических группах: страны Европы (EU), Африки (AF), Америки (AM), Юго-Западной и Южной Азии (AS1) и Юго-Восточной Азии (AS2). Значимыми АК-заменами для региона считали те, частота встречаемости которых в данной позиции достоверно превышала таковую в других позициях этой выборки.

Так, в странах Африки (AF) в белке E6 в 52.8% случаев в позиции 90 преобладала замена L→V (p = 0.0306). Частыми в этой географической группе были также замены H85Y (48.6%), E120D (30.3%), Q21D (30.9%) и R17I (23.9%) (p < 0.0001 для всех вариантов; табл. 1, рис. 3).

 

Таблица 1. Частота встречаемости АК-замен в белке E6 изолятов ВПЧ16 из стран Африки (выборка AF, N = 142)

АК-позицияа	АК-заменыb
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
R17	G	9 (6.3%)	I	34 (23.9%)	T	2 (1.4%)
Q21	D	44 (31%)	E	2 (1.4%)	H	9 (6.3%)
A68	G	3 (2.1%)	‒	‒	‒	‒
D71	E	11 (7.7%)	‒	‒	‒	‒
H85	Y	69 (48.6%)	‒	‒	‒	‒
L90	V	75 (52.8%)	‒	‒	‒	‒
E120	D	43 (30.3%)	‒	‒	‒	‒

Здесь и далее: ^аВ качестве референсной аминокислотной последовательности белка E6 выбрана NCBI Reference Sequence NP_041325.1.

^bТаблица не включает АК-замены, встречающиеся один раз. Приведены варианты АК-замен, их число (n) и частота встречаемости (%). АК-замены, встречающиеся в >10% последовательностей, выделены жирным шрифтом.

 

Рис. 3. Тепловые карты встречаемости АК-замен в пяти основных географических регионах мира. Карта распределения частот встречаемости: паттерн АК-замен в белках E6 и E7, цветовая шкала справа отражают частоту встречаемости замены для региона; обведены ячейки с частотой встречаемости >20% (а). Карта значимости АК-замены в белках E6 и E7 для региона при попарном сравнении с частотой встречаемости данной замены в общей популяции. Цветовая шкала справа отражает величину значимости, р. Сравнение проводили с использованием критерия Фишер (б). Тепловые карты сделаны с помощью языка R с визуализацией через Rstudio. Отметка “x” означает отсутствие АК-замены в регионе, поэтому сравнение не проводили.

 

В США и странах Центральной и Южной Америки (AM) наиболее распространенными в белке E6 были замены L90V (46.1%, p = 0.0020), H85Y (15.2%, p = 0.0582), а также Q21H, хотя частота ее встречаемости достоверно не превышала этот показатель в других позициях (11.6%, p = 0.2425; табл. 2, риc. 3).

 

Таблица 2. Частота встречаемости АК-замен в белке E6 изолятов ВПЧ16 из США и стран Центральной и Южной Америки (выборка AM, N = 1 963)

АК-позиция	АК-замены
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3		Вариант 4		Вариант 5
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
M1	L	23 (1.17%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
K4	E	2 (0.1%)	N	1 (0.05%)	Q	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒
T6	P	4 (0.2%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Q10	E	2 (0.1%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R17	G	66 (3.36%)	I	43 (2.2%)	T	19 (0.97%)	‒	‒	‒	‒
K18	T	4 (0.2%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Q21	H	228 (11.6%)	D	66 (3.36%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Q27	R	3 (0.15%)	L	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
H31	N	5 (0.25%)	Y	4 (0.2%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D32	E	27 (1.4%)	N	22 (1.12%)	H	3 (0.15%)	A	1 (0.05%)	G	1 (0.05%)
I34	R	33 (1.68%)	L	10 (0.5%)	T	2 (0.1%)	K	1 (0.05%)	‒	‒
L35	V	3 (0.15%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
E36	Q	18 (0.9%)	K	1 (0.05%)	G	1 (0.05%)	A	1 (0.05%)	‒	‒
R47	H	2 (0.1%)	C	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
E48	K	3 (0.15%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D51	N	6 (0.3%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
I59	V	11 (0.56%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D63	H	1 (0.05%)	Y	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
N65	S	2 (0.1%)	‒	-	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D71	N	6 (0.3%)	E	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
S78	C	5 (0.25%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
H85	Y	298 (15.2%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
L90	V	904 (46.1%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
E120	D	3 (0.15%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
K128	E	2 (0.1%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R136	K	2 (0.1%)	T	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R138	L	2 (0.1%)	-	-	‒	‒	‒	‒	‒	‒
S145	C	1 (0.05%)	F	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
C147	S	2 (0.1%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R148	T	3 (0.15%)	I	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Q157	R	1 (0.05%)	H	1 (0.05%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒

 

В европейских странах (EU) наиболее распространенной была замена L90V, встречавшаяся в 60.6% образцов (p < 0.0001; табл. 3, рис. 3).

 

Таблица 3. Частота встречаемости АК-замен в белке E6 ВПЧ16-изолятов из стран Европы (выборка EU, N = 296)

АК-позиция	АК-замены
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
R5	K	1 (0.3%)	S	1 (0.3%)	T	1 (0.3%)
T6	P	1 (0.3%)	S	1 (0.3%)	‒	‒
Q10	H	1 (0.3%)	E	1 (0.3%)	‒	‒
E14	D	1 (0.3%)	K	1 (0.3%)	‒	‒
R15	P	2 (0.6%)	‒	‒	‒	‒
R17	G	22 (7%)	I	11 (3.7%)	T	2 (0.6%)
Q21	D	17 (6%)	H	8 (2.4%)	‒	‒
D32	E	4 (1.2%)	N	1 (0.3%)	‒	‒
I34	L	1 (0.3%)	R	1 (0.3%)	‒	‒
E36	Q	1 (0.3%)	K	1 (0.3%)	G	1 (0.3%)
H85	Y	26 (8.8%)	‒	‒	‒	‒
L90	V	176 (59.5%)	‒	‒	‒	‒
R131	T	2 (0.6%)	‒	‒	‒	‒

 

В странах Юго-Западной и Южной Азии (AS1) в онкобелке E6 замены L90V, H85Y и Q21H встречались в 73.9, 49.1 и 49.1% образцов соответственно (p <0.0001 для всех вариантов; табл. 4, рис. 3).

В странах Юго-Восточной Азии (AS2) в белке E6 довольно часто встречались замены D32E (46.7%), L90V (20.5%) и E120D (13.5%), а в позиции 29 белка E7 преобладал серин (55%) (p < 0.0001 для всех вариантов; табл. 5, 6; рис. 3).

 

Таблица 4. Частота встречаемости АК-замен в белке E6 ВПЧ-изолятов из стран Юго-Западной и Южной Азии (выборка AS1, N = 230)

АК-позиция	АК-замены
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
D11	H	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
R17	G	8 (3.5%)	‒	‒	‒	‒
Q21	H	113 (49.1%)	D	1 (0.4%)	‒	‒
D32	E	3 (1.3%)	H	1 (0.4%)	N	4 (1.7%)
E48	G	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
A53	G	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
F54	V	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
S78	C	5 (2.2%)	‒	‒	‒	‒
R84	S	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
H85	Y	113 (49.1%)	‒	‒	‒	‒
L90	V	170 (73.9%)	‒	‒	‒	‒
P102	L	2 (0.87%)	A	1 (0.4%)	‒	‒
D105	N	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
L106	V	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
Q114	K	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒
R131	S	1 (0.4%)	T	1 (0.4%)	‒	‒
E155	K	2 (0.87%)	‒	‒	‒	‒

 

Таблица 5. Частота встречаемости АК-замен в белке E6 ВПЧ16-изолятов в странах Юго-Восточной Азии (выборка AS2, N = 750)

АК-позиция	АК-замены
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3		Вариант 4
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
M1	K	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R5	G	22 (2.93%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
M8	R	2 (0.26%)	K	3 (0.4%)	L	1 (0.13%)	‒	‒
Q10	E	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R17	G	5 (0.67%)	I	9 (1.2%)	T	1 (0.13%)	‒	‒
K18	N	1 (0.13%)	Q	1 (0.13%)	‒	‒	‒	‒
L19	F	1 (0.13%)	V	1 (0.13%)	‒	‒	‒	‒
Q21	H	22 (2.93%)	D	9 (1.2%)	‒	‒	‒	‒
T29	S	3 (0.4%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D32	E	350 (46.67%)	H	1 (0.13%)	N	8 (1.07%)	Y	1 (0.13%)
I34	R	5 (0.67%)	L	2 (0.26%)	T	2 (0.26%)	M	2 (0.26%)
L35	V	9 (1.2%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
E36	Q	6 (0.8%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R46	Q	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D51	E	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R62	K	4 (0.53%)	I	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒
N65	S	28 (3.7%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
P66	A	2 (0.26%)	S	1 (0.13%)	‒	‒	‒	‒
D71	N	1 (0.13%)	E	6 (0.8%)	‒	‒	‒	‒
F76	L	3 (0.4%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
H85	Y	41 (5.5%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
L90	V	154 (20.5%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D105	H	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
N112	Y	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
C118	G	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
E120	D	101 (13.5%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R151	T	2 (0.26%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒

 

Таблица 6. Частота встречаемости АК-замен в белке E7 ВПЧ-изолятов в различных регионах мира

АК-позицияa	АК-заменыb
	Вариант 1		Вариант 2		Вариант 3		Вариант 4
	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)	АК	n (%)
Африканская группа (AF, N = 2)
N29	S	1 (50%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Американская группа (AM, N = 3263)
D4	N	2 (0.06%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
N29	S	133 (4.1%)	P	1 (0.03%)	H	1 (0.03%)	‒	‒
E33	K	3 (0.09%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
A42	T	2 (0.06%)	V	1 (0.03%)	‒	‒	‒	‒
H51	R	1 (0.03%)	N	13 (0.4%)	‒	‒	‒	‒
D62	H	1 (0.03%)	N	1 (0.03%)	‒	‒	‒	‒
R77	C	2 (0.06%)	G	1 (0.03%)	S	1 (0.03%)	‒	‒
P92	L	2 (0.06%)	S	1 (0.03%)	‒	‒	‒	‒
Европейская группа (EU, N = 242)
N29	S	11 (4.5%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
D75	N	2 (0.83%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Азиатская группа 1 типа (AS1, N = 129)
L15	S	2 (1.6%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
T20	S	2 (1.6%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
G88	R	10 (7.8%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
I93	T	2 (1.6%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
C94	S	2 (1.6%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Азиатская группа 2 типа (AS2, N = 656)
D14	H	2 (0.3%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
L28	F	29 (4.4%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
N29	S	361 (55%)	H	20 (3%)	D	1 (0.15%)	T	1 (0.15%)
D39	N	1 (0.15%)	H	1 (0.15%)	‒	‒	‒	‒
H51	N	2 (0.3%)	Y	1 (0.15%)	‒	‒	‒	‒
S63	A	2 (0.3%)	F	6 (0.9%)	‒	‒	‒	‒
D75	Y	2 (0.3%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
R77	C	17 (2.6%)	L	1 (0.15%)	H	1 (0.15%)	‒	‒
G88	Q	1 (0.15%)	E	1 (0.15%)	R	1 (0.15%)	‒	‒
P92	S	2 (0.3%)	‒	‒	‒	‒	‒	‒
Q96	R	1 (0.15%)	H	1 (0.15%)	‒	‒	‒	‒

^аВ качестве референсной аминокислотной последовательности белка E7 выбрана NCBI Reference Sequence NP_041326.1.

^bТаблица не включает АК-замены, встречающиеся один раз. Приведены варианты АК-замен, их число (n) и частота встречаемости (%). АК-замены, встречающиеся в >10% последовательностей, выделены жирным шрифтом.

 

При анализе полученных данных замечено, что в разных регионах в одних и тех же позициях встречаются различные аминокислоты. Так, в белке E6 в африканской группе, а также в странах Юго-Восточной Азии в позиции 17 преобладала АК-замена R17I, в то время как в американской и европейской группах – R17G. В странах Юго-Западной и Южной Азии в этой позиции встречался только вариант R17G (табл. 1‒5).

Аналогично для позиции 21 белка E6 в африканской и европейской группе преобладала АК-замена Q21D, в то время как в Америке (AM) и Азии (AS1 и AS2) – Q21H (табл. 1‒5).

Следует заметить, что при сравнении частот встречаемости наиболее значимых замен по регионам замена N29S в белке E7, широко представленная в AS2-регионе (55%), обнаружена также в американской и европейской группах (4.1 и 4.5% образцов соответственно; табл. 6), в то время как в регионе AS1, расположенном географически намного ближе к AS2, эта замена не встречалась вообще. Это позволяет предположить, что некоторые АК-замены в региональных образцах ВПЧ16 могут быть связаны с глобальными процессами миграции населения.

Частота встречаемости АК-замен значительно различалась внутри регионов (табл. 1‒6). Региональное распределение замен проиллюстрировано на рис. 4, анализ частот распространения замен в регионах ‒ тепловыми картами на рис. 3 (см. также табл. S1, рис. S1, рис. S2, Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/4/supp_Zelenova_rus.pdf, а также доступны по DOI: S0026898424040036). В белке E6 ВПЧ16 замена R17I достоверно чаще встречалась в AF-выборке (р < 0.0001), Q21H – в AS1, Q21D – в AF (по сравнению с другими выборками p < 0.0001; рис. 3, рис. 4). Замена D32Е чаще всего встречалась в группе AS2, частоты ее встречаемости в других выборках не различались. Замена H85Y была одинаково распространена в группах AF и AS1, немного реже в выборке AM и достоверно реже в EU и AS2. Замена L90V была широко распространена во всех выборках, кроме AS2. Замена E120D была характерна только для изолятов AF и AS2 (рис. 3). Анализ региональных выборок последовательностей высококонсервативного белка E7 выявил высокую частоту встречаемости замены N29S в выборке AS2, причем достоверно чаще, чем в AM и EU; в то время как в группе AS1 эта замена не обнаружена (рис. 3, рис. 4). Замена G88R в белке E7 наблюдалась только в выборках AS2 и АS1, причем в AS1 чаще, чем в AS2 (р < 0.0001; рис. 3, рис. 4).

 

Рис. 4. Распределение АK-замен, встречающихся в >10% последовательностей выборок по пяти географическим регионам, включая АК-замены в отдельных странах. Фиолетовый блок – США, страны Центральной и Южной Америки; синий блок – страны Европы; оранжевый блок – страны Африки; красный блок – страны Юго-Западной и Южной Азии; зеленый блок – страны Юго-Восточной Азии.

 

Распределение образцов белка E6 ВПЧ16 внутри одного региона отличалось неравномерностью (характерно для AM, AF, EU). Несмотря на это, сравнение спектров АК-замен в стране, лидирующей по числу образцов, и в других странах каждого из этих регионов достоверно значимых различий не выявило. Заметим, что для ряда стран, в том числе с немногочисленной выборкой, в дополнение к регионспецифичным АК-заменам находили 1‒2 уникальные (табл. 7, рис. 3).

 

Таблица 7. Распределение АК-замен в белках E6 и E7 в отдельных странах^*

Страна	Варианты АК-замен в белке E6		Варианты АК-замен в белке E7
	АК	n (%)	АК	n (%)
Регион AS1			G88R	10 (7.8%)
Индия (N = 46)			G88R	10 (21.7%) p < 0.0001
Регион AM	D32N	22 (1.12%)
Гватемала (N = 78)	D32N	11 (14.1%) р < 0.0001
Регион AS2			L28F	29 (4.4%)
Япония (N = 150)			L28F	26 (17.3%) р < 0.0001
Регион AS2	N65S	28 (3.7%)
Индонезия (N = 40)	N65S	13 (32.5%) р < 0.0001
Регион AS2	R5G H85Y	22 (2.93%) 41 (5.5%)
Вьетнам (N = 91)	R5G H85Y	18 (19.7%) р < 0.0001 10 (10.9%) р = 0.0233
Регион AS2	D32E L90V	350 (46.67%) 154 (20.5%)	N29S	361 (55%)
Китай, центральные и восточные регионы (N = 154)			N29S	115 (74.7%)
Китай, юго-западный регион (N = 47)			N29S	25 (53.6%)
Китай, северный регион (E6 N = 46) (E7 N = 50)	D32E L90V	2 (4.3%) 36 (78.2%)	N29S	3 (6%)

*Указаны АК-замены, уникальные для страны в сравнении с регионом. По умолчанию все остальные АК-замены в указанной стране встречаются с той же частотой, что и в других странах данного региона (пустая строка).

 

Различия в частоте распространения АК-замен обнаружены и между отдельными провинциями Китая. Так, в центральных и восточных преобладали замены, характерные для региона AS2 (N29S), с минимальной представленностью замены L90V. Для северо-западных провинций паттерн АК-замен оказался близким к европейскому: высокая частота L90V с низкой встречаемостью “азиатской” N29S (рис. 4, табл. 7). В целом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о циркуляции в различных географических локациях регионспецифичных вариантов ВПЧ16, различающихся по паттернам АК-замен в онкобелках E6 и E7.

Ковариационный анализ нуклеотидных и аминокислотных замен

Присутствие АК-замен в определенных сочетаниях позволяет предположить наличие ковариационных связей (сцепления) между аминокислотными остатками и/или кодирующими их нуклеотидами. Для проверки этой гипотезы проведен ковариационный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей E6 и E7.

При анализе выборки из 356 нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок E6 ВПЧ16, выявлено два паттерна сцепления четырех нуклеотидов: 63T-204A-207G-253T с вероятностью 0.9312 и 63G-204T-207A-253C с вероятностью 0.9795 (этот паттерн входит в состав референсной последовательности). Замены нуклеотидов в позициях 204 и 207 были синонимичными. Замена нуклеотидов G63T определяла две самые встречаемые АК-замены в позиции 21: Q21H и Q21D, ‒ а замена 253 нуклеотида – одну из распространенных АК-замен – H85Y. На основании вышеизложенного можно предположить сцепление аминокислотных остатков в позициях 21 и 85. Однако анализ ковариаций полного набора аминокислотных последовательностей белка E6 не подтвердил наличия групп сцепления по отдельным АК-заменам, в частности в положениях 21 и 85; сцепленность сохранилась только на уровне E6-кодирующей ДНК.

При проведении анализа ковариаций для полной выборки нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок E6, помимо двух вышеописанных паттернов выявлены еще два дополнительных ‒ со сцеплением трех нуклеотидов: 50G-61C-321A с вероятностью 0.9937 (этот паттерн входит в состав референсной последовательности) и 50T-61G-321G с вероятностью 0.8377. Важно заметить, что сцепленность зарегистрирована на уровне исключительно нуклеотидной последовательности (для аминокислот ковариаций не выявлено).

Анализ ковариаций выполнен также для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей E7 ВПЧ16. В результате не выявлено групп сцепления ни по нуклеотидным, ни по отдельным АК-заменам.

Анализ проводили на всех образцах ‒ без разделения по регионам мира. Отсутствие групп сцепления может быть обусловлено различиями в сцеплениях между отдельными региональными выборками, с потерей достоверности сцеплений при объединении выборок. Для проверки этой гипотезы мы провели анализ ковариации (сцеплений) отдельно для каждой из 5 выборок (страны Европы, Африки, Америки, Юго-Западной и Южной Азии и Юго-Восточной Азии). Анализ проводили с использованием второго биоинформатического метода (пакет Biostrings) с калькулятором MI (http://www.yanlilab.github.io/fastcov). Для образцов E6 американского происхождения (выборка AM) выявлена ковариация аминокислотных остатков в позициях 17, 21, 85 и 90 (рис. 5). Интересно отметить, что сцепленными оказались 4 из 6 вариабельных позиций E6 (рис. 2а, табл. 2).

 

Рис. 5. Ковариационный анализ АК-замен белка E6 для образцов американского региона (АМ). Анализ проведен с использованием второго биоинформатического метода с применением пакета Biostrings с калькулятором MI (http://www.yanlilab.github.io/fastcov). В окружностях указаны позиции аминокислотных остатков, линии между ними – сцепление двух АК-замен, вероятность сцепления между которыми p < 0.05 (MI).

 

Таким образом, хотя в целом по всей выборке позиции подверженных заменам аминокислотных остатков в составе как E6, так и E7 не сцеплены между собой, при ограничении выборки одним географическим регионом удалось выявить сцепление аминокислотных остатков в 4 из 6 вариабельных позиций белка E6.

Реконструкция истории возникновения и последующего распространения вариантов гена E6, приводящих к АК-заменам в белке E6

Для реконструкции истории возникновения и последующего распространения АК-замен ВПЧ16 был проведен филогенетический анализ 356 нуклеотидных последовательностей гена E6 (рис. 6). Из анализа были исключены все последовательности, идентичность которых превышала 99.8%. Аналогичное исследование предполагалось выполнить и для гена E7, однако из-за высокой гомологии последовательностей временнóй сигнал не был зарегистрирован. Принцип кластеризации заключался в выделении отдельных клад на основании близости нуклеотидных последовательностей (традиционный принцип сродства последовательностей) с добавлением принципа географического единства после завершения построения дерева (“разрезание дерева”) для интерпретации полученных результатов.

 

Рис. 6. Филогенетическое дерево с использованием байесовского подхода с временнóй шкалой для последовательностей гена E6, длина фрагмента – 477 п. н. (координаты по эталонному образцу NC_001526.4:7125–7601). Для каждой последовательности указан номер в базе данных GenBank, страна и год выделения. В узлах дерева приведены аминокислотные остатки, предсказанные для гипотетического предка каждой филогруппы. Обозначения: EU – страны Европы, AF – страны Африки, AM – страны Америки, AS1 – страны Юго-Западной и Южной Азии, AS2 – страны Юго-Восточной Азии.

 

Рис. 6. Продолжение.

 

Рис. 6. Продолжение.

 

Рис. 6. Продолжение.

 

Рис. 6. Окончание.

 

В ходе анализа установлено, что общий предок известных современных вариантов ВПЧ16 имеет американское происхождение и к настоящему моменту разделился на 9 кластеров (рис. 6, табл. 8), различающихся филогенетически и/или по региону циркуляции. Первое крупное разделение на две принципиально разные ветви (группа образцов, отходящая от узла на основании возникновения ключевой замены нуклеотидов) произошло только в 1840–1850 гг. (HPD 95%: 1702‒1948 гг.).

 

Таблица 8. Кластеризация изолятов E6*

Позиция

Кластер I N = 93

Кластер II N = 77

Кластер III N = 17

Кластер IV N = 17

Кластер V N = 53

Кластер VI N = 13

Кластер VII N = 28

Кластер VIII N = 47

Кластер IX N = 4

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

АК

n (%)

М1

‒

‒

‒

‒

‒

‒

L

7 (25%)

‒

‒

R17

T G

1 (1.1%) 1 (1.1%)

G

2 (2.6%)

‒

G

4 (23.5%)

‒

I

1 (7.7%)

T I G

5 (17.9%) 3 (10.7%) 1 (3.6%)

‒

‒

Q21

H

1 (1.1%)

E

1 (1.3%)

‒

‒

‒

D H

1 (7.7%) 1 (7.7%)

D H E

24 (85.7%) 4 (14.3%) 1 (3.6%)

H D

40 (85.1%) 1 (2.1%)

H

1 (25%)

D32

E N H

42 (45.2%) 1 (1.1%) 2 (2.2%)

A

1 (1.3%)

‒

‒

N H

2 (3.8%) 1 (1.9%)

‒

‒

E N G

3 (6.4%) 1 (2.1%) 1 (2.1%)

‒

H85

‒

‒

‒

Y

1 (5.9%)

‒

Y

9 (69%)

Y

28 (100%)

Y

44 (93.6%)

Y

4 (100%)

L90

‒

V

2 (2.6%)

V

15 (88.2%)

V

17 (100%)

V

52 (98%)

‒

V

3 (10.7%)

V

43 (91.5%)

‒

E120

‒

‒

‒

‒

‒

D

1 (7.7%)

‒

‒

‒

*Указано число образцов (N) в каждом кластере, варианты замен (АК), их число (n) и частота встречаемости (%). АК-замены, встречающиеся в >10% последовательностей выделены жирным шрифтом.

 

Первая ветвь, преимущественно американской выборки в 1880–1890 гг. (HPD 95%: 1796–1965 гг.), разделилась на 2 группы, при этом в каждой из них с интервалом примерно в 30 лет произошло независимое отделение африканских линий: в 1895 году (HPD 95%: 1852–1973 гг.) и в 1925 году (HPD 95%: 1873–1979 гг.) (рис. 6, кластеры VII и IX соответственно). Это разделение на клады (конечная группа образцов, не подлежащая дальнейшему делению, объединенная на основании максимального сходства нуклеотидной последовательности) подтвердили при оценке состава АК-замен в данных группах: для кластера IX это H85Y, в то время как изоляты кластера VII, кроме вышеуказанной, несут дополнительную ‒ Q21D (табл. 8). Важно подчеркнуть, что изоляты этих кластеров сформировались в результате независимой эволюции ВПЧ16 разных линий. Интересны первичные структуры анализируемого фрагмента белка E6 из кластера VIII, в котором большинство образцов содержит более одной АК-замены, при этом наиболее часто встречается сочетание трех замен: Q21H-H85Y-L90V (табл. 8; рис. 6, кластер VIII). Описывая эволюцию образцов ВПЧ16 первой ветви, стоит также заметить, что в дальнейшем из разных линий исходной американской группы со схожим набором АК-замен (Q21H, H85Y, L90V) примерно в 1950 году произошло одновременное выделение двух групп AS1 в кластере V и кластере VIII (HPD 95%: 1917–1984 гг. и 1930–1983 гг.) (рис. 6).

Для изолятов второй ветви, образованной от общего предка в 1840–1850 гг., характерна более четкая кластеризация по географическому признаку (рис. 6). Обращает внимание раннее выделение небольшой группы китайского происхождения из 7 образцов в 1905–1910 гг. (HPD 95%: 1822–1972 гг.) (рис. 6, кластер VI), что может быть обусловлено завозом штаммов ВПЧ16 из Китая и дальнейшим распространением в американской популяции. Эта гипотеза подтверждена при анализе аминокислотного состава этой группы изолятов, а именно сохранением замены H85Y; в то время как в большинстве образцов, происходящих от второй ветви, произошла реверсивная замена. В отличие от H85Y, замена L90V, возникшая еще у гипотетического предка, сохранилась как в американском, так и в азиатском кластере, что позволяет считать ее не связанной с этносом.

Также в 1920 году (HPD 95%: 1860–1975 гг.) произошло знаковое разделение изолятов второй ветви, что сопровождалось изменением аминокислотного состава – появлением L90V вне зависимости от географического распределения. Позднее, в 1930 году (HPD 95%: 1893–1978 гг.), произошло выделение группы AS2 (рис. 6). Примерно в это же время, в 1930 г. (HPD 95%: 1943–1964 гг.), среди обширной группы изолятов ВПЧ16 с белком E6 без замены L90V четко выделилась группа AS2 с группоспецифической заменой D32E и американская ветвь (рис. 6, кластеры I и II).

Параллельно с этим, среди изолятов, происходящих от общего предка с АК-заменой L90V, в 1930‒1940 гг. (HPD 95%: 1894–1979 гг.) произошло четкое разделение на образцы американской группы и азиатской типа 2 (рис. 6, кластеры III и V). Как и среди изолятов первой ветви, из образцов американского происхождения второй ветви в 1950 году отделилась группа AS2 (рис. 6, кластер V). Примерно в это же время отделилась и европейская группа (HPD 95%: 1967–1969 гг.; рис. 6, кластер IV).

Описываемая нами эволюция ВПЧ16 на основе анализа фрагмента его генома, кодирующего белок E6, включает относительно небольшой временнóй интервал ‒ продолжительностью всего 150 лет. По результатам исследования, АК-замена H85Y филогенетически оказалась самой древней, а скорость накопления АК-замен в исследованном фрагменте генома ВПЧ16 составляла 10^‒5 замен на сайт в год. Основные АК-замены в белке E6 штаммов ВПЧ16, циркулирующих в человеческой популяции на современном этапе, возникли в течение последних 50 лет; причем самая “молодая” ‒ F76L, обнаруженная в китайских изолятах конца XX века (1990 год, HPD 95%: 1966–2016 гг.).

Аминокислотные замены в белках E6 и E7 ВПЧ16 и противовирусный иммунный ответ

Различия в вариантах E6 и E7 ВПЧ16, циркулирующих в различных географических регионах (рис. 2), а также реверсии АК-замен при переходе ВПЧ16 в другой географический регион (рис. 6) могут быть связаны с этническими особенностями населения, в частности с различиями в экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA) и их аллелей. Последние ассоциированы с различной специфичностью В- и Т-клеточного противовирусного иммунного ответа. Это приводит к селекции различных вариантов вируса в той или иной человеческой популяции, которые успешно избегают иммунного ответа хозяина.

 

Рис. 7. Фрагменты эпитопной карты онкобелка E6. Представлены фрагменты 17‒32 (а), 65‒90 (б), 119‒123 (в) аминокислотной последовательности. Выборка включала последовательности, идентичность которых превышала 99.8%. Желтым цветом обозначены идентификационные номера (ID) эпитопов в базе данных IEDB (http://www.tools.iedb.org), светло-желтым – последовательность картированного эпитопа, цифры внутри блока – позиции первых и последних аминокислотных остатков. В рамке внизу каждого блока указаны частоты встречаемости АК-замен в вариабельной позиции белка E6 в составе эпитопного кластера. Цифры внизу ‒ суммарное число эпитопов, затрагиваемых АК-заменами в указанных позициях.

 

Для проверки этой гипотезы выполнено картирование эпитопов E6 и E7, взятых из международной базы данных открытого доступа. Для онкобелка E6 ВПЧ16 описано 126 эпитопов, для E7 – 142. В ходе анализа установлено, что практически все значимые АК-замены, описанные выше, входят в состав более 10 эпитопов (рис. 7, 8).

 

Рис. 8. Эпитопная карта онкобелка E7. Представлены фрагменты 28‒51 (а) и 52‒99 (б) аминокислотной последовательности. Выборка включала последовательности, идентичность которых превышала 99.8%. Желтым цветом обозначены идентификационные номера (ID) эпитопов в базе данных IEDB, светло-желтым – последовательность картированного эпитопа, цифры внутри блока – позиции первых и последних аминокислотных остатков. В рамке внизу каждого блока указаны частоты встречаемости АК-замен в вариабельной позиции белка E7 в составе эпитопного кластера. Цифры внизу ‒ суммарное число эпитопов, затрагиваемых АК-заменами в указанных позициях.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что распространенность генотипов ВПЧ в разных регионах мира варьирует. В настоящее время условно выделяют “европейские” типы ВПЧ (16, 18, 31, 33, 45 и др.) и “азиатские” (52, 58, 59, 65 и др.) [11]. В результате секвенирования геномов ВПЧ выявлены популяционные различия даже внутри одного генотипа вируса. В литературе описано 4 генотипические группы ВПЧ16: A, B, C и D [12], а также подгруппы А1‒4, В1‒2, С и D1‒3, различающиеся по последовательности капсидного белка L1. Интересно, что эти подгруппы имеют четкую региональную представленность [13]. Вышеописанную классификацию активно используют в фундаментальных и прикладных научных исследованиях, так как именно на белках капсида основаны разработки профилактических ВПЧ-вакцин [14].

В проведенном нами исследовании акцент сделан на онкобелках E6 и E7 ВПЧ16. По сравнению с капсидными, белки E6 и E7 отличаются большей консервативностью. Именно эти вирусные белки реализуют канцерогенный потенциал вируса [7], который зависит, в том числе, от их первичной структуры и со временем появляющихся мутаций [8‒10]. Именно с этими особенностями белков E6 и E7 связан тот факт, что секвенирование и филогенетический анализ этих фрагментов генома ВПЧ сфокусированы в основном на выявлении корреляций между полиморфизмами в генах E6 и E7, частотой случаев хронической персистенции вируса и последующей малигнизацией. И хотя полногеномные исследования ВПЧ проводят во многих странах, до сих пор не было сравнительного анализа выявленных вариаций в первичной структуре вирусных онкобелков по разным географическим регионам.

Нами проведен анализ результатов многочисленных исследований и идентифицированы АК-замены в белках ВПЧ16, характерные для различных регионов мира. Важно отметить, что ген E6 имеет два старт-кодона (AUG) и две открытые рамки считывания: 1) ORF-E6(1) между нуклеотидами 83 и 559, которая кодирует белок длиной 158 а. о.; и 2) ORF-E6(2) между нуклеотидами 104 и 559, которая кодирует белок, состоящий из 151 а. о. По сравнению с AUG в позиции 104‒106 старт-кодон в позиции 83 слабее, так как в его последовательности Козак отсутствует пурин в положении −3 AUG и G в позиции +4 AUG, что ослабляет связывание мРНК E6 рибосомой. В силу этого старт-кодон AUG в позиции 83 реже используется для инициации трансляции, поэтому преимущественно синтезируется белок длиной 151 а. о. [15]. Тем не менее обе формы белка E6 активно изучают, в связи с чем нумерация остатков может различаться. Например, замена R17G может быть представлена как R20G, L90V ‒ как L83V и т. д., что осложняет анализ последовательностей. В проведенном исследовании в качестве референсной мы использовали нуклеотидную последовательность гена E6 ВПЧ16 (NC_001526, GeneID: 1489078) и белковый продукт, кодируемый ORF-E6(1) (83‒559 н.), то есть длиной 158 а. о.

В результате проведенного филогенетического анализа в белке E6 выявлено 39 консервативных аминокислотных остатка из 158 (24.7%), в то время как в белке E7 доля консервативных остатков была выше: 43 из 99 (43.4%). В исследовании, проведенном в Китае в 2020 году, наглядно продемонстрирована бóльшая вариабельность гена E6 по сравнению с E7 [16].

По нашим данным, замена L90V встречается на всех континентах со средней частотой 44.1% (1 609 из 3 651 образца) и наиболее распространена среди всех выявленных замен. Полученные данные совпадают с результатами научных групп из различных стран. Например, J. Ortiz-Ortiz и др. [17] выявили эту АК-замену во всех 4 группах ВПЧ16 (A, B, C, D) и отнесли ее к самой высокочастотной в белке E6.

V. Ramas и др. [18] анализировали изоляты ВПЧ, выделенные в уругвайской популяции, и идентифицировали замены R17G, Q21H, H85Y, L90V, D105E в онкобелке E6 и H51N в E7. Нами также описаны замены R17G, Q21H, H85Y и L90V в E6 ВПЧ16 из стран Америки и рассчитана частота их встречаемости: 3.4, 11.6, 15.2 и 46.1% соответственно. АК-замена H51N в онкобелке E7, по нашим данным, наиболее часто встречается в странах Америки – 14 из 18 образцов с заменой H51N, при общем числе образцов американского региона 3 263 (0.4%). Образцы из Уругвая не представлены в нашей выборке (ввиду их отсутствия в GenBank); однако, учитывая наличие замены H51N в других странах Америки, нельзя исключать ее присутствие, в том числе статистически значимое, и в Уругвае.

Для европейского региона, по нашим данным, в белке E6 преобладает АК-замена L90V, которая найдена в 61% (175/289) образцов. Полученный показатель совпадает с результатами польских исследователей, S. Szostek и др. [19], которые сообщали о преобладании замены L90V в белке E6 – в 64% (51/80) образцов. D. Tsakogiannis и др. [20] на образцах ВПЧ16, собранных в греческой популяции, выявили высокую частоту замены L90V в белке E6: 78.2% при высокодифференцированных опухолях шейки матки и несколько ниже, 64.2%, при низкодифференцированных. Корректных полногеномных данных секвенирования генов E6 и E7 из стран Западной Европы на сегодняшний день крайне мало, в связи с чем сравнить АК-замены в странах Восточной и Западной Европы на настоящий момент не представляется возможным.

В исследовании J. Zhao и др. [16], проведенном на образцах, собранных на территории Шанхая (Китай), описаны АК-замены H85Y и E120D в белке E6 и N29S в белке E7 и их связь с канцерогенезом (частота выявления данных замен была выше в группе пациенток с дисплазией шейки матки). Результаты проведенного нами анализа подтверждают эти данные: замена N29S в белке E7 широко распространена на территории Китая (57.2%, 210/367 образцов). Что касается замены Е120D в белке E6, нами показано, что она встречается в Юго-Восточной Азии с частотой 13.5% (101/750 образцов), в то время как на территории Китая ‒ всего в 7.9% образцов; при этом замена H85Y вообще не характерна для региона Юго-Восточной Азии ‒ ее наибольшая частота приходится на вьетнамскую популяцию (10.9%) (рис. 4, табл. 7).

В то же время в Синьцзян-Уйгурском автономном районе Китая преобладает европейский вариант ВПЧ16 ‒ с характерной заменой L90V в белке E6 и минимальной представленностью “азиатской” замены N29S в белке E7. Согласно нашим данным, частота “европейской” АК-замены L90V в этом регионе составляет 78.2% (36/46 образцов), а “азиатская” (тип 2) D32E встречается редко (4.3%, 2/46 образцов) (рис. 4, табл. 7). Эти результаты согласуются с данными Н. He и др. [21], полученными при анализе образцов ВПЧ16 из провинции Синьцзян. Преобладание определенных вариантов онкобелков E6 и E7 характерно не только для отдельных провинций Китая, но и для ряда других стран и/или их отдельных областей, в частности в Японии, в странах Африки (рис. 4, табл. 7). Интересно, что эти страны и их отдельные области некоторые исследователи считают моноэтническими [22, 23].

V. Pimenoff с соавт. [13] исследовали эволюции линий (субгенотипов) ВПЧ16, типированных на основании анализа полногеномных последовательностей вируса с последующим типированием на основе гена капсидного белка L Авторы составили карту географического распределения субгенотипов с выделением регионов с доминантным представительством субтипов А1‒3 (Европа), А4 (Юго-Восточная Азия), В и С (Африка), D (Центральная и Южная Америка). Интересно, что эти регионы в целом совпадают с выявленной нами географической распространенностью вариантов белков E6 и E7. В дальнейшем мы планируем идентифицировать ВПЧ16-субгенотипспецифичные паттерны АК-замен в белках E6 и E7.

Анализ встречаемости АК-замен в онкобелках E6 и E7 представляется крайне важным ввиду предположения о связи определенных а. о. с канцерогенезом. Именно поэтому ряд исследований был нацелен на сравнение встречаемости АК-замен при РШМ и хронической персистенции ВПЧ с частотой аналогичных замен в случаях спонтанной элиминации вируса. Таким образом, в настоящее время идет поиск корреляций между наборами АК-замен и течением, а также исходом хронической ВПЧ-инфекции. P. van der Weele с соавт. [24] не выявили в образцах ВПЧ16 из Нидерландов четкой корреляции между полиморфизмами генов E6/E7 и персистенцией вируса и сделали вывод о том, что особенности генома ВПЧ не играют существенной роли в процессе элиминации/хронизации инфекции, а решающий фактор – особенности организма хозяина. Напротив, Noé Escobar-Escamilla и др. [9] продемонстрировали связь замены L90V в белке E6 ВПЧ16 с длительной персистенцией вируса. В Китае с высоким риском малигнизации и развитием РШМ ассоциированы полиморфизмы D32E и H85Y в белке E6 ВПЧ16 [8, 25].

Описанные АК-замены мало затрагивают ключевые структуры белков E6 и E7: два “цинковых пальца”, образованных мотивами CXXC (63‒66, 106‒109, 139‒142 а. о.) и PBM (PDZ-binding motif; 148‒151 а. о.), в белке E6 и ключевые участки в доменах СD2 (22‒26, 31‒32 а. о.) и CD3 (58‒61, 91‒94 а. о.) белка E7 [26]. Эти последовательности необходимы для корректного функционирования онкобелков и, как правило, высококонсервативны. Исключение составил участок 30‒33 а. о. E6, несущий один из четырех мотивов CXXC, затронутый полиморфизмом D32E. Интересно, что в клетках, зараженных in vitro ВПЧ16 с заменой D32E в белке E6, экспрессия р53 была снижена по сравнению с клетками, инфицированными вирусом с E6 дикого типа [8]. Т. Mesplède T и др. [10] показали, что замены R17G, L90V и их сочетание R17G/L90V в онкобелке E6 ВПЧ16 ассоциированы со значимым снижением уровня p53 по сравнению с его экспрессией в клетках, инфицированных ВПЧ16 с E6 дикого типа. Таким образом, хотя большинство полиморфизмов гена E6 не приводит к изменениям в структурно-фунциональных доменах кодируемого белка, некоторые несинонимичные замены все-таки влияют на функционирование E6, как правило, усиливая его онкогенный потенциал. Что касается онкобелка E7, то его неизменная первичная структура, по-видимому, важна для сохранения онкогенных свойств [27].

В этой связи имеет смысл отдельно рассмотреть коэволюционные изменения: когда возникновение АК-замены в определенной позиции стимулирует появление вторичных адаптивных замен в других положениях, что необходимо для сохранения функциональности белка. Коэволюцию выявляют методом ковариационного анализа. Такой анализ, проведенный нами для общей совокупности аминокислотных последовательностей, не позволил выявить наличие ковариационных связей ни в белке E6, ни в E7. Ковариационный паттерн, охватывающий вариабельные позиции 17, 21, 85 и 90 для белка E6, обнаружен только для последовательностей американского происхождения. Возможно, наличие разных паттернов сцепления для генетически отдаленных наборов последовательностей маскирует существующие ковариационные связи. Учитывая это, в дальнейшем мы планируем исследовать наличие групп сцепления аминокислотных остатков на генетически однородных выборках образцов с использованием различных алгоритмов биоинформатической обработки. Успешность такого подхода была продемонстрирована нами ранее при проведении ковариационного анализа АК-замен в белке NS5A вируса гепатита С [28].

Влияние первичной структуры белка на его функции и их изменения в ходе эволюции вполне согласуются с появлением естественных мутаций в белках длительно циркулирующего в человеческой популяции ВПЧ, хотя трудно понять их филогеографию: географические различия распространенности отдельных АК-замен и их сочетаний. Возможно, причина кроется в этнически обусловленных различиях хозяев, например при процессинге вирусных белков и ответе иммунной системы. Уже были сообщения о полиморфизмах системы процессинга антигенов и рецепторов иммунных клеток организма-хозяина (TLR, FAS, Tap1/2 и др.), об этнических различиях в распространенности аллелей и гаплотипов HLA [29‒31]. Совокупность этих факторов обусловливает этнические и, как следствие, географические различия в распознавании В- и Т-клеточных эпитопов. Однонуклеотидные замены в геноме ВПЧ, в том числе несинонимичные, происходят случайным образом. Однако, если АК-замена затрагивает структуру эпитопа, то это может нарушить распознавание соответствующего антигена иммунными клетками, что приводит к ускользанию вируса-мутанта от иммунного ответа хозяина. Конечно, такой вирус получает преимущества над родительским и продолжает циркуляцию в этой популяции, вытесняя другие штаммы. Так, по результатам биоинформатического анализа J. He и др. [25] выявили, что замены R17G, D32N, D32E, H85Y и L90V в белке E6 затрагивают Т-клеточные эпитопы, а это означает появление новых эпитопов или изменение аффинности связывания молекулами HLA [25]. К высокоиммуногенной относится область E14‒I34 а. о. онкобелка E6 [32]. Экспериментально показано, что замены в позиции 17 белка E6 влияют на распознавание Т-клеточного эпитопа молекулой HLA-B7 [33]. Достоверно большее число АК-замен в иммуногенных областях E14‒I34 и L45‒A68 у пациентов с инвазивной цервикальной карциномой по сравнению с пациентами с раком in situ считают отражением факта ухода вируса от иммунного ответа/эпитопного дрейфа, вызывающего потерю организмом контроля за его репликацией [32]. Такого рода замены могут носить сочетанный характер. Так, для гемагглютинина вируса гриппа А выявлено сочетанное изменение аминокислотных остатков на поверхности белка в В-клеточных эпитопах или вблизи, что определяет ускользание вируса от иммунного ответа хозяина [34].

Учитывая различную частоту встречаемости АК-замен в географических популяциях, выявленную филогенетическим анализом их реверсию, а также тот факт, что наиболее частые АК-замены E6 ВПЧ затрагивали структуры эпитопов, мы пришли к выводу, что распознавание вирусного антигена клетками иммунной системы хозяина ‒ один из ключевых факторов в закреплении новой мутации или, наоборот, элиминации мутировавшего варианта вируса из данного региона.

Изменчивость вирусов и ее направленность, особенно при хронических инфекциях, – результат действия многих факторов. Случайные нуклеотидные замены в геноме вируса, вызванные ошибками в работе вирусной полимеразы, приводят к мутациям в белках, влияя на их функционирование и, в итоге, на преобладание определенных вариантов вируса [35]. Однако не только репликативная активность и эффективность сборки вирионов определяют успешное распространение определенных вариантов вирусов. Давление со стороны иммунной системы хозяина относится к важнейшим факторам, определяющим эволюцию вирусов, так как АК-замены в В- и Т-клеточных эпитопах вирусных белков позволяют мутантному варианту ускользать от иммунного ответа. Так, A. Kumar и др. [36] продемонстрировали важность 16‒60 и 76‒94 а. о. белка E6 ввиду их влияния на иммуногенность вируса, так как эти области содержат большинство известных эпитопов. Иммунное давление зависит от представленности в популяции организма-хозяина некоторых иммунных гаплотипов, которые и определяют различия в генетике человека, в том числе из разных этносов. Именно поэтому в результате коэволюции вирусного патогена и человека в определенных этнических группах преобладают разные варианты одного и того же вируса, несущие те или иные АК-замены в иммуногенных эпитопах. Ранее мы выдвигали гипотезу разнонаправленной эволюции вируса гепатита С в 7 этнически разных популяциях под действием различного иммунного давления [28, 37]. Адаптация вирусов к HLA-ассоциированному иммунному давлению описана для других вирусов, включая ВИЧ-1 [38] и вирус гепатита В [39].

В результате проведенного филогенетического анализа гена E6 продемонстрировано четкое распределение АК-замен в кодируемом белке по популяциям, что подтверждает кластеризацию нуклеотидных последовательностей по географическому признаку. Ускользание ВПЧ16 от иммунного давления, приводящее к разнонаправленной эволюции вируса в разных этносах (то есть направление эволюции определяется преобладающими в популяции иммунными гаплотипами), до сих пор описано не было. Этноспецифические особенности иммунного ответа на ВПЧ и его адаптивную изменчивость ‒ тема дальнейших исследований.

В результате проведенного анализа нами идентифицирован общий предок ВПЧ16 ‒ вирус американского происхождения. Однако остался нерешенным ряд вопросов:

• ‒ образовавшиеся варианты ВПЧ16 перешли из Америки в другие регионы и сформировали там очаги или американские штаммы приобрели те же “региональные” нуклеотидные замены, потому что попали в те же этнические группы, что в Африке и в Азии;
• ‒ связано ли появление в Америке этноспецифических вариантов ВПЧ16 (по белкам E6 и E7) с массовой миграцией в конце XIX‒начале XX вв.

Ограниченность выборки нуклеотидных последовательностей по времени (самые ранние образцы были собраны в конце 1980 гг.) не позволяет ответить на эти вопросы, что определяет необходимость дальнейшего изучения этой темы.

К существенным ограничениям для экстраполяции полученных данных на популяции всех описанных географических регионов относится недостаточный охват секвенированием генома ВПЧ16, поэтому спектр идентифицированных АК-замен и реконструкция их географического распространения носит мозаичный характер. В дальнейших исследованиях мы планируем охватить секвенированием гены E6 и E7 изолятов ВПЧ16, циркулирующих на европейской и азиатской территориях Российской Федерации, а также провести полногеномный анализ этих штаммов, что позволит подтвердить или опровергнуть результаты, полученные на фрагментах генома (гены E6 и E7).

Нами продемонстрировано, что циркулирующие штаммы ВПЧ16 имеют общего предка, который, попав в разные географические регионы, эволюционировал по-разному, что подтверждено различным спектром АК-замен в белке E6 в разных популяциях. Мы считаем, что различия в паттернах мутаций обусловлены этноспецифическими особенностями иммунного ответа. Полученные результаты могут быть использованы при надзоре за распространением ВПЧ-инфекции, разработке диагностических тест-систем, а также вакцин против ВПЧ-ассоциированных онкологических заболеваний.

 

Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

E. Zelenova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

编辑信件的主要联系方式.
Email: zelenovayeye@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 119991; Moscow, 115478

A. Karlsen

Peoples’ Friendship University of Russia; Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: zelenovayeye@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 117198; Moscow, 105064

D. Avdoshina

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Drugs, Russian Academy of Sciences

Email: zelenovayeye@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 117218

K. Kyuregyan

Peoples’ Friendship University of Russia; Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: zelenovayeye@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 117198; Moscow, 105064

M. Belikova

Peoples’ Friendship University of Russia; Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Drugs, Russian Academy of Sciences; National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N. F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: zelenovayeye@gmail.com
俄罗斯联邦, Moscow, 117198; Moscow, 117218; Moscow, 123098

参考

补充文件